中药制剂的卫生学检查

第四章 中药制剂的卫生学检查 第四章中药制剂的卫生学检查 微生物限度检查法活螨检查法热原检查法中药制剂中药制剂中药制剂中药制剂的卫生学的卫生学的卫生学的卫生学检查检查检查检查 无菌检查法 概述细菌内毒素检查法第四章中药制剂的卫生学检查概述概述第四章中药制剂的卫生学检查 概述一、细菌一、细菌第四章中药制剂的卫生学检查第四章中药制剂的卫生学检查微生物按其微生物按其形态分为形态分为 概述概述球菌球菌杆菌杆菌螺形菌螺形菌真核细胞型真核细胞型 如真菌如真菌原核细胞型原核细胞型 如细菌如细菌非细胞型非细胞型 如病毒如病毒微生物按其微生物按其结构特点结构特点第四章中药制剂的卫生学检查第四章中药制剂的卫生学检查细菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞细菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞细胞核细胞核细菌的形态学检查：涂片、干燥、固定、细菌的形态学检查：涂片、干燥、固定、染色染色 概述概述细菌的生长繁殖条件细菌的生长繁殖条件充足的营养：水、无机盐、碳源、氮源、充足的营养：水、无机盐、碳源、氮源、生长因子。生长因子。适宜的酸碱度：一般为适宜的酸碱度：一般为pH7.2pH7.27.67.6；另外；另外：霍乱弧菌为：霍乱弧菌为pH8.4pH8.49.29.2；乳酸杆菌为；乳酸杆菌为5.05.0左右。左右。适宜的温度适宜的温度必要的气体环境。必要的气体环境。细菌的繁殖方式与速度细菌的繁殖方式与速度繁殖方式：二分裂法繁殖方式：二分裂法繁殖分为四个时期：迟缓期、对数生长期繁殖分为四个时期：迟缓期、对数生长期、稳定期、衰退期、稳定期、衰退期细菌的代谢产物细菌的代谢产物毒素毒素：细菌能产生对机体有害的毒素。内毒：细菌能产生对机体有害的毒素。内毒素由素由G G-菌产生，外毒素多由菌产生，外毒素多由G G+菌产生，但少数菌产生，但少数G G-菌也能产生外毒素。菌也能产生外毒素。侵袭性酶侵袭性酶：某些细菌能产生侵袭性酶，损伤：某些细菌能产生侵袭性酶，损伤机体组织，如金葡球菌产生的血浆凝固酶等。机体组织，如金葡球菌产生的血浆凝固酶等。热原质热原质：许多：许多G G-杆菌及少数杆菌及少数G G+杆菌，能产生一种耐热物质，注入人体或动杆菌，能产生一种耐热物质，注入人体或动物体内可致发热反应，称为热原质。特点：物体内可致发热反应，称为热原质。特点：耐高温，一般的高压蒸气灭菌法不易破坏。耐高温，一般的高压蒸气灭菌法不易破坏。可用蒸馏、吸附、滤过等方法除去液体中的可用蒸馏、吸附、滤过等方法除去液体中的大部分热原质。大部分热原质。细菌的代谢产物细菌的代谢产物色素色素：许多细菌在一定条件下产生色素，如：许多细菌在一定条件下产生色素，如金葡菌、绿脓杆菌等，可用以鉴别细菌。金葡菌、绿脓杆菌等，可用以鉴别细菌。抗生素：指某些微生物在代谢过程中产生的抗生素：指某些微生物在代谢过程中产生的，能选择性掏和杀灭它种生物细胞的代谢产，能选择性掏和杀灭它种生物细胞的代谢产物。物。细菌素细菌素：某些细菌能产生一类具有抗菌作用：某些细菌能产生一类具有抗菌作用的蛋白质，其抗菌范围狭窄，仅对近缘细菌的蛋白质，其抗菌范围狭窄，仅对近缘细菌有抗菌作用，主要用于细菌的分裂和流行病有抗菌作用，主要用于细菌的分裂和流行病学调查。学调查。分解代谢产物分解代谢产物糖代谢产物：糖代谢产物：主要有酸类（甲酸、乙酸和乳酸）、醇类（乙醇主要有酸类（甲酸、乙酸和乳酸）、醇类（乙醇、丁醇、乙酰甲基甲醇等）、酮类和气体（二氧、丁醇、乙酰甲基甲醇等）、酮类和气体（二氧化碳、氢气）。例如大肠埃希菌能分解乳糖和葡化碳、氢气）。例如大肠埃希菌能分解乳糖和葡萄糖，产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖，产萄糖，产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖，产酸不产气。酸不产气。蛋白质代谢产物：蛋白质代谢产物：如大肠埃希菌能分解色氨酸产生靛基质；沙门菌如大肠埃希菌能分解色氨酸产生靛基质；沙门菌能分解胱氨酸等含硫氨基酸产生硫化氢气体。能分解胱氨酸等含硫氨基酸产生硫化氢气体。细菌的生理学检验细菌的生理学检验培养基的种类：基础培养基、营养培养基、培养基的种类：基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基。选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基。常用的培养基的制备程序：配料、溶化、调常用的培养基的制备程序：配料、溶化、调整整pHpH值、滤过、分装、灭菌、检定、保存等值、滤过、分装、灭菌、检定、保存等步骤。步骤。细菌的接种方法：平板曲线划线法、斜面接细菌的接种方法：平板曲线划线法、斜面接种法、倾注平板法、穿刺接种法种法、倾注平板法、穿刺接种法细菌的培养方法：一般培养法、二氧化碳培细菌的培养方法：一般培养法、二氧化碳培养法、厌氧培养法养法、厌氧培养法第四章中药制剂的卫生学检查第四章中药制剂的卫生学检查 概述概述二、真菌二、真菌真菌真菌真菌的菌落分类：真菌的菌落分类：酵母型菌落酵母型菌落酵母样菌落酵母样菌落丝状菌落丝状菌落 多细胞真菌多细胞真菌单细胞真单细胞真菌菌第四章中药制剂的卫生学检查微生物限微生物限度检查法度检查法第四章中药制剂的卫生学检查 微生物限度检查法一、染菌限度检查原则一、染菌限度检查原则微生物限度检查法微生物限度检查法染菌限度检验原则染菌限度检验原则常用稀释液、试液、指示液及培养基（自常用稀释液、试液、指示液及培养基（自学）学）细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数控制菌检查控制菌检查微生物限度标准微生物限度标准染菌限度检验原则染菌限度检验原则无菌操作室技术要求：无菌操作室技术要求：1.1.无菌操作室应为单向流空气区域，附近无菌操作室应为单向流空气区域，附近应无污染源。应无污染源。2.2.无菌操作室内环境洁净度应达到无菌操作室内环境洁净度应达到1 1万级，万级，操作台面的洁净度应达到操作台面的洁净度应达到100100级。室内温度级。室内温度应控制在应控制在252252，湿度应控制在，湿度应控制在45456060%。3.3.检验全过程应严格遵守无菌操作，防止检验全过程应严格遵守无菌操作，防止再污染。再污染。染菌限度检验原则染菌限度检验原则供试品抽样、保存及检验量供试品抽样、保存及检验量按批号随机抽样，每批取检验用量的按批号随机抽样，每批取检验用量的3 3倍量。倍量。检验量：指一次检验所需的供试品量检验量：指一次检验所需的供试品量.除另有规定外，除另有规定外，固体和半固体制剂固体和半固体制剂的检验量为的检验量为10g10g；液体制剂为液体制剂为10ml10ml；采用；采用沙门菌沙门菌的供试品，其检验的供试品，其检验量应量应增加增加10g10g或或10ml10ml。中药膜剂为中药膜剂为50cm50cm2 2(不得少于不得少于4 4片片)；染菌限度检验原则染菌限度检验原则贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减，但内服药不得低于，但内服药不得低于3g3g；外用药不得低于外用药不得低于5g5g；所用的剂量的检验量必须取自所用的剂量的检验量必须取自2 2个以上的最个以上的最小包装单位。小包装单位。取供试品检验时，应注意摇匀，以便均匀取供试品检验时，应注意摇匀，以便均匀取样。取样。染菌限度检验原则染菌限度检验原则供试液的制备供试液的制备液体供试品：取供试品液体供试品：取供试品10ml10ml，加，加pH7.0pH7.0无菌无菌氯化钠氯化钠-蛋白胨缓冲液至蛋白胨缓冲液至100ml100ml，混匀，作为，混匀，作为1 1：1010的供试液。油剂可加入适量无菌的供试液。油剂可加入适量无菌TW-80TW-80。固体、半固体或黏稠性供试品固体、半固体或黏稠性供试品：取供试品：取供试品1 10g0g，加，加pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至蛋白胨缓冲液至100ml100ml，用匀浆仪或其他适用匀浆仪或其他适宜方法混匀后宜方法混匀后，作为，作为1 1：1010的供试液。的供试液。染菌限度检验原则染菌限度检验原则非水溶性供试品非水溶性供试品:方法方法1 1：取供试品：取供试品5g5g（或（或5ml5ml），加至含溶化的（温度不），加至含溶化的（温度不超过超过4545）5g 5g 司盘司盘8080、3g3g单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、10g 10g 聚山梨酯聚山梨酯80 80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入慢慢加入4545的的pH7.0 pH7.0 无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至蛋白胨缓冲液至100ml100ml，边加边搅拌，使供试品充，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为分乳化，作为120 120 的供试液。的供试液。方法方法2 2：取供试品取供试品10g10g，加至含，加至含20ml20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入后加入4545的的pH7.0pH7.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液100ml100ml，振摇，振摇5 510 10 分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为为110 110 的供试液。的供试液。染菌限度检验原则染菌限度检验原则膜剂供试品膜剂供试品:取供试品取供试品50cm50cm2 2，剪碎，剪碎，加加50ml50ml或或100ml100ml的的pH7.0pH7.0无菌氯化无菌氯化钠钠-蛋白胨缓冲液浸泡，振摇，作为蛋白胨缓冲液浸泡，振摇，作为1 1：1010或或1 1：2020的供试液。的供试液。肠溶或结肠溶制剂的供试品：取供试品肠溶或结肠溶制剂的供试品：取供试品1010克，加克，加pH6.8pH6.8无菌磷酸盐的缓冲液（用于肠无菌磷酸盐的缓冲液（用于肠溶制剂）或溶制剂）或pH7.6pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）结肠溶制剂）至至100ml100ml，置，置454511水浴水浴中，振摇，溶解，作为中，振摇，溶解，作为1 1：1010的供试液。的供试液。染菌限度检验原则染菌限度检验原则具抑菌活性的供试品：具抑菌活性的供试品：培养基稀释法培养基稀释法 取规定量的供试液，至较大量的培养基中取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液菌数时，取同稀释级的供试液2ml2ml，每，每1ml 1ml 供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml 1ml 供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为供试液所注的平皿中生长的菌数之和即为1 1mlml的菌落数，计算每的菌落数，计算每1ml 1ml 供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。养基的用量。染菌限度检验原则染菌限度检验原则 离心沉淀法离心沉淀法 取一定量的供试液，取一定量的供试液，500 500 转转/分离心分离心3 3 分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。分钟，取全部上清液混合，用于细菌检查。薄膜过滤法薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜薄膜过滤法过滤法”。中和法中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。稀释液或培养基中。染菌限度检验原则染菌限度检验原则气雾剂、喷雾剂供试品：气雾剂、喷雾剂供试品：取规定量供试品，置冰冻室冷冻约取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释使抛射剂缓缓全部释出出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的量的pH7.0 pH7.0 无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯量的无菌聚山梨酯8080）中，混匀，取相当）中，混匀，取相当于于10g10g或或10ml 10ml 的供试品，再稀释成的供试品，再稀释成110 110 的供试液。的供试液。第四章中药制剂的卫生学检查 微生物限度检查法二、常用稀释液、试液、二、常用稀释液、试液、指示液及培养基指示液及培养基第四章中药制剂的卫生学检查第四章中药制剂的卫生学检查 微生物限度检查法微生物限度检查法三、细菌、霉菌及酵母菌计数三、细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法的验证计数方法的验证检查方法检查方法注意事项注意事项细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法的验证计数方法的验证 在建立药品微生物限度检查方法时，在建立药品微生物限度检查方法时，应进应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数测定。、霉菌及酵母菌数测定。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数菌种菌种：菌种试验用菌株的传代次数菌种试验用菌株的传代次数不得超过不得超过5 5 代代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 0 代）。代）。大肠埃希菌（大肠埃希菌（Escherichia coliEscherichia coli）金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Staphylococcus aureusaureus）枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus Bacillus subtilissubtilis）白色念珠菌（白色念珠菌（Candida Candida albicansalbicans）黑曲霉（黑曲霉（AspergillusAspergillus nigerniger）cfucfu：细菌（可见）和真菌的测量单位。：细菌（可见）和真菌的测量单位。cfu:colony-forming unit,cfu:colony-forming unit,菌落形成单位菌落形成单位，将稀，将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌量进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落）的细菌数量进行测量的单位。落）的细菌数量进行测量的单位。意思就是每毫升菌液中含有多少单细胞！意思就是每毫升菌液中含有多少单细胞！传统上就叫传统上就叫“个个”。但是，我们知道，一个菌落。但是，我们知道，一个菌落并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一并不一定是一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细菌团）所生成，这时候再叫个细菌团）所生成，这时候再叫“个个”就不太准确啦，就不太准确啦，准确的叫法就是准确的叫法就是“菌落形成单位菌落形成单位”，英文缩写，英文缩写“CFUCFU”。就像就像“公斤公斤”和和“千克千克”，只是叫法不同，数量上没有，只是叫法不同，数量上没有变化。变化。补充学习补充学习细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数菌液制备菌液制备：接种接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，培养琼脂培养基中，培养181824h24h。接种接种白色念球菌白色念球菌的新鲜培养物至改良马丁的新鲜培养物至改良马丁培养琼脂培养基中，培养培养琼脂培养基中，培养242448h48h将培养物用将培养物用0.9%0.9%无菌氯化钠溶液制成每无菌氯化钠溶液制成每1ml1ml含菌数为含菌数为5050100cfu100cfu（菌落数）。（菌落数）。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数接种接种黑曲霉黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养的新鲜培养物至改良马丁培养琼脂培养基中，培养琼脂培养基中，培养5 57 7天，加入天，加入35ml35ml的的0.9%0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液至无菌的试管中，用吸出孢子悬液至无菌的试管中，用0.9%0.9%无无菌氯化钠溶液制成每菌氯化钠溶液制成每1ml1ml含孢子数为含孢子数为5010050100cfucfu的孢子悬液。的孢子悬液。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数验证方法验证方法验证试验至少要进行验证试验至少要进行3 3次独立的平行试验，次独立的平行试验，并分别计算每次试验的回收率。并分别计算每次试验的回收率。可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。时进行。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数（1 1）试验组）试验组 平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液液1ml 1ml 和和5050100cfu 100cfu 试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备，每株试验菌平行制备2 2个平皿，按平皿法测定其个平皿，按平皿法测定其菌数。（菌数。（加样回收试验加样回收试验）薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入液中加入5050100cfu 100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。（试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。（加加样回收试验样回收试验）（2 2）菌液组）菌液组 测定所加的试验菌数。测定所加的试验菌数。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数（3 3）供试品对照组）供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。试品本底菌数。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数（4 4）稀释剂对照组）稀释剂对照组 ：若供试液制备需要分散、乳化、中和、：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。生物受影响的程度。试验时，可试验时，可用相应的稀释液替代供试品，用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml 1ml 供试液含供试液含5050100cfu100cfu，按试验组的供试液，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。制备方法和菌落计数方法测定其菌数。细菌、霉菌及酵母菌计数细菌、霉菌及酵母菌计数结果判断结果判断 ：在在3 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于的百分率）应均不低于70%70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于数的百分率）均不低于70%70%，照该供试液制备方法，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%70%，应采，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。性，并重新进行方法验证。检查方法检查方法 包括平皿法和薄膜滤过法两种，按已验证包括平皿法和薄膜滤过法两种，按已验证的方法进行供试品的细菌、霉菌与酵母菌的方法进行供试品的细菌、霉菌与酵母菌数的测定。数的测定。取按验证的方法制备的均匀供试液，用取按验证的方法制备的均匀供试液，用pH7pH7.0.0无菌氯化钠无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成蛋白胨缓冲液稀释成 1 1：1010、1 1：100100、1 1：10001000等稀释液。等稀释液。检查方法检查方法平皿法：平皿法：供试液的稀释：将各类制剂制备成供试液的稀释：将各类制剂制备成1 1：1010供供液，再将其稀释液，再将其稀释1010倍、倍、100100倍、倍、10001000倍，选倍，选择适宜的连续择适宜的连续2323个稀释级的供试液。个稀释级的供试液。倾注培养基：取供试液倾注培养基：取供试液1ml,1ml,置平皿中，注置平皿中，注入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混合或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混合均匀，凝固后，倒置培养。每稀释级每种均匀，凝固后，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制行培养基至少制行2 2个平板。个平板。阴性对照试验：用稀释液作对照实验阴性对照试验：用稀释液作对照实验检查方法检查方法培养和计数：细菌培养培养和计数：细菌培养4848小时后计数，霉小时后计数，霉菌和酵母菌培养菌和酵母菌培养7272小时后计数。点计菌落小时后计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个夹板的菌落平均数不小于两个夹板的菌落平均数不小于1515，则两个，则两个平板的菌落数不能相差平板的菌落数不能相差1 1倍或以上。倍或以上。检查方法检查方法一般营养琼脂培养基用于细菌计数；一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。计数。检查方法检查方法特殊情况：特殊情况：若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌则应分别点计霉菌红钠琼脂培养基上长有细菌则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数；然后将营养琼脂培养和酵母菌、细菌菌落数；然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。培养基测定酵母菌数，合并计数。菌数报告规则菌数报告规则细菌宜选取平均菌落数在细菌宜选取平均菌落数在3030300300之间的稀之间的稀释级释级,霉菌宜选取平均菌落数在霉菌宜选取平均菌落数在3030100100之间的稀之间的稀释级作为报告菌数计算的依据。释级作为报告菌数计算的依据。如有如有1 1个稀释级在个稀释级在3030300(30300(30100)100)之间时之间时,将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告；菌数报告规则菌数报告规则如同时有如同时有2 2个稀释级在个稀释级在3030300(30300(30100)100)之间时之间时，按下式计算两级比值。，按下式计算两级比值。比值比值 高稀释级的平均菌落数高稀释级的平均菌落数稀释倍数稀释倍数低稀释级的平均菌落数低稀释级的平均菌落数稀释倍数稀释倍数菌数报告规则菌数报告规则当比值当比值2 2时，以两稀释级的均值报告时，以两稀释级的均值报告当比值当比值2 2时，以低稀释级平均菌落数乘以时，以低稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；如同时有稀释倍数报告；如同时有3 3个稀释级的平均个稀释级的平均菌落数均在菌落数均在3030300300之间时之间时,以后以后2 2个稀释级个稀释级计算级间比值报告；计算级间比值报告；如各稀释级的平均菌落数均不在如各稀释级的平均菌落数均不在3030300300之之间，以最接近间，以最接近3030或或300300的稀释级平均菌落数的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告；乘以稀释倍数报告；菌数报告规则菌数报告规则如各稀释级平均菌落数均在如各稀释级平均菌落数均在300(100)300(100)以上，按最以上，按最高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；高稀释级菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均小于如各稀释级平均菌落数均小于3030时，一般按最低时，一般按最低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告。如当如当1:101:10（或（或1:100 1:100）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或）稀释级平均菌落数等于或大于原液（或1:101:10稀稀释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果释级）时，应以培养基稀释法测定，按测定结果报告菌数。报告菌数。注意事项注意事项1 1、所测菌只包括了在上述培养基上生长的、所测菌只包括了在上述培养基上生长的嗜中温、需氧和兼性厌氧菌的菌落总数。嗜中温、需氧和兼性厌氧菌的菌落总数。2 2、所用的器具必须严格灭菌。、所用的器具必须严格灭菌。3 3、在无菌的环境下完成试验。、在无菌的环境下完成试验。4 4、灭菌的试管和玻璃瓶每次打开和关闭都、灭菌的试管和玻璃瓶每次打开和关闭都需用火焰灭菌。需用火焰灭菌。5 5、忌用手接触标本及已灭菌的器材内部。、忌用手接触标本及已灭菌的器材内部。第四章中药制剂的卫生学检查第四章中药制剂的卫生学检查 微生物限度检查法微生物限度检查法四、控制菌检查四、控制菌检查控制菌检查控制菌检查控制菌包括：控制菌包括：大肠埃希菌、大肠菌群、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、大肠菌群、铜绿假单胞菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、梭菌沙门菌、金黄色葡萄球菌、梭菌控制菌检验试剂判断确证培养基确定判断大肠埃希菌 MUG试液靛基质试液荧光玫瑰红色曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂乳糖发酵管若平板上无菌生长，或生长的菌落与表中所列的菌落形态特征不符，则判为供试品未检出该控制菌大肠菌数胆盐乳糖发酵管产酸产气沙门菌四硫磺酸钠胆盐硫乳琼脂沙门、志贺菌属菌落中心黑色三糖铁琼脂绿脓杆菌胆盐乳糖培养基溴化十六烷基甲铵琼脂氧化酶试验灰白色，周边有蓝绿色素扩散PDP琼脂金葡球菌亚碲酸钠培养基卵黄氯化钠琼脂金黄色血浆凝固酶试验梭菌0.1%新鲜庖肉培养混浊、产气、臭气过氧化氢酶试验控制菌检查控制菌检查大肠菌群：大肠菌群：多种与粪便污染有关的需氧及多种与粪便污染有关的需氧及兼性厌氧菌革兰阴性无芽胞杆菌，包括大兼性厌氧菌革兰阴性无芽胞杆菌，包括大肠埃希菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌肠埃希菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠埃希菌和大肠菌群和阴沟肠杆菌等。大肠埃希菌和大肠菌群被列为粪便污染指示菌，是口服药品的控被列为粪便污染指示菌，是口服药品的控制菌之一。制菌之一。自学控制菌检查控制菌检查沙门菌沙门菌是人畜共患的肠道传染病病原体。易引发是人畜共患的肠道传染病病原体。易引发伤寒、副伤寒、食物中毒和败血症等疾病。伤寒、副伤寒、食物中毒和败血症等疾病。绿脓杆菌绿脓杆菌是常见的化脓性感染菌，并对许多抗菌是常见的化脓性感染菌，并对许多抗菌药物有天然的耐药性。烧伤、烫伤、眼科疾患及药物有天然的耐药性。烧伤、烫伤、眼科疾患及其他外伤，常由该菌引起继发性感染，眼科用制其他外伤，常由该菌引起继发性感染，眼科用制剂及一般外用药，不得检出绿脓杆菌。剂及一般外用药，不得检出绿脓杆菌。金葡球菌金葡球菌是化脓性感染的主要病原菌，外用药品是化脓性感染的主要病原菌，外用药品和滴眼剂不得检出金葡球菌。和滴眼剂不得检出金葡球菌。梭菌为芽孢杆菌科梭菌属多种细菌，梭菌中的主梭菌为芽孢杆菌科梭菌属多种细菌，梭菌中的主要病原菌有破伤风梭菌、气性坏疽菌群和肉毒杆要病原菌有破伤风梭菌、气性坏疽菌群和肉毒杆菌等。均能产生强烈的外毒素，使人和动物致病。菌等。均能产生强烈的外毒素，使人和动物致病。自学控制菌检查方法的验证控制菌检查方法的验证菌种：菌种：标准菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌标准菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌。孢梭菌。对实验菌种的要求同细菌、霉菌、酵母菌对实验菌种的要求同细菌、霉菌、酵母菌计数方法的计数方法的验证验证。控制菌检查方法的验证控制菌检查方法的验证菌液的制备：接种大肠埃希菌、金葡球菌菌液的制备：接种大肠埃希菌、金葡球菌、乙型副伤寒沙门菌、绿脓杆菌的新鲜培、乙型副伤寒沙门菌、绿脓杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，接种生孢梭菌的极端负责培养物至硫乙醇酸种生孢梭菌的极端负责培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养盐流体培养基中，培养18241824小时，用小时，用0.9%0.9%无菌氯化钠溶液制成每无菌氯化钠溶液制成每1ml1ml含菌数含菌数10100cf10100cfu u的菌悬液。的菌悬液。验证方法：试验组（加样回收法）；阴性验证方法：试验组（加样回收法）；阴性菌对照组（验证该控制菌方法的专属性）菌对照组（验证该控制菌方法的专属性）控制菌检查方法的验证控制菌检查方法的验证结果判断：结果判断：阴性菌对照组不应检出阴性对照菌。阴性菌对照组不应检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。若试验组未检出试验菌，则应采用培查。若试验组未检出试验菌，则应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜滤过养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜滤过法、中各法等到方法或联合使用这些方法法、中各法等到方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并并重新进行方消除供试品的抑菌活性，并并重新进行方法验证法验证控制菌检查控制菌检查大肠埃希菌大肠埃希菌除另有规定外，取供试液除另有规定外，取供试液10ml(10ml(相当供试品相当供试品1g1g、1ml 1ml、10cm10cm2 2),),直接或处理后接种至适量（不少于直接或处理后接种至适量（不少于100ml100ml）的）的胆盐乳糖培养基胆盐乳糖培养基中，培养中，培养18241824小时，小时，必要时可延长至必要时可延长至4848小时。小时。控制菌检查控制菌检查取上述培养物取上述培养物0.2ml0.2ml，接种至，接种至5ml 5ml 4-4-甲基伞形酮葡糖苷酸（甲基伞形酮葡糖苷酸（MUGMUG）培养基）培养基的试管内，培的试管内，培养，于养，于5 5小时、小时、2424小时在小时在365nm365nm紫外光灯下观察，紫外光灯下观察，同时用未接种的同时用未接种的MUGMUG培养基作为对照。培养基作为对照。若管内培养物有荧光，为若管内培养物有荧光，为MUGMUG阳性，无荧光，为阳性，无荧光，为MUMUG G阴性。观察后，沿培养管壁加入数滴阴性。观察后，沿培养管壁加入数滴靛基质试液靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性，呈试剂本色，则为靛基质阴性。本底对照应为，则为靛基质阴性。本底对照应为MUGMUG阴性和靛基阴性和靛基质阴性。质阴性。控制菌检查控制菌检查大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)取胆盐乳糖培养基取胆盐乳糖培养基3 3份，每份各份，每份各100ml,2100ml,2份分别加份分别加入规定量的供试液，其中入规定量的供试液，其中1 1份加入对照菌液作阳性份加入对照菌液作阳性对照，第对照，第3 3份加入与供试液等量的稀释剂作空白对份加入与供试液等量的稀释剂作空白对照。培养照。培养18182424小时（必要可延至小时（必要可延至4848小时）。空小时）。空白对照应无菌生长。其余白对照应无菌生长。其余2 2份培养物划线接种于份培养物划线接种于曙曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养培养18182424小时。当阳性对照的平板呈阳性菌落时小时。当阳性对照的平板呈阳性菌落时,供试品的供试品的平板无菌落生长平板无菌落生长,或有菌落但不同于表中所列的特或有菌落但不同于表中所列的特征征,可判为未检出大肠杆菌。可判为未检出大肠杆菌。控制菌检查控制菌检查结果判断：结果判断：如如MUGMUG和靛基质均为和靛基质均为阳性阳性，则供试品中，则供试品中检出检出大肠埃大肠埃希菌；希菌；如如MUGMUG和靛基质均为和靛基质均为阴性阴性，则供试品中，则供试品中未检出未检出大肠大肠埃希菌；埃希菌；如果如果MUGMUG和靛基质一阴性一阳性，则应取胆盐乳糖和靛基质一阴性一阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18241824小时。小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表的菌若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表的菌落形态特征不符，则供试品未检出大肠埃希菌；落形态特征不符，则供试品未检出大肠埃希菌；若有疑失，应对可疑菌落进行分离、纯化、染色若有疑失，应对可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。控制菌检查控制菌检查 大肠埃希菌菌落形态特征大肠埃希菌菌落形态特征培养基培养基 菌落形态菌落形态曙红亚甲蓝琼脂曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆菌落中心深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽。润，常有金属光泽。麦康凯琼脂麦康凯琼脂 鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，鲜桃红色或微红色，菌落中心深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。控制菌检查控制菌检查大肠菌群大肠菌群取含适量（不少于取含适量（不少于10ml10ml）的胆盐乳糖发酵）的胆盐乳糖发酵培养基管培养基管3 3支，分别加入支，分别加入1 1：1010的供试液的供试液1ml1ml（含供试品（含供试品0.1g0.1g或或0.1ml0.1ml）、）、1 1：100100的供试液的供试液1ml1ml（含供试品（含供试品0.01g0.01g或或0.00.01ml1ml）、）、1 1：10001000的供试液的供试液1ml1ml（含供试品（含供试品0.001g0.001g或或0 0.001ml.001ml），另取），另取1 1支胆盐乳糖发酵培养基管支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液加入稀释液1ml1ml作为阴性对照管。培养作为阴性对照管。培养1821824 4小时。小时。控制菌检查控制菌检查结果判断：结果判断：胆盐乳糖发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产胆盐乳糖发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气，则未检出大肠菌群；酸产气，则未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养的平板上，培养18241824小时。小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表的菌若平板上无菌落生长，或生长的菌落与下表的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，则落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，则未检出大肠菌群；未检出大肠菌群；如若平板上生长的菌落与下表的菌落形态相符或如若平板上生长的菌落与下表的菌落形态相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。验。控制菌检查控制菌检查 大肠菌群菌落形态特征大肠菌群菌落形态特征培养基培养基 菌落形态菌落形态曙红亚甲蓝琼脂曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿圆形或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。润。麦康凯琼脂麦康凯琼脂 鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起或稍凸起，边边 缘整齐，表面光滑，湿润。缘整齐，表面光滑，湿润。控制菌检查控制菌检查确证试验：从上述分离平板上挑选确证试验：从上述分离平板上挑选4545个疑似菌落个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养，分别接种于乳糖发酵管中，培养24482448小时，若小时，若产酸产气，则检出大肠菌群。产酸产气，则检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数，按下表报告根据大肠菌群的检出管数，按下表报告1g1g或或1ml1ml供供试品中的大肠菌群数。试品中的大肠菌群数。控制菌检查控制菌检查可能的大肠菌群数可能的大肠菌群数各供试品量的检出结果各供试品量的检出结果可能的大肠菌可能的大肠菌群数群数N N（个（个/g/g或或mlml）0.1 g0.1 g或或0.1ml0.1ml0.01 g0.01 g或或0.01ml0.01ml0.001 g0.001 g或或0.001ml0.001ml+10103 3+-10102 2N N 10103 3+-10 10 N N 10102 2-1010+代表检出大肠菌群，代表检出大肠菌群，-未代表检出大肠菌群未代表检出大肠菌群控制菌检查控制菌检查沙门菌沙门菌(Salmonella species)(Salmonella species)取供试品取供试品10g10g或或10ml,10ml,直接或处理后接种至适量（直接或处理后接种至适量（不少于不少于200ml200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，培养其他适宜方法混匀，培养18241824小时。小时。取上述培养物取上述培养物1ml1ml，接种于，接种于10ml10ml四硫磺酸钠亮绿培四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养养基中，培养18241824小时后，分别划线接种于胆盐小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂或（曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上康凯琼脂或（曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养，培养18241824小时，必要时可延长至小时，必要时可延长至40484048小时。小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表所列特征，则供试品未检出沙门菌。所列特征，则供试品未检出沙门菌。控制菌检查控制菌检查沙门氏菌菌落形态特征沙门氏菌菌落形态特征培养基培养基菌落形态菌落形态胆盐硫乳琼脂胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色。沙门氏、志贺沙门氏、志贺无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色。菌属琼脂菌属琼脂 曙红亚甲蓝琼脂曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落。麦康凯琼脂麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色。控制菌检查控制菌检查若平板上生长的菌浇与上表所列的菌落形若平板上生长的菌浇与上表所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选态特征相符或疑似，用接种针挑选2323个菌个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养行斜面和高层穿刺接种，培养24244848小时。小时。如斜面未见红色、底层未见黄色，或斜面如斜面未见红色、底层未见黄色，或斜面黄色、底层无黑色，则供试品未检出沙门黄色、底层无黑色，则供试品未检出沙门菌。否则应取三糖铁琼脂培养基斜面的培菌。否则应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。，确认是否为沙门菌。控制菌检查控制菌检查绿脓杆菌绿脓杆菌(Pseudomonas(Pseudomonas aeruginosaaeruginosa)取供试液取供试液10ml(10ml(相当供试品相当供试品1g1g、1ml 1ml、10cm10cm2 2),),直接或处理后接种至适量（不少于直接或处理后接种至适量（不少于100ml100ml）的胆）的胆盐乳糖培养基中，培养盐乳糖培养基中，培养18241824小时。小时。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三四铵取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三四铵琼脂培养基的平板上，培养琼脂培养基的平板上，培养18241824小时。小时。绿脓杆菌的典型菌落呈扁平无定形，灰白色，表绿脓杆菌的典型菌落呈扁平无定形，灰白色，表面湿润，周边时有蓝绿色素扩散。面湿润，周边时有蓝绿色素扩散。控制菌检查控制菌检查如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述如平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落特征不符，则供试品未检出绿脓杆菌。菌落特征不符，则供试品未检出绿脓杆菌。如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相符或疑似，应挑选符或疑似，应挑选2323个菌落群，分别接种个菌落群，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养于营养琼脂培养基斜面上，培养18241824小时小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。化酶试验。控制菌检查控制菌检查氧化酶试验氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片取营养琼脂培养基斜面培养物涂于滤纸片上，再滴加新配制的上，再滴加新配制的1 1二甲基对苯二胺盐二甲基对苯二胺盐酸盐试液酸盐试液,在在3030秒内呈粉红色逐渐变为紫红秒内呈粉红色逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。色为氧化酶试验阳性。否则为阴性。如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化如证实为非革兰氏阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。酶试验阴性，均可判为未检出绿脓杆菌。否则，应进行绿脓菌素试验。否则，应进行绿脓菌素试验。控制菌检查控制菌检查绿脓菌素绿脓菌素(PyocyaninPyocyanin)试验试验取上述琼脂斜面培养物，接种于绿脓菌素取上述琼脂斜面培养物，接种于绿脓菌素专用专用PDPPDP琼脂培养基斜面上，培养琼脂培养基斜面上，培养2424小时后小时后，在试管内加氯仿，在试管内加氯仿3 35ml,5ml,搅碎培养基并充搅碎培养基并充分振摇。静置片刻分振摇。静置片刻,将氯仿移至另一试管中将氯仿移至另一试管中，加入，加入1mol/L1mol/L盐酸溶液约盐酸溶液约1ml,1ml,振摇后，静振摇后，静置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，置片刻，如在盐酸溶液层内出现粉红色，即为绿脓菌素阳性。同时用未接种的即为绿脓菌素阳性。同时用未接种的PDPPDP琼琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。试验应呈阴性。控制菌检查控制菌检查若上述疑似菌为革兰阴性无芽胞杆菌、氧若上述疑似菌为革兰阴性无芽胞杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，则供化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，则供试品检出绿脓杆菌。试品检出绿脓杆菌。若上述疑似菌为革兰阴性无芽胞杆菌、氧若上述疑似菌为革兰阴性无芽胞杆菌、氧化酶试验阳性，但绿脓菌素试验阴性，应化酶试验阳性，但绿脓菌素试验阴性，应进行适宜的生化试验，确认是否为绿脓杆进行适宜的生化试验，确认是否为绿脓杆菌。菌。控制菌检查控制菌检查 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus(Staphylococcus aureusaureus)取供试液取供试液10ml(10ml(相当供试品相当供试品1g1g、1ml 1ml、10cm10cm2 2),),直接或处理后接种至适量（不少于直接或处理后接种至适量（不少于100ml100ml）的亚）的亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基中，培养18241824小时，必要时可延长至小时，必要时可延长至4848小时。小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24247272小时。小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于下表所列特征，则供试品未检出金黄色葡萄球菌。所列特征，则供试品未检出金黄色葡萄球菌。控制菌检查控制菌检查金黄色葡萄球菌菌落形态特征金黄色葡萄球菌菌落形态特征 培养基类型培养基类型 菌落形态菌落形态 卵黄氯化卵黄氯化 金黄色、圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂金黄色、圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂钠琼脂钠琼脂 卵磷脂分解的白色沉淀圈，菌落直径卵磷脂分解的白色沉淀圈，菌落直径1 12mm2mm 甘露醇氯化甘露醇氯化金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有琼脂钠琼脂钠琼脂 黄色环，菌落直径约黄色环，菌落直径约0.70.71mm1mm控制菌检查控制菌检查如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相如平板生长的菌落特征与上述菌落特征相符或疑似，应挑选符或疑似，应挑选2323个菌落群，分别接种个菌落群，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养于营养琼脂培养基斜面上，培养18241824小时小时。进行血浆凝固酶试验。进行血浆凝固酶试验。控制菌检查控制菌检查血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验取灭菌小试管取灭菌小试管3 3支，各加入血浆无菌水支，各加入血浆无菌水(1:1)0.5ml(1:1)0.5ml，1 1支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液支加入被检菌株的营养肉汤培养液（或浓菌悬液）0.5ml,0.5ml,其余其余2 2支作对照管；支作对照管；1 1支加入金黄色葡萄球支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml0.5ml作阳性对照作阳性对照;另另1 1支加入营养肉汤或支加入营养肉汤或0.90.9氯化钠溶氯化钠溶0.5ml0.5ml作阴性对照作阴性对照。将。将3 3管同时培养。管同时培养。3 3小时后开始检查小时后开始检查,以后适当时间以后适当时间逐次观察直至逐次观察直至2424小时。阴性对照管的血浆流动自如小时。阴性对照管的血浆流动自如，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性，阳性对照管血浆凝固，试验管血浆凝固者为阳性；阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时；阳性对照管和空白对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验。，应另制备血浆，重新试验。当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为当阴性对照和阳性对照符合要求，供试品的菌株为革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性，判定为检革兰氏阳性球菌、血浆凝固酶试验阳性，判定为检出金黄色葡萄球菌。出金黄色葡萄球菌。控制菌检查控制菌检查梭菌（梭菌（Clostridium Clostridium）取供试液取供试液10ml(10ml(相当供试品相当供