分子诊断项目

分子诊断室项目介绍内 容1.HBV-DNA荧光定量荧光定量PCR2.流式基本应用流式基本应用3.染色体核型分析染色体核型分析HBV DNA荧光定量PCRPCR技术简介1985年美国年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室公司的人类遗传研究室mullis等人发明了具有划时代意义的等人发明了具有划时代意义的PCR技术，技术，从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望从而使人们梦寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。成为现实。1988年年PE-cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR热循环仪，热循环仪，从而使从而使PCR技术的自动化成为现实。技术的自动化成为现实。Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发明者的发明者Michael分享了分享了1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。随着随着PCR技术的日臻成熟技术的日臻成熟1995年出现年出现荧光基因探针荧光基因探针杂交定量杂交定量PCR方法方法4PCR基本原理z类似DNA的体内复制，以单链DNA为模板，利用DNA聚合酶依赖于模板的特性，在附加的一对寡核苷酸引物之间催化合成互补链的过程。5DNA 合成的必备要素合成的必备要素DNA Polymerase dNTPs single-stranded template primer6定量定量PCRPCR概念概念z以外参或内参为标准，通过对以外参或内参为标准，通过对PCRPCR终产物的分析或终产物的分析或PCRPCR过程的监过程的监测，对测，对PCRPCR起始模板量的定量起始模板量的定量7常规常规PCRPCR与定量与定量PCRPCR的比较的比较8实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理z指在指在PCR反应体系中加入荧光基团反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号利用荧光信号的积累实时监测的积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析未知模板进行定量分析。zCt（cycle threshold)值定义：每个反应管的荧值定义：每个反应管的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。z荧光阈值（荧光阈值（threshold)的缺省设置是的缺省设置是3-15个循个循环的荧光信号的标准偏差的环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：倍，即：threshold=10SD cycle0-159CtCt值与起始模板的关系值与起始模板的关系z每个模板的每个模板的CtCt值与该模板的起始拷贝数的值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板数越多，对数存在线性关系，起始模板数越多，CtCt值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作值越小，利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，只要获得未知样品的出标准曲线，只要获得未知样品的CtCt值，值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。贝数。10荧光定量的标准曲线荧光定量的标准曲线 标准曲线未知标本Crossing Point(Cycles)log(copy number)nlog(F2/F1)nlog(F2/F1)Target3811荧光检测模式z（1）SYBR Green I 染料z（2）水解探针（Taqman）z（3）杂交探针（Hybridization Probes）z（4）分子信标（molecular beacon)发夹引物（sunrise primer)蝎状引物（scorpion primer)复合探针（complex probes)12探针的探针的5端标记一个荧光基端标记一个荧光基团，团，3标记另一个荧光基团。标记另一个荧光基团。5端荧光基团吸收能量后将端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的能量转移给临近的3端荧光端荧光淬灭基团（淬灭基团（FRET），正常），正常情况下检测不到该探针情况下检测不到该探针5端端荧光基团发出的荧光信号。荧光基团发出的荧光信号。Taqman探针原理13当当溶溶液液中中模模板板变变性性后后低低温温退退火火时时，引引物物与与探探针针同同时时与与模模板板结结合合。在在引引物物的的介介导导下下，Taq酶酶沿沿模模板板向向前前合合成成子子链链，当当延延伸伸至至探探针针结结合合处处，发生链的置换；发生链的置换；Taqman探针原理14Taqman探针原理Taq酶酶的的53外外切切酶酶活活性性将将探探针针5端端连连接接的的荧荧光光基基团团从从探探针针上上切切割割下下来来，游游离离于于反反应应体体系系中中，从从而而脱脱离离3端端荧荧光光淬淬灭灭基基团团的的屏屏蔽蔽，发发出出荧荧光光，荧荧光光信信号号与与PCR产产物物的的数数量量成成比比例例。因因此此根根据据PCR反反应应液液的的荧荧光光强强度度即即可可计算出初始模板的数量。计算出初始模板的数量。15定量定量PCR在乙肝检测中意义在乙肝检测中意义z1.1.判断疾病的严重程度和传染性判断疾病的严重程度和传染性z2.2.PCRPCR结果与血清免疫学结果的综合评价结果与血清免疫学结果的综合评价z3.3.观察抗病毒药物疗效，指导药物用量观察抗病毒药物疗效，指导药物用量z4.4.献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断z5.5.预测病情、判断预后预测病情、判断预后z6.6.器官移植、母婴垂直传播器官移植、母婴垂直传播1617标本留取及检测步骤标本留取及检测步骤z标本：静脉血3ml，黄色盖试管。标本避免溶血和脂血。z检测步骤：1.反应液配制 2.核酸提取 3.核酸扩增z结果分析：采用样点拟合法，由标准曲线得到病毒的拷贝或IU/ML。18z1.1.分分区区操操作作：PCRPCR具具有有超超敏敏感感性性，因因此此在在检检测测过过程程中中应应分分区区操操作作，即即分分为为试试剂剂准准备备区区，样品处理区，样品处理区，PCRPCR扩增区。扩增区。z2.2.试试验验前前实实验验室室应应使使用用紫紫外外消消毒毒至至少少3030分分钟。钟。z3.3.操操作作时时戴戴一一次次性性手手套套，加加样样头头要要求求及及时时更换，吸液时避免飞溅。更换，吸液时避免飞溅。注意事项19z4.4.每每天天实实验验前前，在在废废物物缸缸内内套套上上塑塑料料袋袋，加加入入半半缸缸含含有有效效氯氯1%1%次次氯氯酸酸钠钠液液，实实验验时时将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。将吸头、离心管丢入废液缸中浸泡。z5.5.所所有有试试剂剂试试验验前前充充分分融融化化，避避免免反反复复冻冻融。融。z6.6.每次每次PCRPCR反应均应设立阴阳性对照。反应均应设立阴阳性对照。注意事项20 流式基本应用 流式细胞术的概念流式细胞术的概念=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,Flow Cytometry,简称简称FCMFCM）是一种可以快）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选术，同时可以对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征22流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小=细胞颗粒度=细胞表面面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量=蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面/胞浆/核的特异性抗原=细胞活性=细胞内细胞因子=酶活性=激素结合位点=细胞受体23散射光信号散射光信号Right Angle Light Detector Right Angle Light Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Detector Forward Light Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSCFSCIncident Incident Light Light SourceSource=前向角散射光前向角散射光（FSCFSC,Forward Scatter,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光侧向角散射光（SSCSSC,Side Scatter,Side Scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性24外周全血细胞散射光双外周全血细胞散射光双参数参数点图点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）25荧光信号荧光信号z使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析色分析z荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量达含量26数据分析数据分析=数据显示数据显示:直方图直方图 (Histogram(Histogram)二维点图二维点图(Dot Plot)(Dot Plot)等高线图等高线图(Contour(Contour Plot)Plot)密度图密度图 (Density)(Density)三维图（三维图（3D Plot3D Plot）27流式的临床应用流式的临床应用=淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的免疫状态监测细胞移植的免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿=HLA-B27HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4绝对计数绝对计数28淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析z使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（白细胞分化抗原（CDCD分子）的表达，可以分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析z各淋巴细胞亚群的百分含量各淋巴细胞亚群的百分含量z淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析29z根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为yB B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关yT T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关x总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病疾病 yNKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。胞毒性作用。30y根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为yT T辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+），即），即 Th/TiTh/TiyT T抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）,即即 Ts/TcTs/TcyTh/TsTh/Ts比值比值 可用于评价自身免疫失调、被怀可用于评价自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态疫状态31临床意义z诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS）z造血干细胞移植后免疫重建（造血干细胞移植后免疫重建（6个月个月NK；9个月个月T、B）zTh/TsTh/Ts：机体免疫功能亢进机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，自身免疫性疾病，如如SLESLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）zTh/TsTh/Ts：机体免疫功能低下机体免疫功能低下：AIDSAIDS、病毒感染、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等肿瘤等32临床意义z移植后动态免疫监测：移植后动态免疫监测：y急排临床症状出现前急排临床症状出现前1-51-5天，活化天，活化T T和和Th/TsTh/Ts持续持续，1.21.2预示急排；预示急排；yTh/TsTh/Ts持续持续 表明可能感染，比值表明可能感染，比值1.081.08，可能性大，可能性大，0.20.2应停用免疫抑制剂；应停用免疫抑制剂；z实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察y治疗前常伴治疗前常伴T T 、Th/TsTh/Ts，放，放/化疗有效可恢复；化疗有效可恢复；y淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；较好；z探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）33淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析34先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症35淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析36HLA-B27 HLA-B27 HLA-B27是是MHC IMHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过的表达与强直性脊柱炎高度相关，超过90%90%的强的强直性脊柱炎患者直性脊柱炎患者HLA-B27HLA-B27阳性。阳性。其他，如其他，如Reiter sReiter s综和症阳性率综和症阳性率70-90%70-90%，银屑病性关节，银屑病性关节炎阳性率炎阳性率50-60%50-60%，葡萄膜炎阳性率，葡萄膜炎阳性率40-50%40-50%检测采用全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，可以快速、检测采用全血，无需分离淋巴细胞，操作简单，可以快速、灵敏、准确地分析灵敏、准确地分析HLA-B27HLA-B27。结果报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴结果报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性性/阳性结果。实验的灵敏度为阳性结果。实验的灵敏度为100%100%，特异性为，特异性为97.5%97.5%。37流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用（血液（血液）z 白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型z 造血干细胞计数造血干细胞计数z 阵发性血红蛋白尿（阵发性血红蛋白尿（PNHPNH）诊断）诊断z 网织红细胞计数网织红细胞计数z 血小板分析血小板分析y血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达y血小板活化血小板活化y网织血小板分析网织血小板分析38流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用（肿瘤）（肿瘤）z 细胞周期和倍体分析细胞周期和倍体分析z 肿瘤相关基因表达肿瘤相关基因表达的研究的研究z 抗肿瘤药物作用机制的研究抗肿瘤药物作用机制的研究z 放疗放疗/化疗疗效的研究化疗疗效的研究z 多药耐药基因多药耐药基因的研究的研究z 细胞凋亡的分析细胞凋亡的分析y凋亡细胞的分析凋亡细胞的分析y凋亡相关蛋白凋亡相关蛋白的分析的分析39流式标本留取z 紫色盖试管，EDTA抗凝血或骨髓1-2ml。不能有凝块。z 单细胞悬液细胞数不少于106个。40 染色体核型分析染色体核型分析41基本概念z染色体核型：染色体核型：指一个物种所特有的染色体数目和每一条染指一个物种所特有的染色体数目和每一条染色体的形态特征。色体的形态特征。-人类体细胞中共有人类体细胞中共有2323对染色体，对染色体，2222对常染色体，一对性染色体。对常染色体，一对性染色体。z核型分析：核型分析：将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特征分析的过程称核型分析。如正常女性核型：分析的过程称核型分析。如正常女性核型：46,XX 46,XX 正常正常男性核型：男性核型：4646，XYXY。z核型模式图：核型模式图：是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。等特征排列起来的图像。42染色体模式图43人类23对染色体4445染色体编号(人X染色体)记述一特定带时，需要写明4个内容：染色体号，长短臂，区的号序和带的号序。这些内容按顺序写，不用间隔或加标点。如果某一带被再细分，在原带号数后加一小数点，编号原则仍按从着丝粒往臂端序贯编号。如1p31.2代表一号染色体短臂3区1带第2亚带46染色体标本常规制备染色体标本常规制备 z方法方法：中期染色体G带显色z原理原理：采用秋水仙素处理培养的细胞，使细胞停留在分裂中期，再用低渗液处理细胞，使细胞胀大，以进行染色体制片。G-带是标本片经过预处理后，用Giemsa染色显示的带纹。47操作步骤z 细胞培养：细胞培养：细胞培养液5mL（含植物凝血素），加 0.3mL肝素抗凝全血37培养箱静置培养6872小时。z 收获细胞：收获细胞：终止培养前11.5小时加入秋水仙素。z 制片：制片：低渗-预固定-固定-滴片-干燥老化z G-显带，图像分析：胰酶消化，Giemsa染色，采集图像，分析20-30个中期分裂相48核型描述z首先列出染色体总数，然后是性染色体组成，接着列出异常的染色体数目或形态。下列统一的命名符号：yA-G 染色体组的名称y1-22 染色体编号yX,Y 性染色体ydel 缺失yder 结构重排的染色体ydup 重复yinv 倒位yt 易位y+/-在染色体符号前表示染色体增加或减少，在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分49检查适应症及意义检查适应症及意义z生殖功能障碍 在不孕症、多发性流产和畸胎等有生殖功能障碍的妇夫中至少有7%10%是染色体异常的携带者。常见的有染色体结构异常如平衡易位和倒位以及数量异常如由于女性少一条X染色体造成的45，XO，或多一条Y染色体造成的47，XXY。平衡易位和倒位由于无基因的丢失，携带者本身常并不发病，却可因其生殖细胞染色体异常而导致不孕症、流产和畸胎等生殖功能障碍。性染色体数目异常除可造成不孕外，还常出现第二性征异常。50检查适应症及意义检查适应症及意义z第二性征异常者 如有原发性闭经、性发育不良，伴身材矮小、肘外翻、盾状胸和智力稍有低下,阴毛、腋毛少或缺如，后发际低，不育等，应考虑是否有X染色体异常。常见的X染色体异常有特纳氏综合征和环形X染色体。特纳氏综合征患者比正常女性少一条X染色体，其染色体核型为：45，X0。环形X染色体患者由于某种原因使X染色体两端同时出现断裂，并在断裂部位重接形成，环形染色体越小临床症状越重。早期发现这些异常并给予适当的治疗可使第二性征得到一定程度地改善，也可能获得生育能力。51检查适应症及意义检查适应症及意义z外生殖器两性畸形 根据生殖器外观常难以正确决定性别的患者，通过性染色体的检查有助于做出明确诊断。z先天性多发性畸形和智力低下的患儿 染色体检查可发现有21-三体综合征等异常。z白血病及其它肿瘤患者 如：慢性粒细胞白血病：Ph染色体是其标记染色体，由9号和22号染色体部份片段相互易位形成的。Ph染色体的出现为慢性粒细胞白血病的确诊指标，治疗过程中Ph染色体的出现或消失，还可作为疗效和愈后的参考指标。5246，XY，t(7:21)5347,XY,+215447,XXY5546,XY,t(9;22)5646，XY,r（7）5758