第三章细胞破碎

第三章细胞破碎第三章细胞破碎生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程不同类型的细胞分泌目标产物的类型不同类型的细胞分泌目标产物的类型n动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中。在培养液中。n植物细胞：多为植物细胞：多为胞内胞内产物。产物。n微生物：大多数小分子代谢产物分泌在微生物：大多数小分子代谢产物分泌在胞外胞外；大；大多数大分子产物和基因重组产物为多数大分子产物和基因重组产物为胞内胞内产物，如产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。等均为胞内产物。n对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。以释放，才能进一步提取。主要内容主要内容n3.1 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构n3.2 细胞破碎技术的分类细胞破碎技术的分类n3.3 常用破碎技术常用破碎技术n3.4 破碎技术的发展方向破碎技术的发展方向n3.5 破碎率的测定破碎率的测定3.1 细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构n微生物细胞的外围通常包括微生物细胞的外围通常包括细胞壁细胞壁和和细胞膜细胞膜。n细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能；免受机械损伤的功能；n细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些物质的交换渗透作用。制胞内外一些物质的交换渗透作用。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。细菌的细胞壁细菌的细胞壁n几几乎乎所所有有细细菌菌的的细细胞胞壁壁都都是是由由坚坚固固骨骨架架肽肽聚聚糖糖组组成。成。nG+细胞壁结构与细胞壁结构与G-有很大不同。有很大不同。n破破碎碎细细菌菌的的主主要要阻阻力力是是来来自自于于肽肽聚聚糖糖的的网网状状结结构构，其其网网结结构构的的致致密密程程度度和和强强度度取取决决于于肽肽聚聚糖糖上上所所存存在在的的肽肽键键的的数数量量和和其其交交联联的的程程度度，如如果果交交联联程程度度大，则网结构就致密。大，则网结构就致密。酵母菌的细胞壁酵母菌的细胞壁主主要要成成分分：葡葡聚聚糖糖与与甘甘露露聚聚糖糖以以及及蛋蛋白白质质等等，比比革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌稍稍厚厚，面面包包酵酵母母的的细细胞胞壁壁厚厚度度约约为为70 nm，而而且且其其厚厚度度随随菌菌龄龄增增加加而而增增加加。有有可可能能仅仅有有一一部部分分厚厚度度对对酵酵母母细细胞胞壁壁的的刚刚性性和和强强度度起起重重要作用。要作用。n结结构构：最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状状，中中间间是是一一层层糖糖蛋蛋白白，再再外外面面是是网网状状结结构构的的甘露聚糖甘露聚糖。n破破碎碎阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交联的紧密度和壁厚度交联的紧密度和壁厚度其他真菌的细胞壁其他真菌的细胞壁n大多数真菌的细胞壁主要由大多数真菌的细胞壁主要由多糖多糖组成，其次还含组成，其次还含有较少量的有较少量的蛋白质和脂类蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由是由几丁质和葡聚糖几丁质和葡聚糖构成。构成。n真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。所以强度有所提高。细胞壁的组成与结构细胞壁的组成与结构细胞壁的结构和细胞破碎细胞壁的结构和细胞破碎n破碎时必须克服的主要阻力是破碎时必须克服的主要阻力是网状结构的共价键网状结构的共价键。n细细胞胞的的大大小小和和形形状状以以及及聚聚合合物物的的交交联联程程度度都都是是影影响破碎难易程度的重要因素。响破碎难易程度的重要因素。n壁壁结结构构不不仅仅取取决决于于遗遗传传信信息息也也取取决决于于生生长长环环境境，真真菌菌的的壁壁结结构构还还随随发发酵酵罐罐中中混混合合的的机机械械作作用用而而变变化。化。n虽虽然然通通过过改改变变遗遗传传密密码码或或环环境境因因素素能能够够改改变变细细胞胞壁壁的的结结构构，但但还还没没有有实实验验证证明明，该该法法能能提提高高对对机机械械破破碎碎的的敏敏感感性性，也也不不能能够够预预测测各各种种微微生生物物对对机机械破碎的相对阻力。械破碎的相对阻力。n在在用用酶酶法法或或化化学学法法来来溶溶解解细细胞胞壁壁时时，细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成显显得得特特别别重重要要，可可用用来来作作为为选选择择溶溶菌菌酶酶和化学方法的依据。和化学方法的依据。nnn化学破碎将细胞壁溶解与渗透压作用相结合，胞内外的渗透压差与胞内外低分子溶质的浓度差c成正比=cRTR为常数3.2 细胞破碎技术的分类细胞破碎技术的分类分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困大分子目的产物易失活，浆液分离困难难高压匀浆高压匀浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎超声破碎法法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作烈，不适合大规模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合感目的产物不适合非非机机械械法法酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透化学渗透法法改变细胞膜的渗改变细胞膜的渗透性透性具一定选择性，浆液易分离，但释放具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差率较低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化冻结融化法法反复冻结反复冻结-融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透改变细胞膜渗透性性条件变化剧烈，易引起大分子物质失条件变化剧烈，易引起大分子物质失活活几种细胞破碎方式的比较几种细胞破碎方式的比较机械破碎机械破碎n通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。n珠磨法、挤压法、匀浆法、超声法。珠磨法、挤压法、匀浆法、超声法。物理破碎物理破碎n通通过过各各种种物物理理因因素素的的作作用用，使使组组织织、细细胞胞的的外外层层结构破坏，而使细胞破碎。结构破坏，而使细胞破碎。n温度差破碎法、压力差破碎法。温度差破碎法、压力差破碎法。化学破碎化学破碎n通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。碎。n有机溶剂、表面活性剂、酸碱。有机溶剂、表面活性剂、酸碱。酶促破碎酶促破碎n通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎。n外加酶制剂法、自溶法外加酶制剂法、自溶法影响破碎难易程度的重要因素影响破碎难易程度的重要因素n机机械械法法细细胞胞的的大大小小和和形形状状、细细胞胞壁壁厚厚度度、聚聚合合物物交交联联程程度度。显显然然，细细胞胞个个体体小小、球球形形、壁壁厚厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。（聚合物交联程度高是最难破碎的。（破碎细胞破碎细胞）n非非机机械械法法细细胞胞壁壁、膜膜的的组组成成和和结结构构。了了解解细细胞胞壁壁的的组组成成和和结结构构，就就可可选选择择合合适适的的溶溶菌菌酶酶和和化化学学试试剂剂，以以及及在在使使用用多多种种酶酶或或化化学学试试剂剂相相结结合合时时确确定其使用的顺序。定其使用的顺序。（溶解壁膜上的某些组成溶解壁膜上的某些组成打洞打洞）3.3 常用破碎技术常用破碎技术n珠磨法珠磨法(bead mill)实验常用实验常用n高压匀浆法高压匀浆法(High-pressure homogenization)-大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法n超声破碎（超声破碎（Ultrasonication）-主要用于实验室主要用于实验室nx-press法法n酶溶法酶溶法研究较广的一种方法研究较广的一种方法n化学渗透法化学渗透法 其它方法其它方法珠磨法珠磨法nbead mill实验常用实验常用n工工作作原原理理：细细胞胞悬悬浮浮液液与与极极细细的的珠珠子子(玻玻璃璃、石石英英砂砂、氧氧化化铝铝等等研研磨磨剂剂，直直径径1mm)一一起起快快速速搅搅拌拌或或研研磨磨，研研磨磨剂剂珠珠子子与与细细胞胞之之间间的的互互相相剪剪切切、碰碰撞撞，使使细细胞胞破破碎，释放出内含物。碎，释放出内含物。n实实验验室室规规模模：Mickle高高速速组组织织捣捣碎碎机机、Braun匀匀浆器；浆器；n中试规模：胶质磨；中试规模：胶质磨；n工业规模：高速珠磨机工业规模：高速珠磨机(High-speed bead mill)工工业业规规模模：高高速速珠珠磨机磨机。圆圆盘盘高高速速旋旋转转，使使细细胞胞悬悬液液和和玻玻璃璃珠珠相相互互搅搅动动，细细胞胞破破碎碎是是由由剪剪切切力力层层之之间间的的碰碰撞撞和和磨磨料料的的滚动而引起。滚动而引起。典型的珠磨机的构造典型的珠磨机的构造n瑞士：瑞士：Dyno Mill。n磨磨室室具具夹夹套套，可可冷冷却却。在在料料液液的的出出口口处处有有一一旋旋转转的的圆圆盘盘和和出出口口平平板板（出出口口位位于于平平板板的的中中部部）很很靠靠近近，可可防防止止珠珠体随料液带出。体随料液带出。西德生产的容量西德生产的容量20L的的LM-20型珠磨机型珠磨机胶体磨胶体磨德国进口珠磨机德国进口珠磨机n除除磨磨室室以以夹夹套套冷冷却却外外，搅搅拌拌轴轴和和圆圆盘盘也也可可以以冷冷却却，圆圆盘盘交交错错地地装装在在轴轴上上，一一种种处处于于径径向向，另另一一种种和和轴轴倾倾斜斜，径径向向圆圆盘盘使使磨磨料料沿沿径径向向运运动动，而而倾倾斜斜圆圆盘盘使使产产生生铀铀内内运运动动。这这种种交交错错的的运运动动，提提高高了了破破碎效率。碎效率。n细胞破碎率可用一级反应动力学表示：细胞破碎率可用一级反应动力学表示：间歇操作：间歇操作：ln1/(1-R)=Kt连续操作：连续操作：ln1/(1-R)=K其中其中=V/F操作条件的选择操作条件的选择n珠珠体体大大小小根根据据细细胞胞大大小小、浓浓度度以以及及连连续续操操作作时不使珠体带出来选择。时不使珠体带出来选择。n珠珠体体装装量量装装量量少少时时，细细胞胞不不易易破破碎碎；装装量量大大时时，能能量量消消耗耗大大，研研磨磨室室热热扩扩散散性性能能降降低低，引引起起温度升高。温度升高。n温温度度温温度度高高时时细细胞胞较较易易破破碎碎，但但要要考考虑虑目目的的产产物物不不受受破破坏坏。一一般般温温度度控控制制在在540内内时时影影响响较小。较小。n搅搅拌拌转转速速过过高高将将使使能能量量消消耗耗大大增增，而而破破碎碎率率上升不明显。上升不明显。破碎率的控制：破碎率的控制：n破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升；破碎率高时，单位破碎细胞的能耗明显上升；n高高破破碎碎率率产产生生较较多多的的热热能能，增增大大了了冷冷却却控控温温的的难难度；度；n破碎率越高，细胞碎片越小，分离碎片越困难；破碎率越高，细胞碎片越小，分离碎片越困难；n高破碎率下，目的产物的失活损失增加。高破碎率下，目的产物的失活损失增加。（珠珠磨磨法法的的破破碎碎率率一一般般控控制制在在80%以以下下，并并兼兼顾顾下游过程）下游过程）高压匀浆法高压匀浆法n(High-pressure homogenization)大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法n工工作作原原理理：细细胞胞悬悬浮浮液液在在高高压压的的作作用用下下从从阀阀座座与与阀阀之之间间的的环环隙隙高高速速喷喷出出，每每秒秒速速度度高高达达几几百百米米，高高速速喷喷出出的的浆浆液液又又射射到到静静止止的的撞撞击击环环上上，被被迫迫改改变变方方向向从从出出口口管管流流出出。细细胞胞在在这这一一系系列列高高速速运运动动过过程程中中经经历历了了剪剪切切、碰碰撞撞及及由由高高压压到到常常压压的的变变化化，从而造成细胞破碎。从而造成细胞破碎。进口进口出口出口破碎的动力学方程：破碎的动力学方程：式中：式中：nKT与温度等有关的破碎常数与温度等有关的破碎常数nN悬浮液通过匀浆器的次数悬浮液通过匀浆器的次数nP操作压力操作压力na微生物种类常数微生物种类常数破碎压力的选择：破碎压力的选择：n增增大大压压力力和和增增加加破破碎碎次次数数都都可可以以提提高高破破碎碎率率，但但当当压压力力增增大大到到一一定定程程度度后后对对匀匀浆浆器器的的磨磨损损较较大大，此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。此外当压力超过一定值后，破碎率的增加很慢。n在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为5570 MPa。破碎一般规律：破碎一般规律：n（1）酵母较细菌难破碎；）酵母较细菌难破碎；n（2）处处于于静静止止状状态态的的细细胞胞较较处处于于快快速速生生长长状状态态的的细胞难破碎；细胞难破碎；n（3）在在复复合合培培养养基基上上培培养养的的细细胞胞比比在在简简单单合合成成培培养基上培养的细胞较难破碎。养基上培养的细胞较难破碎。不宜采用高压匀浆法破碎的有：不宜采用高压匀浆法破碎的有：n（1）易造成堵塞的团状或丝状真菌，）易造成堵塞的团状或丝状真菌，n（2）较小的革兰氏阳性菌，）较小的革兰氏阳性菌，n（3）某些质地坚硬的亚细胞如包含体）某些质地坚硬的亚细胞如包含体（inclusion body）。）。大、中、小型高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器超声破碎超声破碎（Ultrasonication）-主要用于实验室主要用于实验室n破破 碎碎 机机 理理：可可 能能 与与 空空 化化 现现 象象（Cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。）引起的冲击波和剪切作用有关。n通通常常采采用用的的超超声声破破碎碎机机在在1525KHz的的频频率率下下操操作。作。n超超声声破破碎碎的的效效率率与与声声频频、声声能能、处处理理时时间间、细细胞胞浓度及菌种类型等因素有关。浓度及菌种类型等因素有关。超声破碎的适用性：超声破碎的适用性：n细细胞胞种种类类：杆杆菌菌比比球球菌菌较较易易破破碎碎，革革兰兰氏氏阴阴性性细细胞胞比比革革兰兰氏氏阳阳性性细细胞胞较较易易破破碎碎，对对酵酵母母菌菌的的效效果果较差。较差。n超超声声波波振振荡荡易易引引起起温温度度的的剧剧烈烈上上升升，操操作作时时常常在在冷冷却却条条件件下下进进行行。小小规规模模实实验验常常采采用用间间歇歇操操作作，大规模生产受限制。大规模生产受限制。n超超声声波波产产生生的的化化学学自自由由基基团团能能使使某某些些敏敏感感性性活活性性物质失活，因而有一定的局限性。物质失活，因而有一定的局限性。超声波破碎时，影响生物产品收率的因素：超声波破碎时，影响生物产品收率的因素：1、温度上升、温度上升n当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的当气泡破裂时，绝大部分释放出来的能都以热的形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预形式为液体所吸收，为了避免高温，悬浮液应预先冷却到先冷却到05，并且还应用冷却液连续通入容，并且还应用冷却液连续通入容器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操器夹套，即短期的声波破碎与短期的冷却交替操作，作，声波破碎声波破碎/冷却的时间比率称为冷却的时间比率称为“负载因素负载因素”。2 2、化学效应、化学效应n超声处理会引起诸如生成超声处理会引起诸如生成游离基游离基这样的化学效应，这样的化学效应，它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对它可能对某些需要的分子带来破坏性影响，但对破碎细胞毫无影响。破碎细胞毫无影响。n可通过添加可通过添加游离基清除剂游离基清除剂如胱氨酸或谷胱甘肽，如胱氨酸或谷胱甘肽，或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。或者用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。连续超声波破碎的实验室装置连续超声波破碎的实验室装置n由由一一个个带带夹夹套套的的烧烧杯杯组组成成，其其形形状状和和尺尺寸寸会会影影响响悬悬浮浮液液的的流流体体动动力力学学。对对于于刚刚性性细细胞胞可可以以添添加加细细小小的的珠珠粒粒，产产生生辅辅助助的的研研磨磨效效应应。超超声声波波反反应应器器内内，有有四四根根内内环环管管，由由于于声声波波振振荡荡能能量量会会泵泵送送悬悬浮浮液液循循环环，用用插插入入进进出出口口管管到到内内部部烧烧杯杯去去的的方方法法，就可以实现连续操作。就可以实现连续操作。影响超声波破碎效率的参数影响超声波破碎效率的参数:(1)、振幅、振幅 n振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度振幅直接与声能有关，影响蛋白质释放的比速度 k。(2)、细胞悬浮液的粘度、细胞悬浮液的粘度 n粘度影响能耗并会抑制空穴现象。粘度影响能耗并会抑制空穴现象。(3)、表面张力、表面张力n 添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质添加表面活性剂或从细胞中释放出表面活性物质(如蛋白质如蛋白质)，能显著地影响声波破碎效率。，能显著地影响声波破碎效率。n因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性因为强烈起泡在气一液界面上会促使蛋白质变性和空穴清除，特别是应用高的功率时。和空穴清除，特别是应用高的功率时。(4)、被处理悬浮液的体积、被处理悬浮液的体积 n大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。大体积需要高的声能引起强烈涡流和大气泡形成。(5)、珠粒的体积和直径、珠粒的体积和直径 n添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴添加细小的珠粒，玻璃或者钢制的，不仅对空穴的形成有帮助，而且产生辅助的形成有帮助，而且产生辅助“研磨研磨”效应，从效应，从而提高破碎效率。而提高破碎效率。n在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，在相同珠粒填充密度下，随着珠粒直径的变化，k存在最大值。存在最大值。(6)、探头的形状和材料、探头的形状和材料 n对于一个能级恒定的功率，对于一个能级恒定的功率，探头的振幅与其面积探头的振幅与其面积成反比成反比，然而对于小直径的探头，声能限制在较，然而对于小直径的探头，声能限制在较小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小小的区域并且效率低。特别是当悬浮液的体积小的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的时候，能量在探头嘴附近被悬浮液吸收，强烈的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范的涡流会变小。对于大的探头，声能消耗在大范围上，结果则使振幅更小。围上，结果则使振幅更小。n探探头头嘴嘴通通常常用用钛钛制制造造，因因为为钛钛具具有有良良好好的的声声学学和和机机械械特特性性以以及及对对生生物物活活性性产产物物的的低低毒毒性性。为为了了维维修修和和替替换换，通通常常探探头头可可以以拆拆卸卸。除除钛钛以以外外，还还可可使使用用其其他他材材料料如如不不锈锈钢钢或或硬硬质质钢钢，但但是是其其声声学学和和机械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。机械特性都不如钛，破碎速度也大幅度降低。n(7)、细胞悬浮液的流速、细胞悬浮液的流速 n在在连连续续操操作作中中，流流速速取取决决于于细细胞胞在在反反应应器器中中的的停停留时间，并影响破碎的总收率。留时间，并影响破碎的总收率。n超超声声波波破破碎碎在在实实验验室室广广泛泛应应用用，但但在在工工业业范范围围中中还还未未采采用用这这种种方方法法，因因为为要要向向大大量量细细胞胞悬悬浮浮液液中中通入足够的能量是很困难的。通入足够的能量是很困难的。X-press法法n将将浓浓缩缩的的菌菌体体悬悬浮浮液液冷冷却却至至25至至30形形成成冰冰晶晶体体，利利用用500MPa以以上上的的高高压压冲冲击击，冷冷冻冻细细胞胞从从高高压压阀阀小小孔孔中中挤挤出出。细细胞胞破破碎碎是是由由于于冰冰晶晶体体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。n此此法法称称为为XPress法法或或Hughes press法法，主主要要用于实验室中。用于实验室中。n影响因素：影响因素：高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。高浓度的细胞、低温、高的平均压力能促进破碎。n优缺点：优缺点：适适用用范范围围广广，破破碎碎率率高高，细细胞胞碎碎片片的的粉粉碎碎程程度度低低、活活性性保保留留率率高高，但但是是，该该法法对对冷冷冻冻融融解解敏敏感感的的生化物质不适用。生化物质不适用。酶溶法酶溶法研究较广的一种方法研究较广的一种方法n原原理理：利利用用酶酶反反应应，分分解解破破坏坏细细胞胞壁壁上上的的特特殊殊键键，从而达到破壁的目的。从而达到破壁的目的。n自自溶溶法法控控制制一一定定条条件件，诱诱发发细细胞胞自自溶溶酶酶使使细细胞破碎。自溶法常采用加热法或干燥法。胞破碎。自溶法常采用加热法或干燥法。n外外加加酶酶法法根根据据细细胞胞壁壁膜膜的的结结构构及及组组成成选选择择合合适的酶。适的酶。n细菌大多用溶菌酶细菌大多用溶菌酶(lysozyme)n酵酵母母菌菌常常用用溶溶酶酶有有：-1,3-葡葡聚聚糖糖酶酶(glucanase)、-1,6-葡葡聚聚糖糖酶酶、蛋蛋白白酶酶(protease)、甘甘露露糖糖酶酶(mannanase)、糖糖苷苷酶酶(glycosidase)、肽肽键键内内切切酶酶(endopeptidase)、壳多糖酶等。、壳多糖酶等。细胞壁溶解酶是几种酶的复合物细胞壁溶解酶是几种酶的复合物nG+溶菌酶、适量抑制剂溶菌酶、适量抑制剂nG-溶菌酶、溶菌酶、EDTAn放线菌放线菌 溶菌酶溶菌酶n酵母菌酵母菌 -葡聚糖酶葡聚糖酶n霉菌霉菌 几丁质酶、几丁质酶、n植物植物 纤维素酶、半纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶酶溶法的特点（外加酶）酶溶法的特点（外加酶）：n（1）酶溶法需要特定的反应条件。）酶溶法需要特定的反应条件。n（2）酶酶具具有有高高度度专专一一性性，必必须须根根据据细细胞胞壁壁的的结结构构和和化化学学组组成成选选择择适适当当的的酶酶或或溶溶酶酶系系统统，并并确确定定相相应的次序。应的次序。n（3）酶酶溶溶法法的的优优点点是是：具具有有选选择择性性释释放放产产物物，条条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。n（4）酶溶法的不足：）酶溶法的不足：n溶酶价格高；溶酶价格高；n酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；酶溶法通用性差，且不易确定最佳的溶解条件；n存存在在产产物物抑抑制制，在在溶溶酶酶系系统统中中，甘甘露露糖糖对对蛋蛋白白酶酶有抑制作用。有抑制作用。自溶法（自溶法（Autolysis）u诱诱发发微微生生物物产产生生过过剩剩的的溶溶胞胞酶酶或或激激发发自自身身溶溶胞胞酶酶的的活活力力，以以达达到到细细胞胞自自溶溶的的目目的的。微微生生物物细细胞胞的的自溶常采用加热法和干燥法。自溶常采用加热法和干燥法。u影影响响自自溶溶过过程程的的主主要要因因素素有有温温度度、时时间间、pH值值、缓冲液浓度和细胞代谢途径等。缓冲液浓度和细胞代谢途径等。u缺缺点点是是：对对不不稳稳定定的的微微生生物物，易易引引起起所所需需蛋蛋白白质质的的变变性性，自自溶溶后后细细胞胞悬悬浮浮液液粘粘度度增增大大，过过滤滤速速度度下降。下降。化学渗透法化学渗透法n某某些些化化学学试试剂剂，可可以以改改变变细细胞胞壁壁或或膜膜的的通通透透性性（渗渗透透性性），从从而而使使胞胞内内物物质质有有选选择择地地渗渗透透出出来来，这这 种种 处处 理理 方方 式式 称称 为为 化化 学学 渗渗 透透 法法(Chemical permeation)。n常常用用化化学学试试剂剂有有：有有机机溶溶剂剂、变变性性剂剂、表表面面活活性性剂、抗生素、金属螯合剂等。剂、抗生素、金属螯合剂等。作用原理作用原理n化化学学渗渗透透法法取取决决于于化化学学试试剂剂的的类类型型以以及及细细胞胞壁壁膜膜的的结结构构与与组组成成，不不同同化化学学试试剂剂作作用用的的部部位位和和方方式式有所不同，现举例如下有所不同，现举例如下:n（1）表表面面活活性性物物质质：可可促促使使细细胞胞某某些些组组分分溶溶解解，其其增增溶溶作作用用有有助助于于细细胞胞的的破破碎碎。如如TritonX-100能能结结合合并并溶溶解解磷磷脂脂，破破坏坏内内膜膜的的磷磷脂脂双双分分子子层层，从从而使某些胞内物质释放出来。而使某些胞内物质释放出来。n（2）EDTA螯螯合合剂剂：可可用用于于处处理理革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌(如如E.coli),它对其细胞外层膜有破坏作用。它对其细胞外层膜有破坏作用。n（3）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。）有机溶剂：能分解细胞壁中的类脂。n（4）变变性性剂剂：如如盐盐酸酸胍胍(Guanidin HCl)和和脲脲（Urea）与与水水中中氢氢键键作作用用，削削弱弱溶溶质质分分子子间间的的疏疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。n各各种种试试剂剂的的不不同同作作用用机机理理，将将几几种种试试剂剂合合理理地地搭搭配使用能有效地提高胞内物质的释放率。配使用能有效地提高胞内物质的释放率。n例例：单单独独用用0.1mol/L盐盐酸酸胍胍处处理理E.coli仅仅释释放放约约1%的蛋白质的蛋白质 0.5%TritonX-100处理蛋白质释放率为处理蛋白质释放率为4%二者合用，蛋白质释放率可达二者合用，蛋白质释放率可达53%左右。左右。化学渗透法的优点：化学渗透法的优点：n 对对产产物物释释放放具具有有一一定定选选择择性性。可可使使一一些些较较小小分分子子量量的的溶溶质质如如多多肽肽和和小小分分子子的的酶酶蛋蛋白白透透过过，而而核核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。酸等大分子量的物质仍滞留在胞内。n 细细胞胞外外形形保保持持完完整整，碎碎片片少少，浆浆液液粘粘度度低低，易易于固液分离和进一步提取。于固液分离和进一步提取。化学渗透法的缺点：化学渗透法的缺点：n（1）通通用用性性差差，某某种种试试剂剂只只能能作作用用于于某某些些特特定定类类型的细胞。型的细胞。n（2）时时间间长长，效效率率低低，一一般般胞胞内内物物质质释释放放率率不不超超过过50%。n（3）有些化学试剂有毒性。）有些化学试剂有毒性。反复冻结反复冻结-融化法融化法n将将细细胞胞放放在在低低温温下下突突然然冷冷冻冻而而在在室室温温下下缓缓慢慢融融化化，反复多次而达到破壁作用。反复多次而达到破壁作用。n一一方方面面使使细细胞胞膜膜的的疏疏水水键键结结构构破破裂裂，另另一一方方面面胞胞内内水水结结晶晶，使使细细胞胞内内外外溶溶液液浓浓度度变变化化，引引起起细细胞胞膨胀而破裂。膨胀而破裂。n适适用用于于细细胞胞壁壁较较脆脆弱弱的的菌菌体体，破破碎碎率率较较低低，需需反反复多次。复多次。渗透压法（渗透压法（Osmotic pressure）n将将细细胞胞放放在在高高渗渗透透压压的的介介质质中中（如如一一定定浓浓度度的的甘甘油油或或蔗蔗糖糖溶溶液液），达达平平衡衡后后，转转入入到到渗渗透透压压低低的的缓缓冲冲液液或或纯纯水水中中，由由于于渗渗透透压压的的突突然然变变化化，水水迅迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。n仅仅适适用用于于细细胞胞壁壁较较脆脆弱弱的的细细胞胞或或细细胞胞壁壁预预先先用用酶酶处处理理或或在在培培养养过过程程中中加加入入某某些些抑抑制制剂剂（如如抗抗生生素素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。干燥法干燥法n原原理理：干干燥燥法法可可采采用用空空气气干干燥燥，真真空空干干燥燥，喷喷雾雾干干燥燥和和冷冷冻冻干干燥燥等等。它它使使细细胞胞膜膜渗渗透透性性改改变变，当当用用丙丙酮酮、丁丁醇醇或或缓缓冲冲液液等等溶溶剂剂处处理理时时，胞胞内内物物质质就容易被抽提出来。就容易被抽提出来。气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥n空空气气干干燥燥主主要要适适用用于于酵酵母母菌菌，一一般般在在2530的的气气流流中中吹吹干干，然然后后用用水水、缓缓冲冲液液或或其其它它溶溶剂剂抽抽提提。空空气气干干燥燥时时，部部分分酵酵母母可可能能产产生生自自溶溶，所所以以较较冷冷冻干燥、喷雾干燥容易抽提。冻干燥、喷雾干燥容易抽提。n真空干燥真空干燥适用于细菌的干燥。适用于细菌的干燥。n冷冷冻冻干干燥燥适适用用于于较较不不稳稳定定的的生生化化物物质质，将将冷冷冻冻干干燥燥后后的的菌菌体体在在冷冷冻冻条条件件下下磨磨成成粉粉，然然后后用用缓缓冲冲液液抽提。抽提。n有有机机溶溶剂剂脱脱水水：例例如如，丙丙酮酮等等使使细细胞胞脱脱水水，即即可可将将菌菌体体悬悬浮浮液液慢慢慢慢倒倒入入10倍倍体体积积预预冷冷至至20的的丙丙酮酮中中搅搅拌拌使使之之脱脱水水，丙丙酮酮除除能能脱脱水水外外，还还能能溶溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。n缺缺点点：干干燥燥法法条条件件变变化化较较剧剧烈烈，容容易易引引起起蛋蛋白白质质或其它组织变性。或其它组织变性。细胞破碎方法细胞破碎方法（按是否使用外加作用力）（按是否使用外加作用力）分分 类作作 用用 机机 理理适适 应 性性机机械械法法珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较高破碎率，高破碎率，可可较大大规模操作模操作，大，大分子目的分子目的产物易失活，物易失活，浆液分离困液分离困难高高压匀匀浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较高破碎率，高破碎率，可大可大规模操作模操作，不适，不适合合丝状菌和革状菌和革兰氏阳性菌氏阳性菌超声破碎超声破碎法法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果酵母菌效果较差，破碎差，破碎过程升温程升温剧烈，烈，不适合大不适合大规模操作模操作X-pressX-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，破碎率高，活性保留率高，对冷冷冻敏感敏感目的目的产物不适合物不适合非非机机械械法法酶酶溶法溶法酶酶分解作用分解作用具有高度具有高度专一性，条件温和，一性，条件温和，浆液易分液易分离，溶离，溶酶酶价格高，通用性差价格高，通用性差化学渗透化学渗透法法改改变细胞膜的渗透胞膜的渗透性性具一定具一定选择性，性，浆液易分离，但液易分离，但释放率放率较低，通用性差低，通用性差渗透渗透压法法渗透渗透压剧烈改烈改变破碎率破碎率较低，常与其他方法低，常与其他方法结合使用合使用冻结融化融化法法反复反复冻结-融化融化破碎率破碎率较低，不适合低，不适合对冷冷冻敏感目的敏感目的产物物干燥法干燥法改改变细胞膜渗透性胞膜渗透性条件条件变化化剧烈，易引起大分子物烈，易引起大分子物质失活失活选择破碎方法的依据选择破碎方法的依据n（1）细细胞胞处处理理量量：大大规规模模生生产产多多采采用用机机械械法法（通通用用性性强强，破破碎碎效效率率高高），实实验验室室规规模模多多选选用用非非机机械法（选择性好，固液易分离）。械法（选择性好，固液易分离）。n（2）细胞壁的强度与结构：见）细胞壁的强度与结构：见3.2。n（3）目目标标产产物物对对破破碎碎条条件件的的敏敏感感性性：对对活活性性物物质质产品，要兼顾效率与稳定性。产品，要兼顾效率与稳定性。n（4）破破碎碎程程度度：操操作作条条件件要要兼兼顾顾产产物物释释放放率率、能能耗和便于后提取。耗和便于后提取。n任任何何破破壁壁方方法法都都有有局局限限性性和和不不足足，应应根根据据破破壁壁目目的的、产产物物的的类类型型和和位位置置，选选用用合合适适的的方方法法，达达到到选择性地分步释放目标产物的要求。选择性地分步释放目标产物的要求。n其一般原则为其一般原则为:1)1)若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。若提取的产物在细胞质内，需用机械破碎法。2)2)若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法若在细胞膜附近则可用较温和的非机械法。3)3)若若提提取取的的产产物物与与细细胞胞膜膜或或壁壁相相结结合合时时，可可采采用用机机械械法法和和化化学学法法相相结结合合的的方方法法，以以促促进进产产物物溶溶解解度度的的提提高高或或缓缓和和操操作作条条件件，但但保保持持产产物物的的释释放放率率不不变。变。3.4 破碎技术的发展方向破碎技术的发展方向l为为解解决决破破碎碎过过程程中中敏敏感感性性物物质质的的失失活活，杂杂蛋蛋白白太太多多以以及及碎碎片片的的去去除除问问题题，细细胞胞破破碎碎技技术术研研究究还还应应注意以下问题注意以下问题:n 多多种种破破碎碎方方法法相相结结合合。即即机机械械方方法法与与非非机机械械方方法法的的结结合合等等，如如用用细细胞胞壁壁溶溶解解酶酶预预处处理理面面包包酵酵母母，然然后后高高压压匀匀浆浆，在在95MPa压压力力下下匀匀浆浆4次次，总总破破碎碎率率可可接接近近100%,而而单单独独高高压压匀匀浆浆法法破破碎碎率率只只有有32%。n化化学学法法与与酶酶法法取取决决于于细细胞胞壁壁膜膜的的化化学学组组成成，机机械械法法取取决决于于细细胞胞结结构构的的机机械械强强度度，而而化化学学组组成成又又决决定定了了结结构构的的机机械械强强度度，组组成成的的变变化化必必然然影影响响到到强强度的差异，这就是化学法与机械法相结合的原理。度的差异，这就是化学法与机械法相结合的原理。细胞细胞 酶法或化学法处理酶法或化学法处理破坏细胞壁某些物质组成破坏细胞壁某些物质组成壁的机械强度壁的机械强度 机械法处理机械法处理细胞破碎率细胞破碎率例：面包酵母细胞的破碎例：面包酵母细胞的破碎n用用溶溶解解酶酶（Zymolyase）预预处处理理，然然后后在在95MPa压力下高压匀浆压力下高压匀浆4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%。n而而单单独独用用95MPa压压力力高高压压匀匀浆浆4次次，破破碎碎率率只只有有32%。（2）与上游相结合）与上游相结合n寄寄主主细细胞胞的的选选择择：选选择择较较易易破破壁壁的的菌菌种种作作为为寄寄主主细胞，如革兰氏阴性细菌。细胞，如革兰氏阴性细菌。n培培养养过过程程控控制制：在在发发酵酵培培养养过过程程的的细细胞胞生生长长的的后后期期，加加入入某某些些能能抑抑制制或或阻阻止止细细胞胞壁壁物物质质合合成成的的抑抑制制剂剂（如如青青霉霉素素、环环丝丝氨氨酸酸等等），继继续续培培养养一一段段时时间间后后，新新分分裂裂的的细细胞胞其其细细胞胞壁壁存存在在缺缺陷陷，利利于于破破碎碎，而而有有些些胞胞内内产产物物不不经经破破碎碎即即可可直直接接渗渗透透出出来。来。n克克隆隆噬噬菌菌体体溶溶解解基基因因：在在细细胞胞内内引引进进噬噬菌菌体体基基因因，培培养养结结束束后后，控控制制一一定定条条件件(如如温温度度等等)，激激活活噬噬菌菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。n耐耐高高温温产产品品的的基基因因表表达达：如如果果产产品品能能表表达达成成耐耐高高温温型型，杂杂蛋蛋白白仍仍然然保保持持原原特特性性，那那么么就就可可在在较较高高温温度度下下将将产产品品与与杂杂质质分分开开，这这样样既既节节省省了了冷冷却却费费用，又简化了分离步骤。用，又简化了分离步骤。（3）与下游相结合）与下游相结合n细细胞胞破破碎碎与与固固液液分分离离和和产产品品提提取取过过程程相相结结合合，也也即即根根据据后后处处理理过过程程的的单单元元操操作作确确定定细细胞胞破破碎碎的的方方法和操作条件。法和操作条件。n必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破必须从后分离过程的整体来考虑破碎操作，即破碎过程要易于细胞碎片的除净。碎过程要易于细胞碎片的除净。3.5破碎率的测定破碎率的测定n破破碎碎率率定定义义为为被被破破碎碎细细胞胞的的数数量量占占原原始始细细胞胞数数量量的的百分比数，即百分比数，即:Y(%)(N0-N)/N0100n由由于于N0(原原始始细细胞胞数数量量)和和N(经经t时时间间操操作作后后保保留留下下来来的的未未损损害害完完整整细细胞胞数数量量)不不能能很很清清楚楚的的确确定定，因因此破碎率的评价非常困难。此破碎率的评价非常困难。n目前目前N0和和N主要通过下面的方法获得。主要通过下面的方法获得。直接测定法直接测定法(仅适合于机械法仅适合于机械法)n利利用用显显微微镜镜或或电电子子微微粒粒计计数数器器可可直直接接计计数数完完整整细细胞胞数数，所所以以可可用用于于破破碎碎前前的的细细胞胞计计量量。可可是是破破碎碎过过程程中中所所释释放放的的物物质质如如DNA和和其其他他聚聚合合物物组组分分会会干干扰扰计计数数，此此时时可可采采用用染染色色法法把把破破碎碎的的细细胞胞从从未未损害的完整细胞中区别开损害的完整细胞中区别开，以便于计数。以便于计数。n例例如如，破破碎碎的的革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌常常可可染染色色成成阴阴性性菌菌的的颜颜色色，利利用用革革兰兰氏氏染染色色法法未未受受损损害害的的酵酵母母细细胞胞呈呈现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。现紫色，而受损害的酵母细胞呈现亮红色。目的产物测定法目的产物测定法n通通过过测测定定破破碎碎液液中中目目的的产产物物的的释释放放量量来来估估算算破破碎碎率率。（多多用用于于生生产产，必必须须有有100%破破碎碎率率作作标标准准数数值比较）值比较）n测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。n通通常常将将破破碎碎后后的的细细胞胞悬悬浮浮液液离离心心，测测定定上上清清液液中中蛋蛋白白质质的的含含量量或或酶酶的的活活力力，并并与与100破破碎碎所所获获得得的标准数值比较。的标准数值比较。导电率测定法导电率测定法n导导电电率率的的变变化化是是由由于于细细胞胞内内含含物物被被释释放放到到水水相相中中而而引引起起的的。导导电电率率随随着着破破碎碎率率的的增增加加而而呈呈线线性性增增加。加。n因因为为导导电电率率的的读读数数取取决决于于微微生生物物的的种种类类、处处理理的的条条件件、细细胞胞浓浓度度、温温度度和和悬悬浮浮液液中中电电解解质质的的含含量量，因因此此应应预预先先采采用用其其他他方方法法来来进进行行标标化化。（是是一一种种快速测定法，应预先采用其他方法制定标准曲线快速测定法，应预先采用其他方法制定标准曲线）思考题思考题n1、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。、常用细胞破碎方法的原理、特点及适用性。n2、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何、机械法细胞破碎方法非机械破碎方法相比有何特点？特点？n3、超声波破碎的机理、超声波破碎的适用范围。超声波破碎的机理、超声波破碎的适用范围。n4 4、简述、简述酶溶法及其优缺点。酶溶法及其优缺点。本章结束！本章结束！