串联质谱与新生儿遗传代谢病筛查

深圳市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心 文伟串联质谱串联质谱与新生儿遗传代谢性疾病筛查与新生儿遗传代谢性疾病筛查 新生儿筛查血标本新生儿筛查n新生儿群体n使用快速、简便、敏感的检验方法n检验危及生命、生长发育的先天、遗传性疾病n尚未出现疾病表现，但体内生化、代谢已发生改变n早诊断、早预防、早治疗历史n1961年Guthrie 细菌抑制法半定量测定苯丙氨酸n干血滤纸片法血样采集技术n1962年在美国筛查PKUn1975年日本干血滤纸片测定TSH筛查甲低n迅速在欧美等国家普遍开展历史n筛查技术的发展，使可筛查的疾病越来越多n1982年东京第二届国际新生儿筛查大会提出四种疾病nPKU CH GAL CAHnG6PD BD SCD CF 选择筛查疾病的原则n危害严重，可致残或致死，已构成公共卫生问题n有一定发病率，在人群中相对常见或流行n疾病早期无特殊症状，但有实验室指标阳性n有可靠，适合大规模进行的筛查方法，易于家长接受n费用低廉。筛查、诊治费用低于发病后诊治费用。遗传代谢病（inborn errors of metabolism,IEM）n遗传性生化代谢缺陷n由于基因突变导致与代谢有关的酶或转运蛋白缺陷，使代谢通路受阻致病。IEM发病机制 先天性酶缺陷或转运蛋白缺陷A B C 产物缺乏 底物过多 D 毒性旁路代谢产物遗传代谢病的特点n基因突变n目前已发现有500余种疾病n80%属于常染色体隐性遗传n单病发病率低，群体发病率高n表现非特异性，有赖遗传学或生化方法确诊n儿科、血液科、神经科、骨科等不同科室就诊遗传代谢病的危害n神经系统损害：几乎所有遗传代谢病都有不同程度神经系统正症状:智力运动落后；惊厥；意识障碍；精神行为异常n代谢紊乱：低血糖，酸中毒，高乳酸血症，高氨血症等n消化系统：喂养困难，呕吐，肝功能不全，肝肿大，胆汁淤积等n肌肉及其他脏器：肌张力低下，心肌、肾脏受损等。n皮肤、毛发异常：毛发黄，湿疹，口角糜烂及脱发等。n容貌及五官畸形：n特殊气味：尿带甜味，汗脚味，鼠尿味，猫尿味。血片递送 筛查化验 召回确诊治疗、随访 分娩、采血 筛查的步骤筛查的步骤预防出生缺陷 提高人口素质n一级预防：避免常见、重大出生缺陷和残疾发生n二级预防：减少出生缺陷和残疾胎儿出生n三级预防：新生儿开展遗传代谢病的筛查诊断和治疗法律、法规n中华人民共和国母婴保健法1995年n中华人民共和国母婴保健法实施办法2001年n中国儿童发展纲要（2001-2010）n中国提高出生人口素质、减少出生缺陷和残疾行动计划（2002-2010）n新生儿疾病筛查技术规范2004年n新生儿疾病筛查管理办法2009年先天性甲状腺功能减低症（先天性甲先天性甲状腺功能减低症（先天性甲低）低）（CH）筛查情况）筛查情况n足底血片筛查TSH10mIU/L，为阳性，通知复查n酶免疫荧光法n确诊检查：TSH升高，T4降低n化学发光法:检测TSH、T3、T4n甲状腺超声n生长发育评价先天性甲低先天性甲低n全国新筛资料发病率：1：2000n根据临床表现可确诊的病例占6%n目前筛查中心确诊的病例在筛查结果出来之前，少有临床疑诊甲低。n病例：2月25出生，筛查TSH增高，3月10日回筛查中心复查，未采血，渐出现吸允慢、便秘、哭声嘶哑、反应差，肌张力低，俯卧抬头（-），笑（-）在其他医院就诊，肺炎，遗传代谢病？5月20日回筛查中心查：TSH100，TT3、TT4、FT3、FT4均降低，确诊先天性甲低，即予口服左甲状腺素片治疗，1个月复查TSH：17.71，T3、T4均正常。头竖立，会笑，俯卧抬头、肩，侧翻身。临床表现临床表现喂养困难、腹胀、便秘、脐疝、肠音弱少哭、音哑嗜睡鼻塞肢端凉、皮肤粗糙、粘液水肿黄疸前囟大、后囟未闭颅缝开大心音低、心率慢特殊面容 治疗治疗n确诊后立即口服左旋甲状腺素钠片。n一次给足剂量10 15/，每天一次 n服药2周复查血FT4、TSHn使血FT4维持在正常高值水平 nFT4、TSH恢复正常后每3月复查一次 n婴幼儿期维持药量个体化。治疗要点治疗要点n一旦确诊，立即治疗，治疗越早，效果越好n由于甲状腺发育异常或代谢异常所致，需终生治疗n不需从小剂量开始，应一次足量。n暂时性甲低高苯丙氨酸血症（HPA）n因体内苯丙氨酸浓度增高，尿中排泄大量的苯丙酮酸，故称PKUn存在多种变异型，多种引起血Phe增高的基因n病因分两类：n苯丙氨酸羟化酶缺乏（PAH缺乏）n四氢生物蝶呤缺乏（BH4缺乏）n二者治疗方法不同，早期鉴别非常重要经典型PKUnPhe1200mol/Ln苯丙氨酸羟化酶严重缺乏n白人发病率较高，北爱尔兰1：4400，黑人发病率较低n我国发病率1：11307，北方高于南方苯丙氨酸酪氨酸多巴苯丙酮酸苯乙胺苯乙酸组织蛋白苯丙氨酸羟化酶苯乳酸多巴醌多巴胺黑色素去甲肾上腺素肾上腺素 食物蛋白BH4BH2遗传学和分子生物学n常染色体隐性遗传病nPAH基因突变n父母是致病基因携带者n母亲每次生育有1/4可能为患儿n近亲结婚的子女发病率高n男女发病机会均等n基因在12号染色体上，我国发现的PAH基因突变40余种，世界范围超过440种。n出生时大多正常，部分可能有喂养困难、呕吐、易激惹n34月后渐出现精神、运动发育落后，发由黑变黄、皮肤变白、汗液和尿液有鼠尿味n随年龄增长，智力低下越来越明显、肌张力越来越高，有癫痫发作，腱反射亢进。严重者有脑瘫。n三氯化铁实验n二硝基苯肼实验n均查尿中-酮酸，因新生儿刚出生后，Phe的转氨作用不明显，不能形成苯丙酮酸，尿筛查不适应新生儿筛查。至少4周以上可用。n尿中苯丙酮酸不稳定，尿排出后很快消失，尿放置久，假阴性。n特异性差，枫糖尿症、酪氨酸血症尿中有-酮酸类物，也可出现变色反应。药物：水杨酸等。尿液检验尿液检验PKU筛查：血苯丙氨酸测定nPKU是第一个通过筛查早确诊、早期给予有效治疗从而改变预后的遗传代谢病n症状前诊断n荧光分析法n干血滤纸片n苯丙氨酸（Phe）含量测定nPhe2mg/ml(120mol/l)n饮食治疗，控制血中苯丙氨酸浓度n富含苯丙氨酸的食物：鱼、肉、蛋奶n蔬菜、水果n不含苯丙氨酸奶粉、蛋白粉BH4缺乏症的鉴别及治疗n尿液蝶呤分析nBH4负荷试验n特异酶的测定n治疗：BH4、L-DOPA 、5-羟色氨酸（5-HTP）联合治疗。半乳糖血症筛查n半乳糖代谢酶缺乏n肝肾损害 智力低下 白内障n干血滤纸片nT-GAL(总半乳糖)12MG/L召回复查n复查异常者肝肾功能，血糖，眼检查n治疗：去除乳糖乳类、豆浆G6PD缺乏症筛查n纯化学反应荧光法筛查G6PD活性n定性、定量筛查nG6PD活性定量测定或G6PD/6PGD比值法n影响因素：贫血、溶血、感染、输血，3个月后复查。G6PD临床资料n性别n临床表现：黄疸（高胆红素血症、黄疸消退延迟）、贫血、肝脾肿大、核黄疸n无临床表现n诱因：先天性肾上腺皮质增生症（CAH）筛查n发病率1:13000n常染色体隐性遗传n肾上腺皮质类固醇激素合成酶缺乏n皮质醇、醛固酮合成障碍n反馈性ACTH分泌增加，肾上腺皮质增生酶缺陷n类固醇生成急性调控蛋白n3-羟类固醇脱氢酶缺乏n17-羟化酶缺乏症n21-羟化酶缺乏症羟化酶缺乏症n11-羟化酶缺乏症n18-羟化酶缺乏症n17-羟孕酮（17-OHP）n21-羟化酶缺乏症nACTHn睾酮n血皮质醇n醛固酮（ALDO）n危象期有低钠、低氯、高钾、代谢性酸中毒n染色体核型分析21-羟化酶缺乏症临床特征 失盐型 单纯男性化型 非经典型酶活性 0-2%2-11%20-50%发生率 75%25%1-2%吐泻、脱水、休克 女性：阴蒂肥大 多毛 、性毛早现 低血钠、高血钾 阴蒂融合 月经紊乱 代谢性酸中毒 男性：阴茎增大 生长加速、骨龄超前 雄激素增高体征 最终矮小 皮肤素色沉者 痤疮、性毛早现 CAH筛查n2010年1-12月筛查量：157761，确诊数8例。n男3例，女5例。足月，出生体重：2.53.8Kg。n皮肤：6例肤色黑，2例皮肤弹性差、脱水貌n失盐症状:3例召回时呕吐、哺乳差、大便次多、消瘦。1例血钠低、血钾高，曾外院治疗n性征异常：5例女婴阴蒂肥大，其中2例出生时性别判断不清，做染色体分析。3例男婴阴茎较长，阴囊大，色素沉着。n治疗：5例口服氢化考的松，3例加氟氰可的松。串联质谱筛查遗传代谢病 串联质谱n1990年 美国的Duke University的Dr.Millington首次提出n一张血片，2-3分钟时间，筛查20-30种疾病，开创新纪元n已成为遗传代谢病临床诊断的常规检测工具n筛查的疾病谱改变 串联质谱n将被测定的物质电离成质荷比不同的带电粒子，并在空间和时间上产生分离n根据质谱图和离子峰强度对被测物进行鉴定和定量分析n可在2分钟内通过检测血液中氨基酸和酰基肉碱水平的异常，快速检测40余种遗传代谢紊乱疾病串联质谱开展情况n美国、一些欧洲国家、加拿大、美国、澳大利亚、韩国、卡塔尔等国已使用串联质谱技术扩大了新生儿疾病筛查的种类n台湾、国内杭州、上海、广州开展了串联质谱项目n扩展遗传代谢病的筛查。包括氨基酸代谢病、脂肪酸代谢病和有机酸代谢病。n部分替代传统筛查方法如PKU 新生儿串联质谱筛查n上海新华医院2003年-2010年串联质谱筛查36万新生儿n确诊遗传代谢病15种，发病率1:3242n氨基酸代谢病：7种，52.7%n有机酸血症：5种，25.9%n脂肪酸氧化障碍：3种，21.4%串联质谱可检测的氨基酸代谢病n高苯丙氨酸血症(PKU)n枫糖尿症(MSUD)n氨甲酰磷酸合成酶缺乏症(CPS)n鸟氨酸氨甲酰磷酸合成酶缺乏症(OTC)n瓜氨酸血症型、型（Citrin缺陷病）（NICDD）n精氨琥珀酸尿症（ASA）n精氨酸血症（ARG）n高胱氨酸血症（HCU）n高鸟氨酸血症、高氨血症、同型瓜氨酸尿症综合征（HHH）n同型半胱氨酸尿症n高甲硫氨酸血症（Hmet）n酪氨酸血症型、型、型n非酮性高甘氨酸血症（NKG）串联质谱检测的有机酸血症n甲基丙二酸血症（MMA）n丙酸血症（PA）n异戊酸血症（IVA）n戊二酸血症、型（GA-、GA-）n三甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（3-MCC）n3-羟基，3-甲基戊二酸血症（3-HMC）n多种羧化酶缺乏症（HCSD）n已基丙二酸血症（EMA）n丙二酸血症（MA）n异丁酰辅酶脱氢酶缺乏症（IBCD）n酮基硫解酶缺乏症（BKT）串联质谱检测的脂肪酸代谢疾病n极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（VLCAD）n长链羟化酶酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（LCHAD）n中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（MCAD）n短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（SCAD）n线粒体三功能蛋白缺乏症（TFP）n肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、型（CPT-、）n肉碱转运障碍（CTD）n肉碱、酰基肉碱移位酶缺乏症（CACT）例1n足月产，出生体重3Kg,生后逐渐出现吸允无力，反应差，肌张力低、偶有肢体抖动n串联质谱结果：Phe,Tyr,Phe/Tyr:55.08(0.2-2)n诊断：高苯丙氨酸血症nBH4缺乏症例2n5月女孩，发育落后，多家医院门诊就诊，外地出生，是否做新生儿筛查不详。n串联质谱nPhe,Tyr正常,Phe/Tyr:8.35(0.5-2)n高苯丙氨酸血症例3n贵州出生n生后筛查PKU可疑，电话、短信通知n其他医院：ALT、AST 及血氨偏高n尿三氯化铁实验正常nMS/MSnPhe,Tyr正常,Phe/Tyr:n高苯丙氨酸血症Citrin缺乏症（NICCD）nCitrin缺乏导致新生儿肝内胆汁淤积n黄疸n肝大n胖圆脸n低蛋白、低血糖、贫血、凝血功能异常nAFP增高诊断n临床症状和实验室检查n早期对患儿行血串联质谱检测可以成为NICCD早期诊断的关键指标n瓜氨酸增高n伴有甲硫氨酸、酪氨酸、苏氨酸增高n支链氨基酸降低n新生儿串联质谱筛查可以实现症状前诊断甲基丙二酸血症n由于甲基丙二酸变位酶活性降低，导致甲基丙二酸体内蓄积。n神经症状：急性脑病症状、生后数小时或一周发病、嗜睡、昏迷甚至死亡n晚期发病：生后数月发病n间歇性发病临床表现n运动发育落后n智力低下n抽搐、癫痫样发作n生长发育障碍n肝肾损伤n血液系统异常n精神、行为异常实验室检查n血常规：HB、WBC、PLT减少n尿常规：酮体阳性n血气分析：PH、HCO2下降n低血糖、乳酸、血氨增高n电解质紊乱n肝肾功异常 诊断诊断n实验室生化检查nMS/MSnC3nC3/C0nC3/C2n尿有机酸分析脂肪酸氧化代谢障碍n脂肪酸在线粒体内氧化代谢受阻所致n氧化代谢的酶缺乏所致n肝脏：肝大、转氨酶高、低血糖、高血氨、高尿酸、嗜睡、昏迷n急慢性肥厚或扩张性心肌病、心力衰竭n肌张力低下、运动不耐受、横纹肌溶解n低血糖、高血氨、高尿酸、AST ALT CK增高、n原发性肉碱缺乏症nMS/MS:C0，多种酰基肉碱n中链脂酰辅酶A脱氢酶缺乏症nMS/MS:C8,C8/C10串联质谱仪串联质谱检测的适应症n新生儿群体筛查n儿科、新生儿科治疗的重症病儿n既往有不良分娩史的母亲所分娩的新生儿n嗜睡、惊厥、反复呕吐、营养不良、发育落后、肝脾大、代谢性酸中毒、低血糖、水电解质紊乱肝功异常、血氨高的儿童n面容特殊、发育异常 干血滤纸片标本采集干血滤纸片标本采集（新生儿筛查、串联质谱）（新生儿筛查、串联质谱）n75%酒精消毒皮肤n一次性采血针穿刺，第一滴血拭去，取第二滴血n滤纸片接触血滴，切勿接触皮肤，使血自然渗透至滤纸背面，至少采集三个血滴。n血片置空气中，自然晾干呈深褐色n装密实袋中，保存在2-8冰箱内n递送到筛查中心苯丙酮尿症的串联质谱分析诊断正常新生儿串联质谱分析总结n开展新生儿筛查，预防出生缺陷n新生儿出生3天采血n国家规定筛查两种病：先天性甲低、PKUn深圳筛查五种病：半乳糖血症、G6PD缺乏症、先天性肾上腺皮质增生症n确诊后立即治疗n终生治疗n串联质谱扩大新生儿疾病筛查疾病谱n筛查病种扩大