细胞生物学实验

细胞生物学实验细胞生物学实验实验一实验一细菌的形态和结构观察细菌的形态和结构观察一、实验目的一、实验目的观察细菌的菌落特征观察细菌的菌落特征掌握简单染色法和细菌涂片方法掌握简单染色法和细菌涂片方法在油镜下观察细菌个体的形态特征在油镜下观察细菌个体的形态特征形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细颜色均匀，同培养基结合不紧密。菌落特征与组成菌落的细胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。胞结构、生长状况、排列方式、好气性和运动性直接相关。细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为形态观察的不同要求，可将染色分为3 3种类型：简单染色、鉴种类型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。别染色、特殊染色。二、实验的基本原理二、实验的基本原理二、实验的基本原理二、实验的基本原理简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电简单染色法原理：细菌在中性的环境中带负电荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、荷，用碱性染料（解离时带正电荷）如美兰、结晶紫等进行染色。结晶紫等进行染色。采用加热或化学固定两种方法采用加热或化学固定两种方法，使菌体粘附于，使菌体粘附于玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力玻片上，并且增加菌体对染料的亲和力三、三、实验材料实验材料显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜显微镜（显微镜灯）、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。纸、吸水纸等。0.05%和和0.1%吕氏碱性美蓝染色液，吕氏碱性美蓝染色液，0.5%番番红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水红染液，中性红染液，二甲苯，生理盐水细菌三种形态的染色标本。细菌三种形态的染色标本。大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，哈氏弧菌和无乳链球菌链球菌24h24h液体培养基培养物液体培养基培养物盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。简单染色法（一般染色法）简单染色法（一般染色法）.菌种：菌种：牙垢细菌牙垢细菌 .涂片涂片 .干燥：干燥：自然气干或酒精灯自然气干或酒精灯高处微微加热。高处微微加热。固定固定 .染色：染色：在整个涂面上滴加在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色分钟齐氏石炭酸复红，染色分钟。.水洗：水洗：倾去染液，用自来倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。料颜色为止。干燥：干燥：空气中自然干燥。空气中自然干燥。镜检：镜检：在油镜下观察牙垢中的在油镜下观察牙垢中的各种细菌形态并绘图。各种细菌形态并绘图。四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤四、实验步骤油镜的使用油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。2.调节光亮度调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。调至看清物象为止。6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。换片：另换新片，必须从第三条开始操作。7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。显微镜保养和使用中的注意事项：显微镜保养和使用中的注意事项：1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。手拿，更不可倾斜拿。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片镜片。四、实验步骤四、实验步骤细菌三种基本形态的观察：细菌三种基本形态的观察：菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个菌落形态观察和个体形态观察，这里主要指个体形态的观察。体形态的观察。1.结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球结合油镜的使用，观察三张细菌染色片（球状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。状菌、杆状菌、和螺旋状菌），边观察边绘图。2.看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。看示范镜：观察双球菌、四联球菌，并绘图。四、实验步骤四、实验步骤思思 考考 题题油镜与普通物镜在使用方法上有何不同油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？应特别注意些什么？使用油镜时，为什么必须用镜头油？使用油镜时，为什么必须用镜头油？镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？而不是直接用高倍镜或油镜观察？实验二实验二细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色一、实验目的一、实验目的掌握细菌的革兰氏染色掌握细菌的革兰氏染色 进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术 观察和识别细菌细胞的特殊构造观察和识别细菌细胞的特殊构造细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色细菌细胞壁的结构和组成存在差异，因此不同细菌对革兰氏染色有不同的反应（阳性和阴性）：有不同的反应（阳性和阴性）：革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多脂类，肽聚糖层较薄、交联度低，当以低，当以95%95%酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变酒精脱色时，脂类被溶解除去，使得细胞壁空隙变大，肽聚糖因大，肽聚糖因95%95%酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量酒精处理，其孔径会缩小，但由于肽聚糖含量较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复较少，细胞壁孔径缩小有限，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物被合物被95%95%酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成酒精洗脱出细胞壁之外，并被随后的红色复染剂染成红色；红色；革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，脂类含量少，经95%95%酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得酒精脱色处理后，肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫与碘形成的紫色染料复合物很难被结晶紫与碘形成的紫色染料复合物很难被95%95%酒精洗脱出细胞壁酒精洗脱出细胞壁之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。之外，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现紫色。二、实验的基本原理二、实验的基本原理显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，香柏油，二甲苯，双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。双层瓶，擦镜纸，生理盐水，吸水纸，染色缸等。染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏染色剂：草酸铵结晶紫染色液，卢（路）哥氏(Lugol)(Lugol)碘碘液，液，95%95%乙醇，乙醇，0.5%0.5%番红染色液。番红染色液。菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌菌种：哈氏弧菌和鳗弧菌24h24h普通海水琼脂斜面普通海水琼脂斜面2828培养培养物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌物，金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌24h24h牛肉膏琼脂斜面牛肉膏琼脂斜面2828培养物。培养物。三、实验材料三、实验材料革兰氏（革兰氏（Gram）染色法）染色法 1.涂片涂片 2.初染：初染：在做好的涂面上滴加草在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：媒染：先用新配的路哥氏碘液先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。分钟，后水洗。4.脱色：脱色：除去残水后，滴加除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约酒精进行脱色约30秒，后立即用秒，后立即用流水冲洗。流水冲洗。5.复染：复染：滴加番红染色液，染滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.镜检：镜检：观察染色结果并绘图。观察染色结果并绘图。四、实验步骤四、实验步骤思考题思考题要得到正确的革兰氏染色结果必须注意要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？关键在哪几步？为什么？哪些操作？关键在哪几步？为什么？实验三实验三实验室环境及人体表面的实验室环境及人体表面的微生物检查微生物检查 认识细菌分布的广泛性；认识细菌分布的广泛性；掌握对菌落识别；掌握对菌落识别；懂得无菌操作的重要性。懂得无菌操作的重要性。一、实验目的一、实验目的每一菌体在适宜每一菌体在适宜条件下，经过多次细胞分裂可形成一个肉条件下，经过多次细胞分裂可形成一个肉眼可见的子细胞集合体，称为菌落。眼可见的子细胞集合体，称为菌落。由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不由于不同细菌其个体的形态、结构、生理和生化等特征不同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现同，当一个菌体经分裂繁殖形成菌落后，就使得菌落呈现其固有的特点。其固有的特点。通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养通过合适的方法，将自然环境中的微生物接种到平板培养基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中基上，经过培养后观察平板上的菌落，就可以检查环境中及人体细菌的数量和类型。及人体细菌的数量和类型。二、实验的基本原理二、实验的基本原理无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，无菌试管，无菌吸管，无菌空培养皿，细菌计数器，蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭蜡笔，玻片，消毒牙签，酒精灯，接种环，无菌棉拭子等。子等。琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，琼脂平板培养基，高层琼脂培养基，无菌生理盐水，2 2碘酒，碘酒，7575乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革乙醇，普通琼脂平板，血琼脂平板，革兰氏染色剂。兰氏染色剂。水样，泥土，空气和人体。水样，泥土，空气和人体。三、实验材料三、实验材料1、正常人体的细菌检查皮肤细菌的检查（1）将手指在平板上按一下；取一根头发，用无菌镊子贴放在平板上。（2）平板培养、观察四、实验步骤四、实验步骤咽部细菌的检查（1）用无菌棉拭子蘸取咽部分泌的液体，然后将该棉拭子在血琼脂平板一端涂抹，接下来用接种环以涂抹处为起点，在平板上画之字形图案进行分离。（2）将血琼脂平板置37培养箱中，培养1824h，挑选不同菌落作革兰氏染色，镜检。四、实验步骤四、实验步骤牙垢中细菌的检查（1）用消毒牙签剔牙垢少许，置于玻片中央。（2）加少许生理盐水将牙垢混匀，涂成薄层，用酒精灯干燥固定。（3）革兰氏染色，镜捡。四、实验步骤四、实验步骤2、空气中细菌的检查（1）取4个无菌操作制备的琼脂平板，将3个分别置于实验台、走廊、窗台等位置，并打开皿盖放置1530min后，盖好皿盖；另外1个不打开皿盖作为对照。（2）将上述4个琼脂平板置37培养箱中培养1824h。四、实验步骤四、实验步骤3.水中细菌的检查（1）十倍梯度稀释（2）稀释水样与培养基混合倒平板（3）培养、观察。四、实验步骤四、实验步骤对各种来源的样品进行对比，如平板菌落数和菌落类型等？饭前为何要洗手？如何防止培养物的污染与防止细菌的扩散方面？思考题思考题实实 验验 四四 培养基的配制与灭菌培养基的配制与灭菌一、实验目的一、实验目的 1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。2.掌握培养基和无菌水的制备方法。掌握培养基和无菌水的制备方法。3.掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。培养基是用人工的办法将多种营养物培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素素外外还应具有适宜的酸碱度还应具有适宜的酸碱度pH值值、缓、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。冲能力、氧化还原电位和渗透压。二、实验的基本原理二、实验的基本原理(1)药药品品和和试试剂剂：牛牛肉肉膏膏、蛋蛋白白陈陈、NaCl、10NaOH溶溶液液、l0盐盐酸酸溶溶液液、琼琼脂脂、水水(2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、刻度烧杯、玻棒、玻璃珠、pH试试纸、试管、分装漏斗、棉花。纸、试管、分装漏斗、棉花。高压蒸气高压蒸气灭菌锅、烘箱。灭菌锅、烘箱。三、实验材料三、实验材料 一、玻璃器皿的洗涤和包装一、玻璃器皿的洗涤和包装 清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞的制作棉塞的制作 包装培养皿和移液管等包装培养皿和移液管等。2-1棉塞制作方法2-2移液管灭菌前的包装四、实验步骤四、实验步骤二、培养基的配制二、培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基的配制（一一）培培养养基基配配方方：牛牛肉肉膏膏2.5g 蛋蛋白白胨胨5.0g、NaCl2.5g、琼琼脂脂10.0g、自自来来水水500mL、pH7.27.4。（二）（二）操作步骤：操作步骤：1.取一个取一个1000mL烧杯，装烧杯，装500mL蒸馏水。蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。解。注意：注意：a.前一种成分溶解之后，才能加入下一种成前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分分 b.蛋白胨、肉膏可加热促进溶解蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c.加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失的水量。适当补充因蒸发而损失的水量。3.调调pH值：用值：用10 NaOH调调pH至至7.27.4，用精密，用精密pH试纸试纸对照。对照。4.过滤过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。该步可省略。5.分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入支试管，其余全部倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。锥形瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染沾在管口或瓶口上面造成污染(见图见图23)。分装量：固体。分装量：固体培养基约为试管高度的培养基约为试管高度的15，灭菌后制成斜面（图，灭菌后制成斜面（图24）。）。分装入锥形瓶内以不超过其容积的分装入锥形瓶内以不超过其容积的3/53/5为宜。半固体培养为宜。半固体培养基以试管高度的基以试管高度的1/3为宜灭菌后垂直待凝。为宜灭菌后垂直待凝。注意不要污染注意不要污染棉塞和瓶口棉塞和瓶口。6.包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。7.灭菌备用：灭菌条件：灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力（相当蒸汽压力0.103MPa）培养基灭菌后必须在）培养基灭菌后必须在37下恒温培养下恒温培养24h，确，确定无菌生长，方可使用。定无菌生长，方可使用。图 例图23培养基分装 图24 斜面制作 三、稀释水的制备三、稀释水的制备 1.取一个取一个250mL的锥形瓶装的锥形瓶装90(或或99)mL蒸蒸馏水，放馏水，放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。包扎，待灭菌。2.另取另取5支支18mm180mm的试管，分别装的试管，分别装9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离实验中所需要无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。的材料。四、灭菌四、灭菌 加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌干热灭菌和和湿热灭菌湿热灭菌。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法干热灭菌的操作方法 a.将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至调节至160并维持并维持2h；b.把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到度降到50左右，才能将物品取出。左右，才能将物品取出。湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：高压蒸气灭菌法的操作步骤如下：1.灭菌锅内加入一定量的水。灭菌锅内加入一定量的水。2.将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满。3.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。4.排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为温度计指示温度为100时关闭排气阀；或当排出时关闭排气阀；或当排出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。5.当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为灭菌器内的温度为121)即开始灭菌，使其维持即开始灭菌，使其维持1530min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2)，延长时间。，延长时间。6.灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至待压力降至零时零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。盖，取出物品，排出锅内剩余水。7.待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。备用。间歇灭菌法：间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭菌。操作方法：操作方法：a.待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次，次，每次在每次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进行。重复进行。b.在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后未杀死残，这样可以使每次蒸煮后未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭。c.第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在在 37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。过滤除菌法：过滤除菌法：不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用细菌过滤器进行除菌。细菌过滤器进行除菌。用于除菌的滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器 1.配制培养基有哪几个步骤配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注在操作过程中应注意些什么问题意些什么问题?为什么为什么?2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培 养基进行无菌检查？养基进行无菌检查？3.3.高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌中中为为什什么么要要把把冷冷空空气气排排净净，为为什什么么在在灭灭菌菌后后不不能能骤骤然然快快速速降降压压，并并要要再再放放尽尽锅内蒸汽才能打开锅盖锅内蒸汽才能打开锅盖?思考题思考题实验五实验五 细菌纯种分离、培养和接种技术细菌纯种分离、培养和接种技术 1.掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从圾、堆肥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能。而获得若干种细菌纯培养技能。2.掌握几种接种技术。掌握几种接种技术。一、实验目的一、实验目的 无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移液套、无菌移液管管1mL2支、支、10mL1支。支。营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或瓶，活性污泥或土壤或湖水湖水1瓶，无菌稀释水瓶，无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。二、实验材料二、实验材料一、细菌的纯种分离一、细菌的纯种分离 三、实验步骤三、实验步骤(一一)稀释平板法稀释平板法 1.取样取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。2.稀释水样稀释水样 将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上无菌水排列好，用记号笔依次编上101、102、103、104、105、106。在无菌操作条件下，。在无菌操作条件下，用用10mL的无菌移液管吸取的无菌移液管吸取10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入编号加入编号为为101无菌水无菌水(内含玻璃珠内含玻璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为将颗粒状样品打散。即为101浓度的菌液。用浓度的菌液。用1mL无无菌移液管吸取菌移液管吸取1mL 101浓度的菌液于编号为浓度的菌液于编号为102无菌水中，无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓度菌液。同样方法，浓度菌液。同样方法，依次稀释到依次稀释到106。稀释液的制备稀释液的制备10mL试样 90mL蒸馏水 3.平板的制作平板的制作 取取10套无菌培养皿编号，套无菌培养皿编号，104、105、106各各3个，另一个个，另一个为空气对照。为空气对照。取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小的菌液浓度小的菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸取为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左左右时，右手拿装有培养基的锥形右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置分混匀，冷凝后即成平板，倒置于于30培养培养2448h，然后观察，然后观察结果。结果。a:皿法皿法 b:倒平倒平板板 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖盖10min后盖上，倒置于后盖上，倒置于30培养培养2448h，然后，然后观察结果。观察结果。（二）平板划线法（二）平板划线法 1.平板制作：平板制作：将融化并冷至约将融化并冷至约50的肉膏蛋白的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。板。2.划线：划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线在平板上轻轻划线(切勿划破培养基切勿划破培养基)。划线完。划线完毕盖好皿盖，毕盖好皿盖，30培养培养2448h后观察结果。后观察结果。平板划线分离的划线方法 左：连续划线法（1，2依次划线的起点）右：分区划线法（1，2，3，4依次划线的起点）二、二、细菌的接种技术细菌的接种技术 接种方法：常用的有接种方法：常用的有斜面接种法斜面接种法、平板接种法平板接种法、液体接种法液体接种法、试管深层固体培养基的试管深层固体培养基的穿刺接种法穿刺接种法。接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。铲或接种锄、玻璃涂棒等。（一）斜面接种法（一）斜面接种法 左手平托两支试管，拇指压住两支试管。左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜外侧是菌种试管，内侧是待接种的空白斜面面(两支试管的斜面同时向上两支试管的斜面同时向上)。右手将棉。右手将棉塞旋松，以便在接种时容易拔出。塞旋松，以便在接种时容易拔出。右手拿接种环，在火焰上先将右手拿接种环，在火焰上先将环端环端烧红烧红灭菌，然后灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。也过火灭菌。将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉右手小指、无名指和手掌将两支试管的棉塞一并夹住拔出，塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中棉塞仍夹在手中，然后，然后让试管口缓缓过火焰。让试管口缓缓过火焰。123 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却先冷却，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线由底部向上划线。抽。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕。次烧红接种环，则接种完毕。45678（二）液体接种和穿刺接种（二）液体接种和穿刺接种1.液体接种法液体接种法(从斜面菌种接入培养液从斜面菌种接入培养液)：用：用接种环接种环挑取斜面菌挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环烧红灭菌。烧红灭菌。2.穿刺接种法穿刺接种法(从斜面菌种接入从斜面菌种接入(半半)固体培养基固体培养基)：用：用接种针接种针经火经火焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完毕。灭菌，则接种完毕。（三）稀释平板涂布法（三）稀释平板涂布法1.稀释样品：方法同稀释平板分离法稀释样品：方法同稀释平板分离法2.倒平板：将融化并冷至倒平板：将融化并冷至50左右的培养基倒入无菌培养皿中，左右的培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板冷凝后即成平板3.用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀4.将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。（四）液体培养基中的菌种接入液体（四）液体培养基中的菌种接入液体培养基培养基 接种工具：无菌移液管和无菌滴管接种工具：无菌移液管和无菌滴管 移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌 用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接 到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。1.斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接斜面接种取菌前为什么要将灼烧过的接种针在无菌培养基上沾一下？种针在无菌培养基上沾一下？2.2.用一根无菌移液管接种几种浓度的水样用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从哪个浓度开始？为什么？时，应从哪个浓度开始？为什么？思考题思考题实验六实验六 微生物细胞的计数微生物细胞的计数 1.1.了了解解血血球球计计数数板板的的结结构构及及计计数数原理。原理。2 2、掌掌握握使使用用血血球球计计数数板板进进行行微微生物计数的方法。生物计数的方法。一、实验目的一、实验目的 测测定定微微生生物物数数量量方方法法很很多多，通通常常采采用用的的有有显显微微镜镜直直接接计计数数法法、平平板板计计数数法法和和光光电电比比浊浊计计数法。数法。显微镜直接计数法显微镜直接计数法 将将小小量量待待测测样样品品的的悬悬浮浮液液置置于于一一种种特特别别的的具具有有确确定定面面积积和和容容积积的的载载玻玻片片上上，又又称称血血球球计计数数板板，于于显显微微镜镜下下直直接接计计数数的的一一种种简简便便、快快速速、直观的方法。直观的方法。二、实验的基本原理二、实验的基本原理血球计数板的构造血球计数板的构造血球计数板的计算方法血球计数板的计算方法 血血球球计计数数板板上上刻刻有有一一长长宽宽各各为为1 1毫毫米米的的方方形形大大格格，其其体体积积为为0.1mm0.1mm3 3。计计数数板板有有两两种种刻刻度度，一一种种是是每每大大格格分分为为1616个个中中格格，而而每每中中格格又又分分2525个个小小格格，每每大大格格为为16251625小小格格=400=400小小格格，而而另另一一种种，则则是是每每大大格格分分为为2525个个中中格格，而而每每中中格格又又分分为为1616个个小小格格，则则每每大大格格为为2516=4002516=400小格（计数板上的标识为小格（计数板上的标识为XBXBK25K25）计计数数时时，如如果果使使用用16格格25格格规规格格的的计计数数室室，要要按按对对角角线线位位，取取左左上上、右右上上、左左下下、右右下下4个个中中格格（即即100个个小小格格）的的酵酵母母菌菌数数。如如果果使使用用25 格格 16格格规规格格的的计计数数室室除除了了取取其其4个个对对角角方方位位外外，还还需需再再数数中中央央的的一一个个中中 格格(即即 80个个 小小 方方 格格)的的 酵酵 母母 菌菌 数数。(6)当当遇遇到到位位于于大大格格线线上上的的酵酵母母菌菌，一一般般只只计计数数大大方方格格的的上上方方和和左左方方线线上上的的酵酵母母细细胞胞(或或只只计计数数下下方方和和右右方方线线上的酵母细胞上的酵母细胞)。计数公式计数公式 (1)1625的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式：酵母细胞数酵母细胞数ml=（100小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数 100）40010000稀释倍数稀释倍数 (2)25x16的血球计数板计算公式：的血球计数板计算公式：酵母细胞数酵母细胞数ml=（80小格内酵母细胞个数小格内酵母细胞个数80）40010000稀释倍数稀释倍数三、实验器材三、实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻显微镜、血球计数板、酵母菌液、盖玻片、吸管、吸水纸。片、吸管、吸水纸。操作步骤操作步骤1.1.镜检计数室镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能才能 进行计数。进行计数。2.2.加样品加样品 在血球计数板上盖上盖玻片在血球计数板上盖上盖玻片,用滴管用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会菌液会自动进入计数室，静置自动进入计数室，静置5 5分钟。分钟。3.3.计数计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。2525个中格的个中格的取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复计计2-32-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中菌体的个数。菌体的个数。4.4.清洗血球计数板清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。须重复洗涤干净为止。结果记录结果记录 第一个第一个中格中格第二个第二个中格中格第三个第三个中格中格第四个第四个中格中格第五个第五个中格中格第一次第一次测测 定定第二次第二次测测 定定第三次第三次测测 定定平平 均均 1.1.使用血球计数板应注意什么问题使用血球计数板应注意什么问题?2.2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出试分析影响本实验结果的误差来源并提出改进措施改进措施思考题思考题实验七实验七 大肠杆菌生长曲线的测定大肠杆菌生长曲线的测定 1.1.了了解解大大肠肠杆杆菌菌的的生生长长曲曲线线特特征征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线；和繁殖规律，并学会绘制生长曲线；2.2.学习光电比浊法测量细菌数学习光电比浊法测量细菌数量的方法。量的方法。一、实验目的一、实验目的 将将少少量量细细菌菌接接种种到到一一定定体体积积的的、适适合合的的新新鲜鲜培培养养基基中中，在在适适宜宜的的条条件件下下进进行行培培养养，定定时时测测定定培培养养液液中中的的菌菌量量，以以菌菌量量的的对对数数作作纵纵坐坐标标，生生长长时时间间作作横横坐坐标标，所所绘绘制制的的曲曲线线叫叫生生长长曲曲线线。它它反反映映了了单单细细胞胞微微生生物物在在一一定定环环境境条条件件下下进进行行液液体体培培养养时时所所表表现现出出的群体生长规律。的群体生长规律。细细菌菌悬悬液液的的浓浓度度与与光光密密度度（OD值值）成成正正比比，因因此此可可利利用用分分光光光光度度计计测测定定菌菌悬悬液液的的光光密密度度来来推推知知菌菌液液的的浓浓度度，并并将将所所测测的的OD值值与与其其对对应应的的培培养养时时间间作作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，二、实验的基本原理二、实验的基本原理722型分光光度计，恒温振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。LB液体培养基。大肠杆菌。三、实验材料三、实验材料四、实验步骤四、实验步骤1.250mL三角瓶11个，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。2.大肠杆菌接入盛有50mL LB液体培养基振荡培养。3.分别按对应时间将三角瓶取出，立即于4条件下贮存，待所有培养结束时一同测定OD值。四、实验步骤四、实验步骤4.将未接种的LB液体培养基倒入比色杯中，选用600nm波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的LB液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.100.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么缺点？次生礼谢产物的大量积累在哪个时期?根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?思考题思考题实验八实验八 细菌的生理生化反应细菌的生理生化反应大分子物质的水解试验大分子物质的水解试验1、证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。2、掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。3、了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。4、掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。5、了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。一、实验目的一、实验目的1、微生物对生物大分子的分解利用淀粉水解：淀粉酶油脂水解：脂肪酶明胶液化：蛋白酶石蕊牛乳试验：产酸、产碱、胨化、酸凝固等。2 2、糖发酵试验、糖发酵试验产酸：溴甲酚紫指示剂大肠杆菌：产气肠杆菌：产气：杜氏小管检测大肠杆菌：产气肠杆菌：3 3、IMViCIMViC试验试验二、实验的基本原理二、实验的基本原理IMViC试验吲哚试验：甲基红试验（M.R.试验）：伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验）：柠檬酸盐试验：色氨酸酶：色氨酸吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（红色）大肠杆菌：产气肠杆菌：产酸能力：强，甲基红变红；弱：甲基红不变色大肠杆菌：阳性产气肠杆菌：阴性葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇2,3-丁二醇乙酰甲基甲醇OH二乙酰精氨酸的胍基红色化合物大肠杆菌：阳性产气肠杆菌：阴性能否利用柠檬酸作为碳源大肠杆菌：阴性产气肠杆菌：阳性1、菌种：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），普通变形杆菌（Proteus vularis），产气肠杆菌。2、培养基：固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管、葡萄糖发酵培养基试管和乳糖发酵培养基试管各3支，普通变形杆菌（内装有倒置的德汉氏小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。3、溶液或试剂：革兰氏染色用卢氏碘液（Lugols iodine solution），甲基红指示剂，40%KOH，5%-萘酚，乙醚，吲哚试剂等。4、仪器或其他用具：无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。三、实验材料三、实验材料1、细菌水解大分子物质试验n 淀粉水解试验培养基：淀粉培养基平板菌种：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌方法：平板上划“十”字接种注意：接种前在平板底部作记号；“十”字不要太大n 油脂水解试验培养基：油脂培养基平板菌种：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌方法：平板上划折线接种注意：接种前在平板底部作记号n 明胶液化试验培养基：试管明胶培养基菌种：大肠杆菌或 产气肠杆菌方法：穿刺接种注意：20培养n 石蕊牛乳试验培养基：试管石蕊牛乳培养基（2支）菌种：粘乳产碱菌或铜绿假单胞菌方法：斜面划线接种注意：观察结构注意牛乳产酸、产碱、凝固、胨化现象是连续出现的。四、实验步骤四、实验步骤1、细菌水解大分子物质试验2、糖发酵试验培养基：葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基（内装杜氏小管）（各3支）菌种：大肠杆菌和产气肠杆菌方法：分别接种于葡萄糖发酵培养基和乳糖发酵培养基四、实验步骤四、实验步骤1、细菌水解大分子物质试验2、糖发酵试验3、IMViC试验四、实验步骤四、实验步骤IMViC试验试验名称试验名称培养基名称培养基名称菌种名称菌种名称接种接种方式方式接种接种管数管数吲哚试验吲哚试验蛋白胨水培养基蛋白胨水培养基大肠杆菌和大肠杆菌和产气肠杆菌产气肠杆菌液体液体1 1甲基红试验甲基红试验葡萄糖蛋白胨培养基葡萄糖蛋白胨培养基液体液体1 1伏普试验伏普试验葡萄糖蛋白胨培养基葡萄糖蛋白胨培养基液体液体1 1柠檬酸盐试验柠檬酸盐试验柠檬酸盐培养基柠檬酸盐培养基斜面斜面1 11、不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？、不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？2、假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现、假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？什么结果？3、为什么大肠杆菌的甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性、为什么大肠杆菌的甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏普试验最初底物与最终产物有何异同之？这个试验与伏普试验最初底物与最终产物有何异同之处？处？4、说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代、说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用，可以用哪种化合物代替醋酸铅？替醋酸铅？思考题思考题实验九实验九菌种的保藏菌种的保藏一、实验目的一、实验目的1.学习和掌握菌种保藏的基本原理;2.比较和掌握几种不同菌种保藏的方法。微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，如微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，被其他杂菌污染，果保存不妥容易发生变异，被其他杂菌污染，甚至导致细胞死亡，因此，菌种的长期保藏对甚至导致细胞死亡，因此，菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都很重要，也是非常必要任何微生物学工作者都很重要，也是非常必要的。人为地创造低温、缺氧、干燥、缺少营养的。人为地创造低温、缺氧、干燥、缺少营养物质等不良条件，抑制微生物的生长、繁殖，物质等不良条件，抑制微生物的生长、繁殖，使其处于休眠状态，从而可以较长时间保持菌使其处于休眠状态，从而可以较长时间保持菌种不死亡和不变异。种不死亡和不变异。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 几种常用的保藏方法：1、传代培养法、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置4C冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。2、载体法、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。二、实验的基本原理二、实验的基本原理 3、悬液法、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4、冷冻法、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。5、真空干燥法、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和L干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在1020C范围内进行真空干燥。二、实验的基本原理二、实验的基本原理试管，棉塞，研体，烧杯，pH试纸，干燥器，高压灭菌锅，干燥箱，培养箱，真空泵，接种针，超净工作台，酒精灯，火柴，冻存管，安瓿管，吸管。甘油，液体石蜡，干冰，培养基等。哈氏弧菌。三、实验材料三、实验材料1 1、斜面保藏法、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置胶塞效果更好），置4C4C冰箱中包藏。冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存及芽孢菌保存2 24 4个月移种一次，酵母菌间隔两个个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。时间短、易被污染。四、实验步骤四、实验步骤 2、液体石蜡保藏法、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端出斜面顶端1CM为准，使菌种与空气隔绝。为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通细菌也可年，普通细菌也可保藏保藏1年左右。年左右。3、穿刺保藏法、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置严，置4冰箱存放。冰箱存放。四、实验步骤四、实验步骤 4、砂土管保藏法（1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10%，加热煮沸30min除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。（）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。(3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10 x100mm的小试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常采用间歇灭菌2-3次)，最后烘干。四、实验步骤四、实验步骤 (4)无菌检查 每10支砂土管随机抽1支，将砂土倒入肉汤培养基中，30培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌后方可使 用。(5)菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2-3ml无菌水(每18x180mm 的试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。(6)分装样品 每支砂土管(注明标记后)加入05ml菌悬液(刚刚使砂土润湿为宜)，用接种针拌匀。(7)干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。(8)保存 置4冰箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。5、冷冻真空干燥法 （1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。（2）菌种培养：细菌芽孢脱落；放，霉孢子丰满。（3）保护剂的配制：配制，灭菌，检查 （4）菌悬液的制备：2-3ml保护剂 （5）分装样品：菌悬液每管0.2ml （6）预冻：程序控温仪降温 （7）冷冻真空干燥：-50下抽真空 （8）取出样品：轻敲松散即达标 （9）第二次干燥：（10）熔封 （11）存活性检测：抽取一管进行存活性检查 （12）保存：4保存四、实验步骤四、实验步骤1、液体石蜡保藏菌种的原理是什么？2、产孢子的菌种一般用哪一种方法保藏？3、细菌用哪种方法保存的时间长面又不易变异？4、经常使用的细菌菌种，应用哪一种方法保藏既好又简便？思考题思考题实验十实验十海水养殖池塘水体中各类细菌海水养殖池塘水体中各类细菌总数的测定总数的测定1.学习水样的采取方法和各类水样细菌总数测定的方法；2.了解水样的平板菌落计数的原则。一、实验目的一、实验目的本实验应用平板菌落计数技术测定水中各类细菌本实验应用平板菌落计数技术测定水中各类细菌的总数。的总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的