制备液相色谱技术（LCMS）课件

高效高效制备液相色谱技术制备液相色谱技术高效制备液相色谱技术1高效高效制备液相制备液相色谱色谱的原理：的原理：色色谱谱分分离离原原理理无无论论是是分分析析型型色色谱谱还还是是制制备备型型色色谱谱都都是是相相同同的的，那就是那就是色谱理论色谱理论色谱理论色谱理论。但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。分析型色谱：分离度高，灵敏度高分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的，以含量测定为目的。制备型色谱：制备型色谱：要求要求纯度、产量纯度、产量和和收益。收益。高效制备液相色谱的原理：色谱分离原理无论是分2 经典的制备经典的制备色谱色谱方法与方法与高效高效制备液相制备液相色谱色谱的异同及的异同及优缺点：优缺点：相同：目的相同；某些方法原理也相同。相同：目的相同；某些方法原理也相同。不同：自动化程度不同，效率不同，分离复杂化不同：自动化程度不同，效率不同，分离复杂化合物的能力不同。合物的能力不同。经典制备经典制备色谱色谱方法：柱方法：柱色谱、色谱、薄层薄层色谱色谱 经典的制备色谱方法与高效制备液相色谱的异同及3制备液相色谱技术（LCMS）课件4制备液相色谱技术（LCMS）课件5制备液相色谱技术（LCMS）课件6高效高效制备液相制备液相色谱色谱优点：效率高，收率相对较高，特别适合复杂样品、优点：效率高，收率相对较高，特别适合复杂样品、性质接近化合物的纯化。纯化效果理想。性质接近化合物的纯化。纯化效果理想。缺点：设备复杂昂贵，投资大，运行费用较高。缺点：设备复杂昂贵，投资大，运行费用较高。经典制备经典制备色谱色谱方法方法优点：优点：设备简单，投资小，见效快。能满足一般样设备简单，投资小，见效快。能满足一般样品的品的 纯化要求。纯化要求。缺点：缺点：效率低下，收率低，对于过于复杂的化合物，效率低下，收率低，对于过于复杂的化合物，纯化效果不理想。纯化效果不理想。高效制备液相色谱经典制备色谱方法7 制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效率制备纯化合物最有力的方法，广泛应用于：率制备纯化合物最有力的方法，广泛应用于：1.天然产物的分离与纯化天然产物的分离与纯化 2.合成药物的纯化合成药物的纯化 3.合成合成反应反应中间产物或中间产物或副产物的制备副产物的制备 4.手性药物的分离与纯化手性药物的分离与纯化 5.药物杂质的分离药物杂质的分离制备制备 .制备液相色谱又称纯化系统，是目前高效率制备纯8制备液相色谱技术（LCMS）课件9重复性重复性重复性10选择性要求选择性要求选择性要求11色谱柱吸附等温线色谱柱吸附等温线正常载荷正常载荷(loading)：色谱柱吸附等温线正常载荷(loading)：12色谱柱吸附等温线色谱柱吸附等温线超载超载(overloading)：色谱柱吸附等温线超载(overloading)：13纯度（纯度（purity)、产量（、产量（throughput）和收益（和收益（yield）（）（PTY）三者的关系）三者的关系纯度（purity)、产量（throughput）14浓度过载和体积过载浓度过载和体积过载浓度过载和体积过载15浓度过载和体积过载色谱示意图浓度过载和体积过载色谱示意图浓度过载和体积过载色谱示意图16什么时候使用浓度过载什么时候使用浓度过载?什么时候使用体积过载什么时候使用体积过载?一一 般般 情情 况况 下下，由由 于于 需需 要要 有有 较较 大大 的的throughput，所所以以浓浓度度过过载载使使用用较较多多，但但当当样样品品浓浓度度过过稀稀，又又没没有有合合适适的的方方法法浓浓缩缩时时或或流流动动相相溶溶解解样样品品的的能能力力较较弱弱时时，这这时时就就应应当当使使用体积过载。用体积过载。什么时候使用浓度过载?一般情况下，由于需要有较17由分析型由分析型色谱如何色谱如何扩展到制备型扩展到制备型色谱？色谱？扩展计算扩展计算由分析型色谱如何扩展到制备型色谱？扩展计算18扩展计算扩展计算扩展计算19扩展计算举例扩展计算举例r1=1.5mm,r2=10.6mm,V1=0.6mL/min V2=?计算结果：计算结果：30mL/min扩展计算举例r1=1.5mm,r2=10.6mm,V120=30ml/min扩展计算举例扩展计算举例?计算结果计算结果25mg=30ml/min扩展计算举例?计算结果25mg210.35mL/min流速下的色谱图流速下的色谱图（分析型）（分析型）0.35mL/min流速下的色谱图（分析型）22经经扩展扩展计算，采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图计算，采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图经扩展计算，采用不同的柱径、进样量和流速样品的色谱图23上述五种色谱状态的参数：上述五种色谱状态的参数：上述五种色谱状态的参数：24在分析型色谱柱上，不同进样量的色谱图在分析型色谱柱上，不同进样量的色谱图在分析型色谱柱上，不同进样量的色谱图25在制备型色谱柱上的色谱图在制备型色谱柱上的色谱图在制备型色谱柱上的色谱图26制备液相馏分收集的三种方式制备液相馏分收集的三种方式1.基于时间（基于时间（Time-based）2.基于峰（基于峰（peak-based）3.基于质量（基于质量（Mass-based）制备液相馏分收集的三种方式1.基于时间（Time-base27基于时间（基于时间（Time-based）根根据据馏馏分分的的保保留留时时间间及及其其色色谱谱峰峰宽宽，以时间作为馏分收集器动作的指令参数。以时间作为馏分收集器动作的指令参数。特点：特点：参数设置方便，样品收益高、损失少。参数设置方便，样品收益高、损失少。色色谱谱保保留留时时间间的的不不稳稳定定会会影影响响到到馏馏分分的的纯度和收益。纯度和收益。基于时间（Time-based）根据馏分的保28Time-based用峰的时间分割，按峰收集馏分用峰的时间分割，按峰收集馏分 色色谱谱峰峰重重叠叠严严重重，重重叠叠面面积积很很大大，收收集集到到的的两两个个馏馏分分将将明明显显不不纯纯。这这时时应应考考虑虑使使用用Time-based。Time-based用峰的时间分割，按峰收集馏分 29Time-basedTime-based30基于峰（基于峰（Peak-based）根根据据色色谱谱峰峰的的正正负负斜斜率率，触触发发馏馏分分收收集集器器，以以色色谱谱峰峰正正负负斜斜率率作作为为馏馏分分收收集集器器动动作作的的指指令令参数。参数。特点：特点：馏分纯度高。馏分纯度高。馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的馏分保留时间的不稳定不会影响到馏分的纯度。纯度。参数设置不方便（斜率参数需计算）；受参数设置不方便（斜率参数需计算）；受色谱峰峰形改变的影响较大。色谱峰峰形改变的影响较大。样品收益低。样品收益低。基于峰（Peak-based）根据色谱峰的正31 利用正、负斜率按峰进行馏分收集。利用正、负斜率按峰进行馏分收集。Peak-based 正、负斜率和阈值可预先设置。正、负斜率和阈值可预先设置。正、负斜率和阈值可预先设置。正、负斜率和阈值可预先设置。当当当当色色色色谱谱谱谱信信信信号号号号都都都都超超超超出出出出预预预预先先先先设设设设置置置置的的的的正正正正斜斜斜斜率率率率和和和和阈阈阈阈值值值值两两两两个参数时，将触发峰的收集个参数时，将触发峰的收集个参数时，将触发峰的收集个参数时，将触发峰的收集信号信号信号信号；当当当当色色色色谱谱谱谱信信信信号号号号低低低低于于于于阈阈阈阈值值值值或或或或低低低低于于于于预预预预先先先先设设设设置置置置的的的的负负负负斜斜斜斜率率率率时，将触发停止收集时，将触发停止收集时，将触发停止收集时，将触发停止收集信号信号信号信号。设置阈值的目的是为了消除噪声的影响。设置阈值的目的是为了消除噪声的影响。利用正、负斜率按峰进行馏分收集。Peak-based32制备液相色谱技术（LCMS）课件33Peak-basedPeak-based实例实例（只收集后面这一组分）（只收集后面这一组分）Peak-based实例（只收集后面这一组分）34基于质量（基于质量（Mass-based）根根据据馏馏分分的的质质量量作作为为指指令令参参数数，触触发发馏馏分收集器。分收集器。特点：特点：馏分纯度高、且收益高；馏分纯度高、且收益高；馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会影响到馏分的纯度；影响到馏分的纯度；参数设置方便；参数设置方便；需配备需配备MS检测器，设备检测器，设备费用费用投入较大。投入较大。基于质量（Mass-based）根据馏分的质35Mass-based 当当使使用用按按质质量量进进行行馏馏分分收收集集时时，只只有有当当MSD检检测测到到色色谱谱峰峰含含有有目目标标质质量量数数，且且该该目目标标质质量量数数的的强强度度超超出出特特定定的的阈阈值值时时，馏馏分分收收集集才才被被触触发发。这这就就确确保保了了在在每每次次进进样样中中只只收收集集含含目目标标化化合合物物的的馏馏分分。大大部部分分情情况况下下只只有有一个馏分。一个馏分。不不足足之之处处是是注注入入的的其其他他样样品品组组分分不不能能回回收。收。Mass-based 当使用按质量进行馏分收集36按质量数进行馏分收集的结果按质量数进行馏分收集的结果按质量数进行馏分收集的结果37三种馏分收集方式的比较三种馏分收集方式的比较三种馏分收集方式的比较38它们与纯度、产量和收益（它们与纯度、产量和收益（PTY）的关）的关系怎样？系怎样？结合实际需求合理选择结合实际需求合理选择。三种馏分收集方式如何选择？三种馏分收集方式如何选择？它们与纯度、产量和收益（PTY）的关系怎样？结合实际需求合理39制备液相色谱技术（LCMS）课件40制备液相色谱技术（LCMS）课件41制备液相色谱技术（LCMS）课件42制备液相色谱技术（LCMS）课件43制备液相色谱技术（LCMS）课件44高效高效制备液相制备液相色谱色谱流路示意图流路示意图高效制备液相色谱流路示意图451、延迟体积校正、延迟体积校正2、扩散影响、扩散影响两个问题：两个问题：1、延迟体积校正2、扩散影响两个问题：46什么是延迟体积？什么是延迟体积？理理想想情情况况下下，当当检检测测器器检检测测到到组组分分信信号号时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。时，同一时刻，组分也被馏分收集器收集到。实实际际情情况况下下，这这是是做做不不到到的的，因因为为存存在在一个延迟体积。一个延迟体积。延延迟迟体体积积：检检测测池池到到馏馏分分收收集集器器之之间间管管路的体积。路的体积。什么是延迟体积？理想情况下，当检测器检测到47高效高效制备液相制备液相色谱色谱流路示意图流路示意图高效制备液相色谱流路示意图48延迟体积校正延迟体积校正 后后运运行行时时间间：是是指指分分析析物物组组分分从从检检测测池池到到馏分收集器所用的时间。馏分收集器所用的时间。为为了了准准确确地地触触发发馏馏分分收收集集器器的的启启动动和和停停止止，必必须须测测定定后后运运行行时时间间。后后运运行行时时间间可可以以转转换换成成与流速无关的延迟体积。与流速无关的延迟体积。后运行时间测定方法之一：后运行时间测定方法之一：通通过过在在流流路路内内注注射射一一种种染染料料，当当馏馏分分收收集集器针尖出现该染料时记录时间。器针尖出现该染料时记录时间。后运行时间后运行时间t馏分收集器馏分收集器-t检测器检测器延迟体积校正 后运行时间：是指分析物组分从检测49 后运行时间测定方法之二：后运行时间测定方法之二：在馏分收集器内装入一个检测器，该检在馏分收集器内装入一个检测器，该检测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流路，两个检测器都记录信号。两个检测器之路，两个检测器都记录信号。两个检测器之间的时间差就是后运行时间。间的时间差就是后运行时间。根据校正时所用的流速，系统将自动计根据校正时所用的流速，系统将自动计算出准确的延迟体积，并保存，同时也能计算出准确的延迟体积，并保存，同时也能计算出每个流速下的后运行时间，当流速改变算出每个流速下的后运行时间，当流速改变时，不需要再校正后运行时间。时，不需要再校正后运行时间。后运行时间测定方法之二：50扩散扩散 扩散使峰（谱带）变宽扩散使峰（谱带）变宽，严重削弱了，严重削弱了色谱的分辨（分离）能力。色谱的分辨（分离）能力。谱带变宽与流速成反比，与管线长度和谱带变宽与流速成反比，与管线长度和管线内径成正比。管线内径成正比。扩散 扩散使峰（谱带）变宽，严重削弱了色谱的51三种不同管径的扩散影响三种不同管径的扩散影响 所以，制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度，减所以，制备液相色谱中更应注意缩短管路的长度，减少不必要的死体积。少不必要的死体积。三种不同管径的扩散影响 所以，制备液相色谱中更52各种类型的制备液相展示各种类型的制备液相展示各种类型的制备液相展示53制备液相色谱技术（LCMS）课件54制备液相色谱技术（LCMS）课件55制备液相色谱技术（LCMS）课件56制备液相色谱技术（LCMS）课件57制备液相色谱技术（LCMS）课件58应用实例应用实例：应用实例：59制备液相色谱技术（LCMS）课件60制备液相色谱技术（LCMS）课件61人参皂甙人参皂甙Re、Rg1的的HPLC制备制备人参皂甙Re、Rg1的HPLC制备62制备液相色谱技术（LCMS）课件63制备液相色谱技术（LCMS）课件64制备液相色谱技术（LCMS）课件65制备液相色谱技术（LCMS）课件66制备液相色谱技术（LCMS）课件67结束结束68