第六章 兽药残留检测技术苯并咪唑类

第六章第六章 兽药残留检测技兽药残留检测技术术 苯并咪唑类苯并咪唑类一、概述一、概述l苯并咪唑类苯并咪唑类(Benzimidazoles，BEN)是一种驱虫剂是一种驱虫剂,被广被广泛应用于动物寄生虫的治疗泛应用于动物寄生虫的治疗,同时还作为杀霉菌剂应用于同时还作为杀霉菌剂应用于庄稼存贮和运输期间庄稼存贮和运输期间,使其免受霉菌污染。使其免受霉菌污染。l自自20世纪世纪60年代早期年代早期,美国合成噻苯达唑以来美国合成噻苯达唑以来,已合成数已合成数百种苯并咪唑类驱虫药。百种苯并咪唑类驱虫药。噻苯达唑噻苯达唑作为第一个商品化的作为第一个商品化的苯并咪唑类药物苯并咪唑类药物,曾广泛用于世界各地曾广泛用于世界各地,用以驱除各种动用以驱除各种动物物(如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等如牛、绵羊、山羊、猪、马、禽等)胃肠道寄生虫。胃肠道寄生虫。用于治疗时可一次内服给药用于治疗时可一次内服给药,也可以低浓度置于饲料中长也可以低浓度置于饲料中长期使用做预防用。期使用做预防用。l由于噻苯达唑驱虫作用不强由于噻苯达唑驱虫作用不强,用药剂量较大用药剂量较大,且驱虫谱不广且驱虫谱不广,目前目前,已逐渐为其他苯并咪唑类药物已逐渐为其他苯并咪唑类药物阿苯达唑、奥芬阿苯达唑、奥芬达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。达唑、芬苯达唑、甲苯达唑、氟苯达唑等所取代。l本类药物的特点是驱虫谱广本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好驱虫效果好,毒性低毒性低,甚至还有甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。一定的杀灭幼虫和虫卵作用。l苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期唑对妊娠早期(约妊娠三周约妊娠三周)绵羊的胎儿有绵羊的胎儿有致畸作用致畸作用,因此用因此用于孕畜时应特别慎重。于孕畜时应特别慎重。苯并咪唑类药物的结构式苯并咪唑类药物的结构式l苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族苯并咪唑类药物是一个庞大的化学家族,包括噻苯包括噻苯达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类达唑的同系物、苯并咪唑氨基甲酸酯类,以及苯并以及苯并咪唑环上的各种侧链取代物。咪唑环上的各种侧链取代物。苯并咪唑氨基甲酸酯类苯并咪唑氨基甲酸酯类苯并咪唑环苯并咪唑环噻苯达唑的同系物噻苯达唑的同系物苯并咪唑类药物苯并咪唑类药物l1、噻苯达唑噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)l2、坎苯达唑、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)l3、苯硫脲酯、苯硫脲酯(Thiophanate)l4、非班太尔非班太尔(Febantel,FEB)l5、芬苯达唑、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ)l6、奥芬达唑、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)l7、阿苯达唑阿苯达唑(Albendazole,ABZ)l8、甲苯达唑甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)l9、奥苯达唑、奥苯达唑(Oxibendazole,OXI)l10、氟苯达唑、氟苯达唑(Flubendazole,FLU)l11、三氯苯达唑、三氯苯达唑(Triclabendazole,TCB)1、噻苯达唑、噻苯达唑(Thiabendazole,TBZ)l别名噻菌灵、特克多、涕必灵、硫苯唑、噻苯咪唑、噻别名噻菌灵、特克多、涕必灵、硫苯唑、噻苯咪唑、噻唑苯咪唑苯咪,为白色至奶黄色粉末为白色至奶黄色粉末,无臭无臭,味微苦味微苦,微溶于水或乙微溶于水或乙醇醇,易溶于稀盐酸或稀碱液中易溶于稀盐酸或稀碱液中,不溶于氯仿或苯中。不溶于氯仿或苯中。l广谱驱虫药广谱驱虫药,可能是抑制虫体的延胡索酸还原酶。可能是抑制虫体的延胡索酸还原酶。l对动物多种胃肠道线虫均有驱除效果对动物多种胃肠道线虫均有驱除效果,对成虫效果好对成虫效果好,对对未成熟虫体也有一定作用。未成熟虫体也有一定作用。l内服吸收快内服吸收快,广泛分布于各组织中广泛分布于各组织中。猪、羊、牛给药后。猪、羊、牛给药后27h达血药峰浓度。达血药峰浓度。在体内迅速代谢成在体内迅速代谢成5-羟噻苯达唑羟噻苯达唑(5-OH-TBZ)l犊牛犊牛用药后用药后,肾肾中药物浓度中药物浓度最高最高,但但肝的滞留期比肾长肝的滞留期比肾长;噻噻苯达唑、苯达唑、5-羟噻苯达唑在肝和肾中的残留量分别为羟噻苯达唑在肝和肾中的残留量分别为57g/kg、581g/kg和和153g/kg、19g/kg；休药；休药6天只有天只有肝中有肝中有5-羟噻苯达唑残留量羟噻苯达唑残留量(63g/kg)；噻苯达唑在肌肉；噻苯达唑在肌肉和脂肪中未被检出，但和脂肪中未被检出，但5-羟噻苯达唑在用药后羟噻苯达唑在用药后1日内可日内可检出检出,其残留量分别为肌肉其残留量分别为肌肉54g/kg、脂肪、脂肪64g/kg。l奶牛奶牛用药后用药后12h,噻苯达唑、噻苯达唑、5-羟噻苯达唑在奶中的残留羟噻苯达唑在奶中的残留量分别为量分别为5007g/kg和和168g/kg，84h时分别为时分别为20g/kg和和25g/kg。2、坎苯达唑、坎苯达唑(Cambendazole,CAM)l别名噻苯达唑酯别名噻苯达唑酯,为广谱驱虫药。为广谱驱虫药。l对动物肠道寄生虫和肺蠕虫有明显作用。制剂有混悬剂、对动物肠道寄生虫和肺蠕虫有明显作用。制剂有混悬剂、糊剂或饲料粉的形式。糊剂或饲料粉的形式。l内服后在内服后在体内迅速代谢体内迅速代谢,原药和代谢物主要经原药和代谢物主要经胆汁排泄胆汁排泄,尿尿中占给药量的中占给药量的25%,其中原形的不足其中原形的不足5%。l牛牛内服后内服后30日内日内,肝中可检出残留物肝中可检出残留物,其中一部分为其中一部分为结合态结合态。l坎苯达唑有坎苯达唑有致畸性致畸性,因此休药期要求适当的延长。因此休药期要求适当的延长。l牛牛休药期休药期21天天,羊羊休药期休药期28天。天。3、苯硫脲酯、苯硫脲酯(Thiophanate)l别名硫菌灵、硫苯尿酯别名硫菌灵、硫苯尿酯,属苯并咪唑的前体药物属苯并咪唑的前体药物,即在动物体即在动物体内转变成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而发挥驱虫作用。内转变成苯并咪唑氨基甲酸甲酯而发挥驱虫作用。l本品为微黄棕色结晶性粉末本品为微黄棕色结晶性粉末,在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮在水、甲醇、乙酸乙酯和丙酮中微溶中微溶,在环己酮中易溶。在环己酮中易溶。l动物制剂有混悬剂和丸剂两种动物制剂有混悬剂和丸剂两种,或用作饲料添加剂。或用作饲料添加剂。l广谱驱虫药广谱驱虫药,对大多数动物的胃肠线虫成虫及幼虫均有良好对大多数动物的胃肠线虫成虫及幼虫均有良好效果。效果。l内服吸收快而完全内服吸收快而完全,8h达血药峰浓度。用药后达血药峰浓度。用药后24h,几乎能从几乎能从所有组织器官中所有组织器官中(特别是肝、肾特别是肝、肾)测出药物。用药后测出药物。用药后72h内内,大大部分药量经粪和尿排出体外。部分药量经粪和尿排出体外。l畜禽用药后畜禽用药后,残留量在肝和肾中较高残留量在肝和肾中较高,而其他可食组织中相对较低。而其他可食组织中相对较低。l绵羊绵羊一次内服一次内服100mg/kg后休药后休药1日日,肝、肾、肌肉和脂肪中的残留量分肝、肾、肌肉和脂肪中的残留量分别为别为930g/kg、1060g/kg、670g/kg和和2930g/kg;休药休药3日后均低于日后均低于100g/kg。l犊牛犊牛一次内服一次内服100mg/kg后休药后休药7日日,肝、肾和肌肉中的残留量均低于肝、肾和肌肉中的残留量均低于200g/kg。l猪猪一次内服一次内服75mg/kg后休药后休药1日日,肝、肾、肌肉和皮肝、肾、肌肉和皮/脂肪中的平均残留脂肪中的平均残留量分别为量分别为5550g/kg、6600g/kg、2600g/kg和和16200g/kg;休药休药3日分日分别为别为180g/kg、100g/kg、肾肾脂肪脂肪肌肉。肌肉。5、芬苯达唑、芬苯达唑(Fenbendazole,FBZ)l别名硫苯达唑、苯硫达唑，无臭无味，别名硫苯达唑、苯硫达唑，无臭无味，在二甲基亚砜中溶在二甲基亚砜中溶解，在甲醇中微溶解，在甲醇中微溶,在水中不溶在水中不溶,在冰醋酸中溶解在冰醋酸中溶解。l为广谱、高效、低毒的新型苯并咪唑类驱虫药。为广谱、高效、低毒的新型苯并咪唑类驱虫药。l它不仅对动物胃肠道线虫成虫、幼虫有高度驱虫活性它不仅对动物胃肠道线虫成虫、幼虫有高度驱虫活性,而而且对网尾线虫、矛形双腔吸虫、片形吸虫和绦虫亦有较佳且对网尾线虫、矛形双腔吸虫、片形吸虫和绦虫亦有较佳效果。效果。l芬苯达唑在国外芬苯达唑在国外,不仅用于各种动物不仅用于各种动物,甚至还有野生动物的甚至还有野生动物的专用制剂。专用制剂。l由于芬苯达唑由于芬苯达唑溶解度较低溶解度较低,因而给动物因而给动物内服时吸收极少内服时吸收极少,如如给绵羊、牛、猪内服因吸收少给绵羊、牛、猪内服因吸收少,经粪便排泄的原形药约占经粪便排泄的原形药约占44%50%,而经尿排泄的不足而经尿排泄的不足1%。l吸收后芬苯达唑在动物体内迅速吸收后芬苯达唑在动物体内迅速代谢代谢为为芬苯达唑亚砜芬苯达唑亚砜(FBZ-SO)即奥芬达唑即奥芬达唑(OFZ)、芬苯达唑砜芬苯达唑砜(FBZ-SO2)、芬苯达唑芬苯达唑-2-氨砜氨砜(FEB-NH2-SO2)和一些少量的其他代谢和一些少量的其他代谢物。物。l原药和代谢物主要经胆汁排泄原药和代谢物主要经胆汁排泄。在绵羊体内的代谢产物。在绵羊体内的代谢产物,由胆汁分泌后可再经肝肠循环。由胆汁分泌后可再经肝肠循环。l猪猪用药用药5mg/kg后休药后休药7天天,肝中母药残留量为肝中母药残留量为0.28mg/kg,其他无组织残留。其他无组织残留。l牛牛用药用药10mg/kg后休药后休药2天天,肝、肾、肌肉和脂肪中的母药肝、肾、肌肉和脂肪中的母药残留量分别为残留量分别为8.4mg/kg、1.04mg/kg、0.47mg/kg和和0.95mg/kg;休药休药7天天,只在肝中能检测到残留量只在肝中能检测到残留量0.67mg/kg。l奶牛奶牛内服内服10mg/kg后后,1224h奶中芬苯达唑浓度达峰值奶中芬苯达唑浓度达峰值,休休药药7天降至天降至100g/kg;12h芬苯达唑亚砜浓度达峰值芬苯达唑亚砜浓度达峰值,然后迅然后迅速下降速下降,96h时未检出时未检出;48h芬苯达唑砜浓度达峰值芬苯达唑砜浓度达峰值,96h时未时未检出。检出。l鳟鱼鳟鱼内服后内服后,在体内部分代谢为在体内部分代谢为奥芬达唑奥芬达唑,并蓄积于并蓄积于鱼皮鱼皮中。中。母药和奥芬达唑的消除期分别为母药和奥芬达唑的消除期分别为96h和和24h。芬苯达唑砜芬苯达唑砜代谢物在鱼体内几乎没有代谢物在鱼体内几乎没有。6、奥芬达唑、奥芬达唑(OxfendazoIe,OFZ)l别名磺唑氨酯别名磺唑氨酯,为白色或类白色粉末为白色或类白色粉末,有轻微的特殊气味有轻微的特殊气味,在甲醇、丙酮、在甲醇、丙酮、氯仿、乙醚中微溶氯仿、乙醚中微溶,在水中不溶。在水中不溶。l奥芬达唑为芬苯达唑的衍生物奥芬达唑为芬苯达唑的衍生物,属广谱、高效、低毒的新型抗蠕虫药属广谱、高效、低毒的新型抗蠕虫药,其驱虫谱大致与芬苯达唑相同其驱虫谱大致与芬苯达唑相同,但驱虫活性更强。但驱虫活性更强。l奥芬达唑与阿苯达唑同为苯并咪唑类中奥芬达唑与阿苯达唑同为苯并咪唑类中,属属内服吸收量较多内服吸收量较多的驱虫药。的驱虫药。但反刍兽吸收量明显低于单胃动物但反刍兽吸收量明显低于单胃动物,而且舍饲反刍兽比放牧时吸收量而且舍饲反刍兽比放牧时吸收量多。多。l牛牛用药后用药后1018天天,牛肝中残留量从牛肝中残留量从55.5g/kg降低至降低至10g/kg。l羊羊用药后用药后1024天天,羊肝中残留量从羊肝中残留量从476g/kg降低至降低至12g/kg。l奶牛奶牛内服内服2.5mg/kg后后1天天,奶中的残留量为最高奶中的残留量为最高(0.49mg/kg),休药休药8日则日则降低至降低至0.005mg/kg;在在4872h内奶中主要代谢物为内奶中主要代谢物为芬苯达唑砜芬苯达唑砜。休药。休药期为牛期为牛11天、羊天、羊21天天,产奶期禁用。产奶期禁用。7、阿苯达唑、阿苯达唑(Albendazole,ABZ)l别名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑别名丙硫苯咪唑、丙硫苯咪唑,为白色或类白色粉末为白色或类白色粉末,无无臭臭,无味无味,在在丙酮丙酮或或氯仿氯仿中中微溶微溶,在在乙醇乙醇中凡乎中凡乎不溶不溶,在在水中水中不溶不溶,在在冰醋酸冰醋酸中中溶解溶解。l高效广谱驱虫药高效广谱驱虫药,系苯并咪唑类药物中驱虫谱较广、杀虫系苯并咪唑类药物中驱虫谱较广、杀虫作用最强的一种作用最强的一种,对各种线虫、绦虫均有高度活性对各种线虫、绦虫均有高度活性,对虫对虫卵发育也有显著抑制作用。卵发育也有显著抑制作用。l因不溶于水因不溶于水,故在肠道内吸收缓慢。故在肠道内吸收缓慢。l原药在动物体内的原药在动物体内的主要代谢产物主要代谢产物为阿苯达唑亚砜为阿苯达唑亚砜(ABZ-SO)、阿苯达唑砜、阿苯达唑砜(ABZ-SO2)和阿苯达唑和阿苯达唑-2-氨砜氨砜(ABZ-NH2-SO2),前者为杀虫的活性成分。在体内分布量依次前者为杀虫的活性成分。在体内分布量依次为肝、肾和肌肉占内服后血药达峰时间为为肝、肾和肌肉占内服后血药达峰时间为24h,并且持并且持续续1524h。l原药与亚砜代谢物在血中的浓度极低原药与亚砜代谢物在血中的浓度极低,半衰期为半衰期为8.510.5h。24h内约内约85%的给药量经的给药量经肾肾排出排出,13%随随粪粪排排出。出。l牛和羊残留消除研究表明牛和羊残留消除研究表明,用药后数日内组织中的代谢物用药后数日内组织中的代谢物浓度变化很大浓度变化很大,刚开始时主要为刚开始时主要为亚砜代谢物亚砜代谢物,接着是接着是砜类砜类和和氨砜类氨砜类代谢物。用药后在日内代谢物。用药后在日内牛肝牛肝和和牛肾牛肾中的残留物中的残留物有有95%为为结合态结合态,但但羊组织羊组织中中结合态代谢物很少结合态代谢物很少。l奶牛内服奶牛内服10mg/kg后后,12h奶中亚砜代谢物残留量达峰值奶中亚砜代谢物残留量达峰值,然后迅速下降然后迅速下降,36h时未被检出时未被检出;24h砜类代谢物残留量达砜类代谢物残留量达峰值峰值,但消除缓慢但消除缓慢,需需156h可排净可排净;氨砜代谢物在奶中的量氨砜代谢物在奶中的量很低很低,36h达峰值达峰值,消除期消除期180h。其他代谢物在服后。其他代谢物在服后24h达达峰值峰值,48h时低于方法的检测限时低于方法的检测限,但消除期为但消除期为156h。8、甲苯达唑、甲苯达唑(Mebendazole,MBZ)l别名甲苯咪唑别名甲苯咪唑,为白色、类白色或微黄色结晶性粉末为白色、类白色或微黄色结晶性粉末,在在甲酸中易溶甲酸中易溶,在冰醋酸中略溶在冰醋酸中略溶,在丙酮或氯仿中极微溶解在丙酮或氯仿中极微溶解,在水中不溶在水中不溶。l为广谱驱虫药为广谱驱虫药,不仅对动物多种胃肠线虫有高效不仅对动物多种胃肠线虫有高效,而且对而且对某些绦虫亦有良效某些绦虫亦有良效,并且是为数不多治疗旋毛虫的良药之并且是为数不多治疗旋毛虫的良药之一。一。l甲苯达唑早在甲苯达唑早在20世纪世纪80年代已广泛用于世界各国的医学年代已广泛用于世界各国的医学和兽医临床。和兽医临床。l内服后胃肠道吸收差内服后胃肠道吸收差(5%10%),吸收后迅速分布于血浆、吸收后迅速分布于血浆、肝、肺等肝、肺等,血药达峰时间为血药达峰时间为24h,半衰期半衰期2.55.5h。l在动物肝内很少代谢在动物肝内很少代谢,代谢物为极性很强的代谢物为极性很强的羟基羟基(MBZ-OH)和氨基代谢物和氨基代谢物(MBZ-NH2)。在。在2448h内经粪便排泄内经粪便排泄的的原形药物原形药物约占约占80%左右左右,经尿排泄的约为经尿排泄的约为5%10%。吸。吸收后药物收后药物,仅有极少量以脱羧基衍生物形式排泄。仅有极少量以脱羧基衍生物形式排泄。二、组织中苯并咪唑残留和限量二、组织中苯并咪唑残留和限量l苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与苯并咪唑类药物在动物体内的残留物与药物本身药物本身有关外有关外,还与还与给药途径给药途径、靶组织靶组织和和消除期消除期有关。有关。l标志残留标志残留定义为定义为母体药物及其主要代谢产物的总和母体药物及其主要代谢产物的总和。l阿苯达唑阿苯达唑：ABZ用药后用药后,在停药初期在停药初期,残留物主要为残留物主要为ABZ-SO和和ABZ-SO2;而在较长的停药期而在较长的停药期,主要残留物为主要残留物为ABZ-NH2-SO2,因此标志残留为因此标志残留为ABZ-SO、ABZ-SO2和和ABZ-NH2-SO2 的总和的总和,以以ABZ计。计。l对对FEB、FBZ和和OFZ,标志残留为标志残留为FBZ、OFZ(FBZ-SO)，和和FBZ-SO2的总和的总和,以以FBZ-SO2计。药物消除研究表明计。药物消除研究表明,OFZ和和FBZ-SO2是组织中最常见的残留物是组织中最常见的残留物。l在在蛋蛋中中,氟苯达唑氟苯达唑FLU标志残留主要为标志残留主要为母体药物母体药物,而在鸟而在鸟类和猪可食组织中标志残留为类和猪可食组织中标志残留为FLU和和FLU-HMET,因此因此以以FLU和和FLU-HMET的总量来定义的总量来定义FLU的标志残留。的标志残留。l甲苯达唑甲苯达唑MBZ标志残留定义为标志残留定义为MBZ、MBZ-OH和和MBZ-NH2的总和的总和,以以MBZ计。残留消除研究表明计。残留消除研究表明,MBZ-NH2和和MBZ-OH是组织中最持久的残留物是组织中最持久的残留物,对对最高残留限最高残留限量量(MRL)的影响最大。的影响最大。l噻苯达唑噻苯达唑TBZ标志残留定义为标志残留定义为TBZ和和5-OH-TBZ的总和。的总和。在动物可食组织中在动物可食组织中,TBZ的母体药物是最常见的残留物的母体药物是最常见的残留物,但在牛奶中但在牛奶中,5-OH-TBZ的硫酸酯结合物的硫酸酯结合物为主要残留。为主要残留。l三氯苯达唑三氯苯达唑TCB标志残留定义为标志残留定义为TCB、TCB-SO和和TCB-SO2的总和。的总和。lTCB禁止用于泌乳期动物禁止用于泌乳期动物,由于由于TCB-SO2消除时间长消除时间长,因因此它可以作为残留监测的目标化合物。此它可以作为残留监测的目标化合物。l奥苯达唑奥苯达唑OXI标志残留为标志残留为母体药物母体药物。l其他苯并咪唑类药物其他苯并咪唑类药物,如如CAM、LUX、PAR和和BEN,在欧在欧盟禁止用于动物源食品盟禁止用于动物源食品,因此欧盟未规定因此欧盟未规定MRL值。值。l部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)。部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量部分苯并咪唑类药物的标志残留和最高残留限量(MRL)三、样品处理三、样品处理l苯并咪唑类分子含咪唑环结构苯并咪唑类分子含咪唑环结构,两个氮原子具有酸碱两性两个氮原子具有酸碱两性,在适当的在适当的pH条件下条件下,分子可以质子化分子可以质子化(pKa约约56)或去质或去质子化子化(pKa约约12)。l在酸性或碱性条件下在酸性或碱性条件下,大部分苯并咪唑类药物可解离大部分苯并咪唑类药物可解离,易溶易溶于水性溶剂于水性溶剂,并被提取并被提取,然后然后调节调节pH值使呈中性值使呈中性,用乙酸乙用乙酸乙酯抽提酯抽提。l由于由于5-OH-TBZ在在pH值范围内都能电离值范围内都能电离,易溶于酸性或碱易溶于酸性或碱性的水溶液性的水溶液,乙酸乙酯很难将其抽提出来。乙酸乙酯很难将其抽提出来。l对于对于CAM、TCB和和TCB代谢产物代谢产物,它们都有两个或更多的它们都有两个或更多的pKa,因此溶剂提取时因此溶剂提取时,控制溶液的控制溶液的pH值尤为重要值尤为重要。l三氯苯达唑三氯苯达唑(TCB)、三氯苯达唑硫化物、三氯苯达唑硫化物(TCB-SO)、TCB-SO2和和CAM分别在分别在pH7.310.9、5.09.0、3.88.0和和7.411.1呈中性呈中性,因此因此,只有当只有当pH7.48.0时时,所有这些分子都所有这些分子都呈呈中性中性。l大部分苯并咪唑类药物在大部分苯并咪唑类药物在pH8时都呈中性时都呈中性,当预测某些苯当预测某些苯并咪唑类药物的并咪唑类药物的pKa约为约为8时时,这时欲对这些组分同时提取这时欲对这些组分同时提取变得相当困难。变得相当困难。l但也有例外但也有例外,如如MBZ-NO2和和OXI在在pH8.6和和8.3,以非电离以非电离形式存在。形式存在。1、水解、水解l肝肝和和奶奶样中苯并咪唑类药物与样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取不易被有机溶剂提取,可先将样品可先将样品水解水解后再提取后再提取游离的药物。游离的药物。l常用的水解方法有常用的水解方法有酸水解酸水解和和酶水解酶水解两种。两种。l酸水解酸水解通常使用无机酸通常使用无机酸,例如用例如用4moL/L盐酸于盐酸于80110,在在14h即可完成水解。即可完成水解。l酸水解具有简便、快速、水解完全等优点酸水解具有简便、快速、水解完全等优点,因而因而被广泛采用。被广泛采用。酶水解酶水解l酶水解酶水解通常使用通常使用-葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶或或芳基硫酸酯芳基硫酸酯酶酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。后者可水解硫酸酯结合物。l由于肝样中通常存在上述两种结合物由于肝样中通常存在上述两种结合物,常使常使用用-葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯混合酶芳基硫酸酯混合酶,控制控制pH4.57.0,于一定温度下孵育于一定温度下孵育1872h。l与酸水解相比与酸水解相比,酶水解比较温和酶水解比较温和,一般不会引一般不会引起药物的分解起药物的分解,但有时水解不完全和实验费但有时水解不完全和实验费用高是该法的缺点。用高是该法的缺点。lTocco等发现等发现TBZ在在尿尿和和奶奶中的代谢产物主要是中的代谢产物主要是5-OH-TBZ与葡糖苷酸和硫酸酯结合物与葡糖苷酸和硫酸酯结合物,结合物用结合物用-葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/硫酸酯酶或酸硫酸酯酶或酸(6mol/L盐酸回馏盐酸回馏1h)水解水解,释放出游离的释放出游离的5-OH-TBZ。lChuckwudebe等对等对TBZ在在蛋鸡蛋鸡和和奶牛奶牛中代谢产物进行了中代谢产物进行了研究研究,发现结合物主要是发现结合物主要是硫酸酯结合物硫酸酯结合物。lMarkus等对肝样中的等对肝样中的ABZ及其相关代谢物的结合物用及其相关代谢物的结合物用酸解方法进行水解酸解方法进行水解,释放出游离的释放出游离的ABZ-NH2-SO2。lCoulet等对组织中的等对组织中的TBZ蛋白结合物用蛋白结合物用碱解方法水解碱解方法水解。2、提取及净化、提取及净化l液液-液萃取液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的是提取苯并咪唑类药物的最常用方法最常用方法,通通常将水性溶液调节至适当的常将水性溶液调节至适当的pH值值,用水不相溶的有机溶用水不相溶的有机溶剂提取。剂提取。l用酸溶液提取时用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。即包括了样品的水解过程。l由于苯并咪唑类药物的极性和由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大差异很大,因此因此多残留多残留提取相当困难提取相当困难,即使对单一药物即使对单一药物,母药及其代谢产物的同母药及其代谢产物的同时提取亦难。时提取亦难。例如例如lMBZ及其两个代谢产物及其两个代谢产物MBZ-OH和和MBZ-NH2,由于由于MBZ和和MBZ-NH2呈碱性呈碱性,pKa分别是分别是3.5和和5.5,在在pH7.5时时,这两种化合物不被电离这两种化合物不被电离;MBZ-OH含酸性的含酸性的-OH,其其pKa为为9.8,在在pH10000),但干扰少但干扰少,吸收峰稳定、灵敏度足够吸收峰稳定、灵敏度足够,应用较多。应用较多。l对于本身有荧光的化合物对于本身有荧光的化合物,如阿苯达唑及其代谢物和噻苯如阿苯达唑及其代谢物和噻苯达唑及其代谢物达唑及其代谢物,可用可用荧光检测荧光检测,内源性杂质干扰小、检内源性杂质干扰小、检测灵敏度高。测灵敏度高。l光电二极管阵列检测光电二极管阵列检测(PDA)可提供化合物的吸收光谱图可提供化合物的吸收光谱图(200700nm),与标准品谱图进行对照与标准品谱图进行对照,可对样品作出初步可对样品作出初步的定性判断。的定性判断。lPDA检测器价格低廉、应用广检测器价格低廉、应用广,但在专一性和灵敏度上欠但在专一性和灵敏度上欠高高,特别在检测动物组织中痕量的药物残留时有一定局限特别在检测动物组织中痕量的药物残留时有一定局限性。性。l质谱检测质谱检测(MS)特别是串联质谱检测特别是串联质谱检测(MS/MS)作为通用作为通用型检测器型检测器,具有高灵敏和高选择性的优点具有高灵敏和高选择性的优点,能提供化合物能提供化合物的结构信息的结构信息,予以定性确证予以定性确证,在残留分析中的应用日趋广在残留分析中的应用日趋广泛。泛。lLC-MS通常采用短柱通常采用短柱(150mm)分离分离,色谱柱平衡时间短色谱柱平衡时间短,适合样品的高通量分析。适合样品的高通量分析。lBlanchflower等采用等采用LC-MS法测定法测定FBZ和和OFZ残留残留,发现等发现等度洗脱比梯度洗脱重复性好。度洗脱比梯度洗脱重复性好。lCannavan等采用梯度洗脱来分离等采用梯度洗脱来分离TBZ和和5-OH-TBZ,流动流动相由乙腈和相由乙腈和0.1mol/L醋酸铵组成。醋酸铵组成。lBalizs建立了建立了15种苯并咪唑残留测定的种苯并咪唑残留测定的LC-MS/MS方法方法,采采用细直径柱用细直径柱(2.1mm)分离分离,流动相流速为流动相流速为0.040.2mL/min,苯苯并咪唑类药物在并咪唑类药物在6min内出峰内出峰,但没有达到完全分离。但没有达到完全分离。lDe Ruycke等建立了等建立了LC-MS/MS法测定蛋和肌肉组织中苯法测定蛋和肌肉组织中苯并咪唑残留并咪唑残留,包括包括FLU、FLU-HMET和和FLU-RMET。后来。后来,他们还检测了牛奶中左旋咪唑和他们还检测了牛奶中左旋咪唑和7种苯并咪唑类药物的残种苯并咪唑类药物的残留。留。