第十三章 DNA的生物合成-复制

第十三章第十三章 DNA DNA的生物合成的生物合成-复制复制现代生物学已充分证明，现代生物学已充分证明，核酸核酸是生物遗传的物质是生物遗传的物质基础。基础。除少数除少数RNA病毒外，几乎所有的生物均以病毒外，几乎所有的生物均以DNA为为遗传信息的载体。遗传信息的载体。1958年年，Crick提提出出了了遗遗传传信信息息的的“中中心心法法则则”。DNA通通过过复复制制（replication）将将遗遗传传信信息息由由亲亲代代传传递递给给子子代代；通通过过转转录录（transcription）和和翻翻译译（translation），合合成成特特异异的的蛋蛋白白质质，以以执执行行各各种种生生命命功功能能，使使后后代代表表现现出出与与亲亲代代相相似似的的遗遗传传性性状状。DNA的的复复制制、转转录录和和翻翻译译过过程程就就构构成成了了分子生物学的分子生物学的中心法则中心法则（centraldogma）。）。补补充充：在在某某些些情情况况下下，RNA也也可可以以是是遗遗传传信信息息的的基基本本携携带带者者。如如：RNA病病毒毒能能以以自自身身RNA分分子子为为模模板板进进行行复复制制；致致癌癌RNA病病毒毒还还能能通通过过逆逆转转录录的的方方式式将将遗遗传传信信息息传传递递给给DNA。DNA复制复制转录转录翻译翻译RNA逆转录逆转录蛋白质蛋白质复制（病毒）复制（病毒）第一节第一节DNA的生物合成的生物合成DNA的自我复制的自我复制逆转录作用逆转录作用DNA的损伤、修复和突变的损伤、修复和突变一、一、DNA的自我复制的自我复制（一）（一）半保留复制半保留复制（semiconservativereplication）v双螺旋双螺旋DNA的每一条的每一条DNA链作链作为模板复制一条新链，可产生为模板复制一条新链，可产生两个新的双螺旋两个新的双螺旋DNA分子，这分子，这两个子代两个子代DNA分子都含有一条分子都含有一条新链、一条旧链。新链、一条旧链。v与之相对是与之相对是全保留复制全保留复制：由复：由复制产生的新合成的制产生的新合成的DNA链组成链组成双螺旋分子，而亲本双链得以双螺旋分子，而亲本双链得以保留。保留。动画：动画：DNAreplication1958年年Meselson和和Stahl用用同同位位素素示示踪踪和和密密度度梯梯度度离离心心的的方方法法证证明明了了DNA的的半半保保留留复制复制。该该实实验验首首先先将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含15N的的培培养养基基中中培培养养约约15代代，使使其其DNA中中的的碱碱基基氮氮均均转转变变为为15N。然然后后将将大大肠肠杆杆菌菌移移至至只只含含14N的的培培养养基基中中同同步步培培养养一一代代、二二代代。分分别别提提取取DNA，作作密密度度梯梯度度离离心心，将将具具有有不同密度的不同密度的DNA分离开。分离开。DNA半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明动画：动画：DNA半保留复制实验半保留复制实验按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的的碱基碱基序列一致序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义模板模板底物底物解螺旋酶解螺旋酶单链结合单链结合蛋白蛋白拓扑异构酶拓扑异构酶引物、引物引物、引物酶酶DNA聚合酶聚合酶DNA连接连接酶酶（二）（二）DNA复制的条件复制的条件DNA复制是模板依赖性复制是模板依赖性的，必须要以的，必须要以亲代亲代DNA链作为模板链作为模板。亲代。亲代DNA的两股链解开后，可分的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。别作为模板进行复制。1.模板（模板（template）以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP。2.底物（底物（substrate）dNMP和和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱代表任意一个脱氧核苷酸和脱氧核苷三磷酸。氧核苷三磷酸。解螺旋酶解螺旋酶（helicase），又称，又称解链酶解链酶，是用于，是用于解开解开DNA双链的酶蛋白。双链的酶蛋白。大肠杆菌有大肠杆菌有4中解螺旋酶，即解螺旋酶中解螺旋酶，即解螺旋酶I、II、III和和Rep蛋白，其中蛋白，其中Rep蛋白是最主要的解螺旋酶。蛋白是最主要的解螺旋酶。每解开一对碱基，需消耗每解开一对碱基，需消耗2分子分子ATP，依靠水解，依靠水解ATP提供解链所需要的能量。提供解链所需要的能量。3.解螺旋酶解螺旋酶单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB），），是一些能够与单链是一些能够与单链DNA结合的结合的蛋白质因子。蛋白质因子。4.单链单链DNA结合蛋白结合蛋白使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即单链能够稳定存在，即稳稳定单链定单链DNA，便于其作为模板复制子代，便于其作为模板复制子代DNA；保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。5.DNA拓扑异构酶拓扑异构酶引引 起起 拓拓 扑扑 异异 构构 反反 应应 的的 酶酶 称称 为为 拓拓 扑扑 异异 构构 酶酶（topoisomerase）。DNA复复制制时时模模板板DNA超超螺螺旋旋的的松松弛和复制后超螺旋的再恢复都需要拓扑异构酶的参与。弛和复制后超螺旋的再恢复都需要拓扑异构酶的参与。解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。DNA分子中存在打结，缠绕、连环的现象。分子中存在打结，缠绕、连环的现象。拓扑异拓扑异构酶构酶I切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶II切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过切口链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端，DNA分子分子进入负超螺旋状态。进入负超螺旋状态。按照作用机制，拓扑异构酶可分为按照作用机制，拓扑异构酶可分为I、II两种类型。两种类型。动画：动画：拓扑异构酶拓扑异构酶拓拓扑扑异异构构酶酶II也也叫叫旋旋转转酶酶（gyrase），在在有有ATP功功能能的的情情况况下下，可可引引入入负负超超螺螺旋旋，可可消消除除复复制制叉叉前前进进时时产产生生的的扭扭曲曲张张力力，它它和和拓拓扑扑异异构构酶酶I一一起起共共同同控控制制着着DNA的的拓拓扑结构。扑结构。引物酶引物酶（primase）本质上是一种依赖）本质上是一种依赖DNA的的RNA聚合聚合酶，该酶以酶，该酶以DNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNA短链短链引物引物（primer），以提供自由的），以提供自由的3-OH，使子代，使子代DNA链能够链能够开始聚合。开始聚合。引物酶需组装成引物酶需组装成引发体引发体才能催化才能催化RNA引物的合成。引物的合成。6.引物、引物酶引物、引物酶在在E.coli中中，含含有有DnaB蛋蛋白白、DnaC蛋蛋白白、引引物物酶酶（DnaG蛋蛋白白）和和DNA复复制制起起始始区区域域的的复复合合结结构构被被称称为为引发体引发体（primosome）。许多与许多与DNA复制直接相关的基因被称为复制直接相关的基因被称为dna基基因；不过也有其他不同的名称。因；不过也有其他不同的名称。与复制相关的基因与复制相关的基因：dnaA、dnaB、dnaX相应的基因产物相应的基因产物：DnaA、DnaBDnaXDnaA：辨认复制起始点：辨认复制起始点oriC（originC）；）；DnaB：引发体的组分，具有解螺旋酶的活性；：引发体的组分，具有解螺旋酶的活性；DnaC：引发体组分，帮助：引发体组分，帮助DnaB结合于起点；结合于起点；DnaG：引物酶，合成前体片段的引物。：引物酶，合成前体片段的引物。引物酶催化合成短链引物酶催化合成短链RNA引物分子引物分子 RNA引物的大小，在原核生物中通常为引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷个核苷酸，而在真核生物中约为酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。个核苷酸。RNA引物的碱基引物的碱基顺序，与其模板顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。的碱基顺序相配对。7.DNA聚合酶聚合酶全称：依赖全称：依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase，DDDP），简称：），简称：DNA-pol活性：活性：1.53 的聚合酶活性；的聚合酶活性；2.核酸外切酶活性核酸外切酶活性DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA链的延长链的延长核酸酶核酸酶：作用于核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶，按其作：作用于核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶，按其作用位置分为用位置分为:1.核酸外切酶：核酸外切酶：作用于核酸链的末端（作用于核酸链的末端（3端或端或5端），端），逐个水解下核苷酸。逐个水解下核苷酸。脱氧核糖核酸外切酶：只作用于脱氧核糖核酸外切酶：只作用于DNA；核糖核酸外切酶：只作用于核糖核酸外切酶：只作用于RNA。2.核酸内切酶：核酸内切酶：从核酸分子内部切断从核酸分子内部切断3，5-磷酸二酯键。磷酸二酯键。l限制性内切酶：限制性内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链水解外源双链DNA的核酸内切酶，可用于特异切割的核酸内切酶，可用于特异切割DNA，常作为工具酶。，常作为工具酶。在在原原核核生生物物中中，主主要要的的DNA聚聚合合酶酶有有三三种种，分分别别命命名名为为DNA聚聚合合酶酶I（polI），DNA聚聚合合酶酶II（polII），DNA聚聚合合酶酶III（polIII），这这三三种种酶酶都都属属于于具具有有多多种种酶酶活活性性的的多功能酶。多功能酶。1999年发现年发现DNA聚合酶聚合酶 IV、V。参与参与DNA复制的主要是复制的主要是polIII和和polI。（1）种类和生理功能）种类和生理功能DNA聚聚合合酶酶I：主主要要功功能能是是参参与与DNA修修复复，切切除除RNA引物并填补其留下的空隙缺口。引物并填补其留下的空隙缺口。DNA聚聚合合酶酶II：主主要要功功能能可可能能是是参参与与DNA的的损损伤伤修修复复。（具体不祥）（具体不祥）DNA聚合酶聚合酶III：是是催化大肠杆菌催化大肠杆菌DNA复制主要的酶。复制主要的酶。原核生物中的三种原核生物中的三种DNA聚合酶聚合酶真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶为为了了保保证证遗遗传传的的稳稳定定，DNA的的复复制制必必须须具具有有高高保保真真性性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3对复制过程中出现的错误及时进行校正。对复制过程中出现的错误及时进行校正。（2）DNA复制的保真性（复制的保真性（fidelity）DNA-polI的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-polI的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。合酶活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确，DNA-polI不表现外切酶活性。不表现外切酶活性。DNA连接酶（连接酶（DNAligase）可催可催化两段化两段DNA片段之间磷酸二酯键片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。8.DNA连接酶连接酶DNA连接酶的连接作用连接酶的连接作用DNA连接酶催化的条件是：连接酶催化的条件是：需需一一段段DNA片片段段具具有有3-OH，而而另一段另一段DNA片段具有片段具有5-Pi基；基；未未封封闭闭的的切切口口位位于于双双链链DNA中中，即其中有一条链是完整的；即其中有一条链是完整的；需需要要消消耗耗能能量量，在在原原核核生生物物中中由由NAD+供供能能，在在真真核核生生物物中中由由ATP供供能能。DNA连接酶在复制中起最后接合切口的作用。连接酶在复制中起最后接合切口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。是基因工程的重要工具酶之一。是基因工程的重要工具酶之一。DNA连接酶的作用连接酶的作用（三）（三）原核细胞的原核细胞的DNA复制过程复制过程复制的起始复制的起始链的延长链的延长链的终止链的终止以大肠杆菌染色体（闭环的以大肠杆菌染色体（闭环的DNA分子）复制为例。分子）复制为例。DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制起始点（origin）。在原核生物中，复制起始点通常为一个。大肠杆菌复制原点在原核生物中，复制起始点通常为一个。大肠杆菌复制原点的碱基序列是高度保守的。关键序列是两组短的重复：的碱基序列是高度保守的。关键序列是两组短的重复：3个个13bp的重复序列和的重复序列和4个个9bp的重复序列。的重复序列。1.复制的起始点和方向复制的起始点和方向大肠杆菌复制原点大肠杆菌复制原点OriC中的特殊序列中的特殊序列DNA复制时，以复制起始点复制时，以复制起始点（origin）为中心，向两个）为中心，向两个方向进行解链，形成两个延方向进行解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为伸方向相反的复制叉，称为双向复制双向复制（bidirectionalreplication）。）。但在低等生物中，也可进行但在低等生物中，也可进行单向复制。单向复制。双向复制双向复制E.coli染色体染色体DNA复制：复制时有一个复制起点，双向复制：复制时有一个复制起点，双向展开，形成展开，形成状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复状中间物，直至两个复制叉相遇，这种复制称制称复制。复制。真核细胞基因的线状真核细胞基因的线状DNA上含有多个复制起点，上含有多个复制起点，是多复制子的。是多复制子的。真核细胞真核细胞DNA链较原核生物长很多，聚合速度又链较原核生物长很多，聚合速度又较慢，如何解决？较慢，如何解决？习习惯惯上上把把两两个个相相邻邻DNA复复制制起起始始点点之之间间的的距距离离（或或DNA片片段段）定定为为一一个个复复制制子子（replicon）。复复制制子子是是独独立立完完成成复复制制的的功能单位。功能单位。DNA复复制制时时，在在复复制制的的起起始始点点处处，DNA双双链链部部分分解解开开为为单单链链，形形成成叉叉子子形形状状，这这种种叉叉状状结结构构称称为为复复制制叉叉（replicationfork）。）。复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）大约大约20个各带个各带1个个ATP的的DnaA蛋白结合蛋白结合到到9bp的重复序列上，的重复序列上，DNA缠绕在上面，缠绕在上面，形成起始复合物（形成起始复合物（initialcomplex）。）。HU复合物是类组蛋白，可与复合物是类组蛋白，可与DNA结合，结合，促进起始，受其影响，邻近的促进起始，受其影响，邻近的3个个13bp重复序列被变性成开放复合物，即解链重复序列被变性成开放复合物，即解链而形成一小段单链，所需能量由而形成一小段单链，所需能量由ATP供供给。给。DnaB在在DnaC的帮助下结合于解链区，的帮助下结合于解链区，DnaB借助水解借助水解ATP产生的能量，沿产生的能量，沿DNA链链53方向移动，解开方向移动，解开DNA的双链。的双链。再与引物酶（再与引物酶（DnaG蛋白）组装成引发体蛋白）组装成引发体（primosome），以备引物和），以备引物和DNA的的合成。合成。起始的过程起始的过程DnaB（解旋酶）、（解旋酶）、DnaA和和DnaC参与解链，形成参与解链，形成复制叉复制叉（replicationfork），），SSB结合并稳定解开的单股结合并稳定解开的单股DNA链；引物酶（链；引物酶（DnaG）与上述因子、酶构成）与上述因子、酶构成引发体引发体（primosome），并合成），并合成RNA引物，以引物，以DNA为模板，合成一段短的为模板，合成一段短的RNA片段，从片段，从而获得而获得3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）。解链造成的超螺旋，由）。解链造成的超螺旋，由拓扑异构酶拓扑异构酶II实现超螺旋的实现超螺旋的转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。转型，即把正超螺旋转变为负超螺旋。2.复制的延长复制的延长 复复制制的的延延长长指指在在DNA聚聚合合酶酶催催化化下下，以以35方方向向的的亲亲代代DNA链链为为模模板板，从从53方方向向聚聚合合子子代代DNA链链。其其化化学学本本质质是是dNTP以以dNMP的的方方式式逐逐个个加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。加入引物或延长中的子链上，磷酸二酯键不断生成。在原核生物中，参与在原核生物中，参与DNA复制延长的是复制延长的是DNA聚合酶聚合酶III。复制起点解开后形成复制起点解开后形成2个复制叉，进行双向复制。个复制叉，进行双向复制。当复制叉沿当复制叉沿DNA模板向前移动时，新生成的模板向前移动时，新生成的DNA方向与复方向与复制叉移动方向相同吗？制叉移动方向相同吗？半不连续复制半不连续复制DNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方方向聚合向聚合子代子代DNA链链，即，即模模板板DNA链链的方向必须是的方向必须是35。由于由于DNA分子中两条链的分子中两条链的走向相反，因此当分别以两走向相反，因此当分别以两条亲代条亲代DNA链作为模板聚链作为模板聚合子代合子代DNA链时，子代链链时，子代链的聚合方向也是不同的。的聚合方向也是不同的。半不连续复制半不连续复制在在DNA复复制制时时，以以35方方向向的的亲亲代代DNA链链作作模模板板的的子子代代链链在在复复制制时时是是连连续续进进行行的的，其其子子代代链链的的聚聚合合方方向向为为53，延延伸伸方方向向与与复复制制叉叉的的移移动动方方向向相相同同，这这一一条条链链被称为被称为前导链前导链（leadingstrand）。）。以以53方方向向的的亲亲代代DNA链链为为模模板板的的子子代代链链在在复复制制时时则则是是不不连连续续的的，由由许许多多53的的DNA片片断断组组成成，延延伸伸方方向向与与复复制制叉叉的的移移动动方方向向相相反反，这这条条链链被被称称为为滞滞后后链链（laggingstrand）。）。滞后链上的每一段滞后链上的每一段DNA短链称为称为短链称为称为冈崎片段冈崎片段（Okazakifragment）。）。冈冈崎崎片片段段的的大大小小，在在原原核核生生物物中中约约为为10002000个个核核苷苷酸酸，而而在在真真核核生生物物中中约约为为100个核苷酸。个核苷酸。前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的前导链连续复制而滞后链不连续复制，就是复制的半不连续性半不连续性。前导链先由引物酶在起点处合成一段前导链先由引物酶在起点处合成一段RNA引物，随引物，随后后DNApolIII即在引物上加脱氧核苷酸。前导链的即在引物上加脱氧核苷酸。前导链的合成与复制叉的移动同步。合成与复制叉的移动同步。滞后链的合成是滞后链的合成是分段进行分段进行的，需要不断合成冈崎片的，需要不断合成冈崎片段的段的RNA引物，然后由引物，然后由DNApolIII加入脱氧核苷酸。加入脱氧核苷酸。引发体主要在引发体主要在DNA滞后链上开始滞后链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成部位引导引物酶催化合成RNA引物，在引物引物，在引物RNA的的3-OH末端接下去合成末端接下去合成DNA片段，这就是滞后链不连续合成的开始。片段，这就是滞后链不连续合成的开始。由于由于DNA的两条互补链方向相反，为使滞后链能与前的两条互补链方向相反，为使滞后链能与前导链被同一个导链被同一个DNApolIII不对称二聚体合成，滞后链不对称二聚体合成，滞后链必须绕成一个环状（必须绕成一个环状（loop）。）。DNA聚合酶聚合酶III全酶是一个具有双活性位点的非对称的聚集全酶是一个具有双活性位点的非对称的聚集体，催化前导链和滞后链的同时复制体，催化前导链和滞后链的同时复制（1）去除引物，填补缺口（）去除引物，填补缺口（gap）：）：在复制过程中形成的在复制过程中形成的RNA引物，需引物，需由由DNA聚合酶聚合酶I（53外切酶活外切酶活性）来水解去除；性）来水解去除；RNA引物水解后遗留的缺口，由引物水解后遗留的缺口，由DNA聚合酶聚合酶I（原核生物）或（原核生物）或DNA聚合酶聚合酶（真核生物）催化延长缺口（真核生物）催化延长缺口处的处的DNA，直到剩下最后一个磷酸，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。酯键的缺口。（2）连接冈崎片段：）连接冈崎片段：在在DNA连接酶连接酶的催化下，生成最后的催化下，生成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的来，形成完整的DNA长链。长链。大肠杆菌环状大肠杆菌环状DNA，在，在oriC区染区染色体是双向复制，形成两个背道色体是双向复制，形成两个背道而驰的复制叉，当两个复制叉碰而驰的复制叉，当两个复制叉碰在一起时，复制终止。在一起时，复制终止。两个复制叉最终相遇在有多重拷两个复制叉最终相遇在有多重拷贝的贝的Ter序列的终止区域。序列的终止区域。Ter序序列长列长20bp，是终点利用蛋白，是终点利用蛋白（即（即Tus蛋白）的结合位点。蛋白）的结合位点。Tus蛋白结合在终止位点有助于蛋白结合在终止位点有助于阻挡移动的复制叉。阻挡移动的复制叉。Tus-Ter复合物，能够停止先期复合物，能够停止先期到达的复制叉的推进，等待后期到达的复制叉的推进，等待后期到达的复制叉，使两者总能相遇，到达的复制叉，使两者总能相遇，完成复制。完成复制。3.复制的终止复制的终止 DNA的复制过程的复制过程动画：动画：DNA复制复制复制的起始复制的起始（1）复制原点：复制原点：OriC序列，富含序列，富含AT（2）DNA解链酶解链酶解开双链解开双链DNA（3）SSB结合于结合于DNA单链单链（4）DNA旋转酶旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力扭曲张力（5）DNA引物酶引物酶(在引发体中在引发体中)合成合成RNA引物引物复制的延伸：复制的延伸：（6）DNA聚合酶聚合酶在两条新生链上同时合成在两条新生链上同时合成DNA（7）DNA聚合酶聚合酶切除切除RNA引物，并补上引物，并补上DNA（8）DNAligase连接一个冈崎片段连接一个冈崎片段复制的终止：复制的终止：（9）形成）形成Tus-Ter复合物复合物DNA复制过程小结复制过程小结（四）真核细胞的（四）真核细胞的DNA复制复制（自学）（自学）1970年有人从致癌年有人从致癌RNA病毒中发现了依赖于病毒中发现了依赖于RNA的的DNA聚聚合酶（合酶（RNA-dependentDNApolymerase）或称）或称RNA指导指导的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA-directedDNApolymerase），即逆），即逆转录酶（转录酶（reversetranscriptase，RT），能以），能以RNA为模板为模板合成合成DNA。这与通常转录过程中遗传信息从这与通常转录过程中遗传信息从DNA到到RNA的过程相反，的过程相反，故称为逆转录故称为逆转录（ReverseTranscription）。反转录酶的发）。反转录酶的发现使中心法则更完善。现使中心法则更完善。二、逆转录作用二、逆转录作用DNA转录转录RNA逆转录逆转录复制（病毒）复制（病毒）（一）逆转录酶以病毒（一）逆转录酶以病毒RNA为模板合成为模板合成cDNA逆转录病毒细胞内的逆转录现象：逆转录病毒细胞内的逆转录现象：逆转录酶具有逆转录酶具有:依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶活性活性核糖核酸酶核糖核酸酶H活性（降解活性（降解RNA活活性）性）依赖于依赖于DNA的的DNA聚合酶聚合酶活性活性逆转录酶的作用是以逆转录酶的作用是以dNTP为为底物，以底物，以RNA为模板，合成为模板，合成一条与一条与RNA模板互补的模板互补的DNA单链，这条单链，这条DNA单链叫做单链叫做互互补补DNA（complementaryDNA，cDNA），它与），它与RNA模板形成模板形成RNA-DNA杂交体；杂交体；随后又在逆转录酶的作用下，随后又在逆转录酶的作用下，水解掉水解掉RNA链；链；再以再以cDNA为模板合成第二条为模板合成第二条DNA链。至此，完成由链。至此，完成由RNA指导的指导的DNA合成过程。合成过程。携带逆转录酶的病毒称为逆转录病毒或还原性病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒携带逆转录酶的病毒称为逆转录病毒或还原性病毒，它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠逆转录酶催化合成为模板靠逆转录酶催化合成DNA，随后这种，随后这种DNA环化并整合（环化并整合（integration）到宿主）到宿主细胞的染色体细胞的染色体DNA中去，以前（原）病毒（中去，以前（原）病毒（provirus）的形式在宿主细胞中一代代传）的形式在宿主细胞中一代代传递下去。递下去。逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期动画：动画：逆转录逆转录（二）逆转录病毒引起癌症或艾滋病（二）逆转录病毒引起癌症或艾滋病许多逆转录病毒进入细胞后，通过逆转录整合到宿主的染色许多逆转录病毒进入细胞后，通过逆转录整合到宿主的染色体上并随之同步复制。某些逆转录病毒上带有致癌基因体上并随之同步复制。某些逆转录病毒上带有致癌基因（oncogene），可引起宿主细胞分裂失控和生长异常，形），可引起宿主细胞分裂失控和生长异常，形成肿瘤或癌症。成肿瘤或癌症。获得性免疫缺陷综合症（获得性免疫缺陷综合症（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS），是），是由人类免疫缺陷病毒（由人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染而引起的以感染而引起的以T淋巴细胞免疫功能缺陷为主的一种免疫缺陷病。淋巴细胞免疫功能缺陷为主的一种免疫缺陷病。HIV病毒是一种逆转录病毒，不使宿主细胞发生癌变，而是破坏人体的免疫细胞，病毒是一种逆转录病毒，不使宿主细胞发生癌变，而是破坏人体的免疫细胞，使人体产生免疫缺陷。使人体产生免疫缺陷。治疗：抑制逆转录酶活性是艾滋病治疗研究治疗：抑制逆转录酶活性是艾滋病治疗研究的重要靶酶。的重要靶酶。核苷类似物：竞争性抑制核苷类似物：竞争性抑制HIV-1逆转录酶活性，逆转录酶活性，并在逆转录中终止并在逆转录中终止cDNA链延伸，如链延伸，如3-叠氮叠氮脱氧胸苷（脱氧胸苷（AZT），在逆转录酶合成病毒），在逆转录酶合成病毒DNA时，时，ATZ掺入到病毒掺入到病毒DNA中，由于中，由于AZT无无3-OH，所以使病毒，所以使病毒DNA合成终止。合成终止。逆转录研究的意义逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能。样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注世纪初已注意到的病毒致癌理论。意到的病毒致癌理论。三、三、DNA的损伤、修复和突变的损伤、修复和突变DNA受受到到自自然然因因素素或或诱诱变变因因素素作作用用，结结构构会会出出现现不同程度的损伤或产生突变；不同程度的损伤或产生突变；生生物物体体中中存存在在有有特特殊殊的的修修复复系系统统，可可以以对对某某些些损损伤进行适当的修复。伤进行适当的修复。（1）自发因素：）自发因素：自自发发脱脱碱碱基基：由由于于N-糖糖苷苷键键的的自自发发断断裂裂，引引起起嘌嘌呤呤或或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。自自发发脱脱氨氨基基：胞胞嘧嘧啶啶自自发发脱脱氨氨基基可可生生成成尿尿嘧嘧啶啶，腺腺嘌嘌呤呤自自发发脱脱氨氨基基可可生生成成次次黄黄嘌嘌呤呤。每每日日可可达达几几十十到到几几百百个核苷酸残基。个核苷酸残基。复制错配复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。生频率较低。引起引起DNA损伤的因素损伤的因素（一）（一）DNA损伤损伤（2）物理因素：）物理因素：由由紫紫外外线线、电电离离辐辐射射、X射射线线等等引引起起的的DNA损损伤伤。其其中中，X射射线线和和电电离离辐辐射射常常常常引引起起DNA链链的的断断裂裂，而而紫紫外外线线常常常常引引起起嘧嘧啶啶二二聚聚体体的的形形成成，如如TT，TC，CC等等二二聚聚体体。这这些些嘧嘧啶啶二二聚聚体体由由于于形形成成了了共共价价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。UV胸腺嘧啶二聚体的形成胸腺嘧啶二聚体的形成（3）化学因素：）化学因素：脱脱氨氨剂剂：如如亚亚硝硝酸酸与与亚亚硝硝酸酸盐盐，可可加加速速C脱脱氨基生成氨基生成U，A脱氨基生成脱氨基生成H。烷烷基基化化剂剂：这这是是一一类类带带有有活活性性烷烷基基的的化化合合物物，可可提提供供甲甲基基或或其其他他烷烷基基，引引起起碱碱基基或或磷磷酸酸基基的的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。DNA加加合合剂剂：如如苯苯并并芘芘，在在体体内内代代谢谢后后生生成成四四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。碱碱基基类类似似物物：如如5-FU等等可可掺掺入入到到DNA分分子子中中引引起损伤或突变。起损伤或突变。断链剂：断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引如过氧化物，含巯基化合物等，可引起起DNA链的断裂。链的断裂。（二）（二）DNA修复系统修复系统是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回是对已发生分子改变的补偿措施，使其尽可能回复为原有的天然状态。复为原有的天然状态。光复活（光复活（photoreactivation）切除修复（切除修复（excisionrepair）重组修复（重组修复（recombinationrepair）SOS修复（修复（SOSrepair）修复的主要类型：修复的主要类型：能够修复由于能够修复由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。照射而形成的嘧啶二聚体。修复过程由修复过程由光裂合酶（光裂合酶（photolyase）催化完成。催化完成。（1）光复活（）光复活（photoreactivation）其修复过程为：其修复过程为：1.光光裂裂合合酶酶识识别别嘧嘧啶啶二二聚聚体体并并与之结合形成复合物。与之结合形成复合物。2.在在400500nm可可见见光光照照射射下下，酶酶获获得得能能量量，将将嘧嘧啶啶二二聚体的丁酰环打开。聚体的丁酰环打开。3.光裂合酶从光裂合酶从DNA上解离。上解离。这这是是一一种种广广泛泛存存在在的的修修复复机机制制，可可适适用用于于多多种种DNA损伤的修复。损伤的修复。切切除除修修复复机机制制的的基基本本过过程程是是将将受受损损的的DNA片片段段切切除除，然然后后再再以以对对侧侧链链为为模模板板，重重新新合合成成新新链链进行修复。进行修复。（2）切除修复（）切除修复（excisionrepair）在原核生物中，与在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质包括切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC，以及，以及DNApol和和DNA连接酶。连接酶。UvrA和和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用；而主要起辨认和结合受损部位的作用；而UvrC则主要则主要与受损片段的切除有关。与受损片段的切除有关。原核生物原核生物DNA切除修复的机制切除修复的机制又称为复制后修复。又称为复制后修复。修复时，利用重组蛋白修复时，利用重组蛋白RecA的核酸酶活性，将的核酸酶活性，将另一股完整的亲链与损另一股完整的亲链与损伤缺口相互交换。伤缺口相互交换。在在E.coli中参与重组修复中参与重组修复的酶：的酶：RecA、RecB、RecC、DNApolI和连和连接酶。接酶。（3）重组修复（）重组修复（recombinationrepair）（4）SOS修复（修复（SOSRepair）SOS修复是指修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修错误倾向修复复（errorpronerepair），使细胞有较高的突变率。），使细胞有较高的突变率。属于紧属于紧急修复。急修复。当当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶聚合酶SOS修复酶类，修复酶类，催化空缺部位催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。复带给细胞很高的突变率。DNA碱基序列发生可遗传的永久性改变称为碱基序列发生可遗传的永久性改变称为突变突变（mutation）。）。（三）（三）DNA的突变的突变突变的意义：突变的意义：突变是进化、分化的分子基础；突变是进化、分化的分子基础；突变导致基因型改变；突变导致基因型改变；突变导致死亡；突变导致死亡；突变是某些疾病的发病基础。突变是某些疾病的发病基础。DNA分子上单一碱基的改变称分子上单一碱基的改变称点突变点突变（pointmutation）1.置换（置换（replacement）：）：（1）转换转换（transition）：发生在同型碱基之间，即嘌呤）：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。（2）颠换颠换（transversion）：发生在异型碱基之间，即）：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。突变的分子改变类型突变的分子改变类型镰刀形红细胞贫血病人镰刀形红细胞贫血病人Hb（HbS）亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb（HbA）亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因血红蛋白血红蛋白-亚基的点突变亚基的点突变2.插入（插入（insertion）：）：原来没有的一个碱基或一段核苷酸原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到链插入到DNA大分子中间。大分子中间。3.缺失：缺失：一个碱基或一段核苷酸链从一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。大分子上消失。移码突变移码突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。氨基酸排列顺序发生改变。缺失或插入都可导致缺失或插入都可导致移码突变移码突变（frameshift mutation）。）。谷谷酪酪蛋蛋丝丝5GCAGUACAUGUC丙丙缬缬组组缬缬正常正常5GAGUACAUGUC缺失缺失C缺失引起的移码突变缺失引起的移码突变（）生物遗传信息的流向，只能由）生物遗传信息的流向，只能由DNARNA而不能由而不能由RNADNA。（）解旋酶）解旋酶(helicase)是拓扑异构酶的一种。是拓扑异构酶的一种。（）如果一个完全具有放射性的双链）如果一个完全具有放射性的双链DNA分子在无放射性标记溶液分子在无放射性标记溶液中经过两轮复制，产生的四个中经过两轮复制，产生的四个DNA分子的放射性情况是：分子的放射性情况是：A.其中一半没有放射性其中一半没有放射性B.都有放射性都有放射性C.半数分子的两条链都有放射性半数分子的两条链都有放射性D.一个分子的两条链都有放射性一个分子的两条链都有放射性E.四个分子都不含放射性四个分子都不含放射性()逆转录酶不具备下列何种功能：逆转录酶不具备下列何种功能：A.DNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶B.核糖核酸酶核糖核酸酶HC.RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶D.核酸内切酶核酸内切酶在一个在一个DNA的复制叉中，一条链是连续合成的，称为的复制叉中，一条链是连续合成的，称为，另一，另一条链的合成是不连续的，称为条链的合成是不连续的，称为。写出参与原核生物写出参与原核生物DNA复制所需要的主要酶或蛋白，解释其功能。复制所需要的主要酶或蛋白，解释其功能。习习题题结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！76