第五章 DNA体外重组技术-LXG-2006-4

第五章第五章DNA体外体外重组技术重组技术概述一、一、DNA重组技术相关概念重组技术相关概念 克隆克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖无性繁殖。DNA克隆克隆(DNA cloning)应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复制能力的复制能力的DNA分子。分子。继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目的基因的转化子细胞。目的基因的转化子细胞。再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，又又称称基基因因克克隆隆(gene cloning)或或分分子子克克隆隆(molecular cloing)。“克隆克隆”某一基因或某一基因或DNA片段过程中，片段过程中，将外源将外源DNA插入载体分子所形成的复制子插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合是杂合分子嵌合DNA，所以，所以DNA克隆克隆又又称称重组重组DNA(recombinant DNA)。实现实现DNA克隆所用的方法及相关的工克隆所用的方法及相关的工作称作称DNA重组技术重组技术(recombinant DNA technology)，又称，又称基因工程基因工程(genetic engineering)。二、二、DNA重组技术基本程序重组技术基本程序外源外源DNA的获取的获取DNA导入受体菌导入受体菌目的目的基因与载体的连接基因与载体的连接克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 三、三、DNA重组的基本步骤重组的基本步骤+连接转化、筛选和鉴定阳性克隆含重组子的阳性克隆载体目的基因分、切、接、转、筛克隆基因表达克隆基因表达第一节DNA体外重组载体的种类与选择体外重组载体的种类与选择载体载体（vector）：）：能携带外源基因进入受能携带外源基因进入受体细胞体细胞,并在其中进行扩增或诱导外源基并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。因表达的工具。*作为基因工程载体所需具备的作为基因工程载体所需具备的基本条件基本条件：1.有有自身的复制子自身的复制子，能借助自身的复制和调控对，能借助自身的复制和调控对携带的目的基因进行复制和增殖。携带的目的基因进行复制和增殖。3.有多个利于选择和筛选的有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志遗传表型或标志，包括，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。2.有有多克隆位点多克隆位点(多种酶单一位点多种酶单一位点)，易于外源，易于外源DNA分子与载体及重组。分子与载体及重组。4.表达型载体还应有表达型载体还应有强启动子、前导序列、增强启动子、前导序列、增强子强子等等调控元件调控元件。（一）按功能分类（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类（三）按载体来源分类一、载体的一、载体的分类分类克隆型载体克隆型载体表达型载体表达型载体原核细胞载体原核细胞载体真核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）（穿梭载体）原核克隆型载体原核克隆型载体原核表达型载体原核表达型载体真核表达型载体真核表达型载体真核转递型载体真核转递型载体质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体病毒载体病毒载体酵母人工染色体酵母人工染色体粘性载体粘性载体 细菌培养细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义定义:细菌染色质以外的双链环状细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。能自我复制和表达其携带的遗传信息。二、不同载体的特点与分类二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体（一）质粒载体1.质粒质粒(plasmid)基因克隆的质粒载体具备的特点：基因克隆的质粒载体具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白 质的合成，非使质粒的拷贝数增加。质的合成，非使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因抗药基因 或营养代谢基因或营养代谢基因等。等。抗药抗药基因或营养代谢基因基因或营养代谢基因氨苄氨苄青霉素抗性基因（青霉素抗性基因（ampr）:编码编码-内酰胺酶，水解内酰胺酶，水解amp-内酰胺环使内酰胺环使amp失效失效四环素抗性基因（四环素抗性基因（tetr）：）：编码转膜泵编码转膜泵将将tet从细胞移出从细胞移出大肠杆菌大肠杆菌LacZ基因基因：编码半乳糖苷酶，：编码半乳糖苷酶，分解分解X-gal，使菌落为蓝色。使菌落为蓝色。AmprORITetrpBR322质粒质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，复制起始点，保证高拷贝保证高拷贝自我复制自我复制。结构：结构：Ampr,Tetr：两个抗性基因用于两个抗性基因用于筛选筛选阳性克隆阳性克隆。Pst I,BamH I：两个单酶切位点用于两个单酶切位点用于插入插入目的基因目的基因AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：Multiple Clonning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ:蓝白斑筛选阳性克隆pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)PlacOriAva I(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)Pst I(440)Sma I(415)Xma I(413)Apa LI(178)Apa LI(1121)Apa LI(2367)MCSpcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子 驱动目的基因在真核真核细胞细胞内表达BGH pA：加尾信号 目的基因转录后加上polyA尾尾，使其更稳定稳定。（二）（二）噬菌体噬菌体 A WB DEF Z J att xis N cl cro O P Q SR 结构区 重组区重组区调控区裂解区cos位点位点 cos 位点位点ARAREcoRI目的基因EcoRIEcoRI插入型置换型 噬菌体作为载体具有两个特点噬菌体作为载体具有两个特点 噬菌体生长繁殖所噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其必需的序列位于其左右二臂左右二臂上，噬菌体基因组中央含有上，噬菌体基因组中央含有30%的的DNA是是 噬菌体生长所非必需的。噬菌体生长所非必需的。噬菌体的成熟需要包装，当与外源噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的重组后的大小介于原来的75%105%之间时，重组的之间时，重组的DNA分子才可包分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。装为成熟的噬菌体颗粒。噬菌体的种类：噬菌体的种类：Charon系列、系列、gt系列、系列、EMBL系列系列（三）粘粒载体（三）粘粒载体（cosmid)质粒序列：复制原点，抗性标志质粒序列：复制原点，抗性标志噬菌体：噬菌体：cos粘端序列粘端序列插入片段长度可以是载体本身长度的插入片段长度可以是载体本身长度的7-10倍倍（四）（四）酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(YAC)质粒质粒pBR322衍生物衍生物酵母基因酵母基因着丝粒着丝粒端粒端粒自主复制顺序自主复制顺序复制起点复制起点(ori)Ampr基因基因组成组成用途用途构建真核生物基因组构建真核生物基因组DNA文库文库第二节基因工程中常用工具酶一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(II(II型型)切切分子克隆的分子克隆的手术刀手术刀定义：定义：由细菌自己产生的一种能识别和切由细菌自己产生的一种能识别和切割割DNA内部特定序列的一类核酸酶内部特定序列的一类核酸酶有严格的有严格的识别识别、切割切割顺序，以顺序，以内切内切方式方式水解双链水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的中的磷酸二酯键，产生的DNA片段片段5 端为端为P，3端为端为OH。识别顺序识别顺序一般为一般为46个碱基个碱基，通常为，通常为回回文文结构，即具有结构，即具有180反向重复。反向重复。如如CATATG(1).产生产生平头末端平头末端(blunt end)Hae*GGCC*CCGG*5353型酶切割双链型酶切割双链DNA产生：产生：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353(2).产生产生粘性末端粘性末端(sticky end)一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶酶单位定义：酶单位定义：在适当反应条件下，在适当反应条件下，1h内在内在50l体体系中完全酶解系中完全酶解1g特定特定DNA底物所需酶底物所需酶量，定为量，定为1个活性单位。个活性单位。出售的内切酶几乎均以出售的内切酶几乎均以DNA作底物作底物测其酶活性单位。测其酶活性单位。星活性星活性:酶切反应条件不能满足最适酶切反应条件不能满足最适条件条件,导致某些酶产生第二活性导致某些酶产生第二活性.EcoR I*GAATTCAATT标准的酶切体系标准的酶切体系1gDNA，20l总反应体积，总反应体积，1U酶，推荐的酶，推荐的Buffer和温度，反应和温度，反应1h酶切体系组成酶切体系组成内切酶内切酶 根据实验目的选择，保存，使根据实验目的选择，保存，使用，稀释（避免失活与污染）用，稀释（避免失活与污染）DNA底物底物 纯度，含量纯度，含量反应反应buffer 严格按产品说明书严格按产品说明书 高、中、低盐高、中、低盐酶切反应体系的建立：酶切反应体系的建立：酶切温度与时间酶切温度与时间一般为一般为37,1h 酶切反应过程酶切反应过程容积：容积：20l，50l,酶容积酶容积10%,即甘即甘油油 5%注意混匀注意混匀反应终止：反应终止：三种方法三种方法:10mM EDTA 或或0.1%SDS;65，20min;酚酚/氯仿抽提，乙醇沉淀氯仿抽提，乙醇沉淀酶切鉴定酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳酶切反应体系的建立：酶切反应体系的建立：二、二、DNA聚合酶聚合酶含含3种酶活性：种酶活性：1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I5 3聚合酶活性聚合酶活性 5 3外切酶活性外切酶活性 3 5外切酶活性外切酶活性催化催化DNA缺口平移反应缺口平移反应,制备制备DNA探针探针(5 3外切酶活性外切酶活性)-主要用途主要用途DNA序列分析序列分析应用：应用：二、二、DNA聚合酶聚合酶I2.Klenow片段片段随机引物标记法标记探针随机引物标记法标记探针-主要用主要用途途双脱氧末端终止法进行双脱氧末端终止法进行DNA测序测序cDNA第二链的合成第二链的合成DNA 3突出末端进行末端标记突出末端进行末端标记用途：用途：(大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段，大片段，缺缺5 3外切酶活性外切酶活性)二、二、DNA聚合酶聚合酶IPCR反应反应-主要用途主要用途DNA测序测序用途：用途：3.Taq DNA聚合酶聚合酶(65kD)耐热，耐热，在在7075时具有最佳的生物活性，时具有最佳的生物活性，无无3 5外切酶活性外切酶活性(无校正功能）无校正功能）4.反转录酶反转录酶(Reverse Transcriptase,RT)功能：功能：以以RNA为模板，以带为模板，以带3-OH末端的末端的DNA片段为片段为引物引物，沿沿5至至3方向合成方向合成DNA链。链。3AAAAAAUCUGUCCUA5dNTPMg2+反转录酶3AAAAAAUCUGUCCUA55TTTTTTTOH 3AGACAGGAT31.RNA指导的指导的DNA聚合酶活性聚合酶活性5TTTTTTT2.DNA指导的指导的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；RNA酶酶H(35RNA外切酶外切酶)活性活性.4.反转录酶反转录酶功能：功能：后者可降解后者可降解DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA反转录酶反转录酶缺乏缺乏35核酸外切酶核酸外切酶活性活性,故未故未校正功能校正功能,会出现错配会出现错配.应用应用最主要是将最主要是将mRNA逆转录为逆转录为cDNA三、三、DNA连接酶连接酶(DNA ligase)基因工程的基因工程的缝纫针缝纫针 催化双链催化双链DNA相邻碱基相邻碱基5P和和3-OH间间磷磷酸二酯键酸二酯键形成的酶。形成的酶。T4噬菌体噬菌体DNA连接酶连接酶-最常用最常用 催化两个独立催化两个独立DNA片段片段(粘性末端和平末端粘性末端和平末端)5P和和3-OH之间形成之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键。主要功能与用途：主要功能与用途：催化催化平末端平末端连接要比连接要比粘性末端粘性末端 效率低得多。效率低得多。修复双链修复双链DNA分子中单链缺口。分子中单链缺口。三、三、DNA连接酶连接酶(DNA ligase)修复双链修复双链DNA分子中单链缺口分子中单链缺口,并可并可催化互补粘性末端的连接催化互补粘性末端的连接.主要用于主要用于cDNA第二链的合成第二链的合成.主要功能与用途：主要功能与用途：(二二)大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶 连接粘性末端可代替连接粘性末端可代替T4 DNA连接酶连接酶.四、其他修饰酶四、其他修饰酶功能：功能：催化多个催化多个脱氧脱氧核苷酸核苷酸依次加到依次加到单链单链或或双链双链DNA分子的分子的3-OH末端。末端。(一一)末端末端脱氧核苷酸脱氧核苷酸转移酶转移酶(TdT)用途：用途：1.主要作用是在载体或目的基因主要作用是在载体或目的基因 3末末端加上同源端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工粘性人工粘性末端末端，便于，便于DNA重组。重组。2.DNA 3末端的末端的同位素标记同位素标记。催化催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的糖三磷酸上的 5 磷酸基团水解磷酸基团水解。用途：用途：1.在连接反应中去除载体在连接反应中去除载体DNA片段片段5-P，防止载防止载体自我连接体自我连接.2.用用32P标记标记5末端时，用此酶去除末端时，用此酶去除5-P，再用再用激酶进行激酶进行5的的 32P标记标记.(二二)碱性磷酸酶碱性磷酸酶功能：功能：(三三)多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶(四四)RNase(五五)DNase第三节目的基因的获得和修饰-分通过基因组文库分离、筛选基因通过基因组文库分离、筛选基因通过通过cDNA文库分离、筛选基因文库分离、筛选基因应用应用PCR或或RT-PCR获得目的基因获得目的基因人工合成基因人工合成基因一、采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因采用限制性内切酶酶切法直接分离目的基因1.从原核基因组中制备从原核基因组中制备2.从真核基因组中制备从真核基因组中制备二、采用采用PCR或或RT-PCR方法制备目的基因方法制备目的基因1.获得已知的基因获得已知的基因2.构建构建RT-PCR文库法并获得未知基因文库法并获得未知基因3.计算机克隆计算机克隆三、基因组文库或基因组文库或cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选 基因组文库基因组文库(genomic library，G文库文库)用基因克隆的方法保存宿主细胞中的用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重重组分子中的集合组分子中的集合,所有重组子所含的插入片段所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。分离、筛选基因方法分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术分子杂交及探针技术 用目的基因上的一段用目的基因上的一段DNA做成做成探针探针与与文库中的文库中的DNA作作核酸杂交核酸杂交，从基因文库中，从基因文库中“钓出钓出”有目的基因的克隆。有目的基因的克隆。G文库构建方法文库构建方法：鸟枪法鸟枪法 cDNA文库文库(cDNA library，C文库文库)用用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组重组体的群体，每一重组子只含一种体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。序列。C文库构建方法文库构建方法：反转录法合成的反转录法合成的cDNA与与合适的载体重合适的载体重组并导入宿主细胞而形成的组并导入宿主细胞而形成的分离、筛选基因方法分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术：分子杂交及探针技术C文库的优势与局限性文库的优势与局限性 本方法适用于氨基酸残基数目较少的本方法适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。蛋白基因。缺点：缺点：2.如目的基因如目的基因DNA序列需序列需通过氨基酸序通过氨基酸序 列推测列推测，难于保证与，难于保证与天然基因天然基因序列一序列一 致，往往导致致，往往导致表达效率大大降低表达效率大大降低。使用使用DNA合成仪合成仪1.只能合成较小片段的DNA四、化学合成法制备基因片段四、化学合成法制备基因片段第四节目的基因的载体连接-接，分子克隆的核心一、一、PCR产物的克隆策略产物的克隆策略（一）限制性内切酶酶切位点添加法（一）限制性内切酶酶切位点添加法（二）（二）T/A克隆法克隆法定向克隆定向克隆将外源将外源DNA片段定向插入到载体中的方法片段定向插入到载体中的方法 对于双向插入，如为扩增型载体并对于双向插入，如为扩增型载体并无影响；无影响；如为表达型载体，反向插入则可导如为表达型载体，反向插入则可导致不表达，故一定要保证正向插入致不表达，故一定要保证正向插入常用方法常用方法：双酶切双酶切Nde ICATATGGTATACHindAAGCTTTTCGAATA克隆定义克隆定义 利用嗜热聚合酶如利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性赖性末端转移酶活性(在在7075活性高活性高)，使，使PCR产物的产物的3末端加一个末端加一个A的粘性的粘性端，将其直接克隆至端，将其直接克隆至3粘性末端含一个粘性末端含一个T的线性克隆载体中的线性克隆载体中.35T载体载体35载体载体T3535AAPCR产物产物常规的克隆方法：常规的克隆方法：PCR产物产物载体载体酶切酶切酶切后酶切后PCR产物产物酶切后载体酶切后载体重组重组分子分子连接连接不足：不足：需要酶切需要酶切受受酶切位点的酶切位点的限制限制TA克隆方法克隆方法(一步一步PCR克隆克隆)PCR扩增+335PCR产物产物AA5T载体载体TT5533连接连接转化转化蓝白蓝白筛选筛选校正聚合酶校正聚合酶平端平端PCR产物产物Taq酶酶dATP（一）粘性末端连接法（一）粘性末端连接法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因适用于插适用于插入片段和入片段和载体具有载体具有相同相同的粘的粘性末端性末端高背景高背景(自身环自身环化化)多拷贝插入多拷贝插入双向双向(正、反正、反)插插入入单单酶酶切切缺陷缺陷二、外源二、外源DNA片段和载体的连接片段和载体的连接（二）平头末端连接法质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因重组质粒产生粘性末端的内切酶核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！（三）人工接头法用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker)本法适用于在质粒和本法适用于在质粒和目的基因上目的基因上没有相同没有相同的的酶切位点酶切位点（四）同聚物接尾法DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶+dGTP末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点连接反应：16，16h如何实现？第五节重组分子的扩增和鉴定宿主细胞：宿主细胞：被导入重组分子的细胞被导入重组分子的细胞宿主细胞宿主细胞原核细胞原核细胞：大肠杆菌大肠杆菌、链霉菌、链霉菌 及枯草杆菌及枯草杆菌真核细胞真核细胞：酵母、昆虫细胞及：酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞哺乳动物细胞一、重组一、重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞-转转大肠杆菌的转化大肠杆菌的转化 转化转化(transformation)转化原意转化原意：细菌细胞的生物学特性由于受：细菌细胞的生物学特性由于受纳了外源纳了外源DNA而发生可遗传的改变。而发生可遗传的改变。质粒质粒DNA或以质粒为载体构建的重或以质粒为载体构建的重组组DNA导入细菌的过程导入细菌的过程转化的关键转化的关键：感受态细菌的制备：感受态细菌的制备感受态细胞感受态细胞-competent cell 用理化方法人工诱导细胞，使用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，此时的细菌称。分子的状态，此时的细菌称。转化原理及转化、转染程序转化原理及转化、转染程序大肠杆菌大肠杆菌膨胀成球形膨胀成球形CaCl204DNA抗抗DNA酶的羟基酶的羟基-钙磷酸复合物钙磷酸复合物附着附着细胞细胞表面表面42 90s热休克热休克细胞吸收细胞吸收复苏复苏分裂增殖分裂增殖原理原理化学转化法化学转化法重组质粒重组质粒的的导入方法导入方法化学法：需感受态细胞化学法：需感受态细胞电击法：不需感受态细胞电击法：不需感受态细胞转化程序：转化程序：对数生长对数生长期的细菌期的细菌CaCl204感受态细菌感受态细菌(4保存保存24h)重组质粒重组质粒DNA+细菌细菌430min热休克热休克(42,90s)普通培养普通培养基温育基温育涂布于含抗生素涂布于含抗生素的培养基平板的培养基平板单菌落单菌落倒置培养倒置培养37基因导入装置(Bio-Rad)噬菌体转染受体细胞噬菌体转染受体细胞体外包装体外包装在离体在离体条件下，将提取的包装蛋白与带条件下，将提取的包装蛋白与带COS位点的位点的DNA混合，产生噬菌体颗粒的混合，产生噬菌体颗粒的过程。过程。通过噬菌体的释放和感染将通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个从一个细胞转移到另一个细胞的过程。细胞转移到另一个细胞的过程。转导转导-transduction体外包装体外包装噬菌体的噬菌体的头部蛋白头部蛋白完整的噬菌体颗粒完整的噬菌体颗粒DNA重组重组分子分子大肠杆菌大肠杆菌体外包装液已商品化体外包装液已商品化,106噬菌斑噬菌斑/gDNA1034噬菌斑噬菌斑/gDNA二、重组二、重组DNA分子的鉴定分子的鉴定非转化子非转化子转化子转化子非重组子非重组子重组子重组子鉴定鉴定（一）抗生素平板筛选（一）抗生素平板筛选-实为插入失活法实为插入失活法AmprTetrKanrAmpsTetsKans单抗生素筛选单抗生素筛选非非转化子转化子转化子转化子阳性重组子阳性重组子自身环化载体自身环化载体未酶解完全载体未酶解完全载体非目的基因插入载体非目的基因插入载体仅仅作为初步筛选作为初步筛选AmprTerr插入失活的双抗生素对照筛选法用PstI酶切DNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPst I目的基因与pBR322经PstI酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？思考题思考题克隆克隆3,5,7,9,10 是是阳性克隆阳性克隆AmpTet平板平板123456789101112123456789101112TetTet转化子转化子非转化子非转化子(不能生长不能生长)插入失活筛选法插入失活筛选法(120)（二）（二）X-gal筛选筛选-蓝蓝/白白筛选筛选见于见于pUC系列，系列，pEGM系列，系列，M13乳糖乳糖葡萄糖葡萄糖+半乳糖半乳糖-半乳糖苷酶半乳糖苷酶（Z）-半乳糖苷酶基因来源半乳糖苷酶基因来源-Lac操纵子操纵子LacZ调节序列调节序列载体载体中中编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N-末端末端146个个AA序列序列IPTG诱导诱导宿主宿主编码的编码的-半乳糖苷酶缺陷型基因半乳糖苷酶缺陷型基因+-半乳糖苷酶半乳糖苷酶AmprMCSLacZ在Laz中插入目的基因 X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因蓝白斑筛选阳性克隆阴性克隆互互补筛选法（法（237）(三）酶切电泳鉴定三）酶切电泳鉴定琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶限制性内切酶酶切鉴定酶切鉴定快速小量提取质粒快速小量提取质粒DNA跑得跑得慢慢-重组质重组质粒粒跑得跑得快快-空载体空载体以本人课题为例以本人课题为例重组CK2 亚基转化子的筛选第2,6,8,10,11,13号克隆是阳性克隆;第1,3,4,5,7,9,12号是阴性克隆重组CK2 亚基转化子的筛选 第1,2,3,5,7,9,10,11,12,13号克隆是阳性克隆;第4,6,8号是阴性克隆1.DNA/EcoR I+Hind 2.recombinant plasmid/Nde I+Hind III3.recombinant plasmid/Hind III 4.pT7-7/Hind III 重组质粒的酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定（四）序列分析（四）序列分析以重以重组组DNA为模板，按两侧引物进行为模板，按两侧引物进行PCR可扩增可扩增插入片段插入片段可可直接进行直接进行DNA序列分析序列分析对于对于表达型表达型重组子，插入片段必需是正重组子，插入片段必需是正确的序列，一般要进行确的序列，一般要进行DNA测序测序以以本人课题为例本人课题为例ABI PRISM 310型型 DNA测序仪测序仪主要用于DNA序列分析(包括DNA测序,卫星序列、杂合子序列和三联体序列分析，单链构象多态分析,长片段PCR分析)，遗传疾病诊断，亲子鉴定等美国PE公司,95.8万元 PE 377型型 DNA测序仪测序仪PE 3700型型DNA测序仪测序仪克隆的人蛋白激酶克隆的人蛋白激酶 CK2cDNA重组质粒中插入片段重组质粒中插入片段DNA测序结果测序结果pTCKA1测序结果测序结果 Codon 25 GATGAC,AspAsppTCKA2测序结果测序结果 完全正确完全正确pTCKA3测序结果测序结果 Codon 52 GAAGAG，GluGlupTCKA4测序结果测序结果 完全正确完全正确（五）其他方法（五）其他方法内切酶内切酶重组重组DNA目的基因目的基因分离分离电泳电泳印迹到印迹到NC膜膜探针探针放射性放射性非放射性非放射性分子杂交分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交覆盖滤膜取下沾有菌落的滤膜 裂解、变性、固定等与探针杂交放射性自显影1 2 34 5 63 3和和5 5是阳性克隆是阳性克隆菌落或噬菌斑原位杂交菌落或噬菌斑原位杂交菌落印迹杂交菌落印迹杂交(603)SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western blot免疫化学检测（免疫化学检测（western blot)用已知的特异抗体检测目的基因蛋白SDS-PAGE purified recombinant human CK2 subunit and its Western blot