DNA重组技术的基本工具 课件.ppt

自 然 界 是 否 存 在 一 种 生 物 的 DNA进 入 另 一 生物 的 情 况 ？噬 菌 体 侵 染 细 菌 的 实 验 。思 考 ： 主 要 从 原 核 生 物 中 分 离 纯 化思 考一 、 限 制 性 核 酸 内 切 酶 “ 分 子 手 术 刀 ” 根 据 你 所 掌 握 的 知 识 你 能 推 测 限 制 酶 存 在 于原 核 生 物 中 的 作 用 是 什 么 吗 ？限 制 酶 在 原 核 生 物 中 主 要 起 到 切 割 外 源 DNA使 之 失 效 ， 从 而 达 到 保 护 自 身 的 目 的 。 现 在 已 经 从 约 300种 微 生 物 中 分 离 出 了 约4000种 限 制 性 内 核 酸 切 酶 (限 制 酶 )。 练 习 ： 流 感 嗜 血 杆 菌 的 d菌 株( Haemophilus influenzae d )中 先 后 分 离 到 3种 限 制 酶 ， 则 分别 命 名 为 :H ind 、 H ind 、 H ind一 、 限 制 性 核 酸 内 切 酶 “ 分 子 手 术 刀 ”粘 质 沙 雷 氏 杆 菌（ Serratia marcesens）Sma 大 肠 杆 菌（ Escherichia coli R）EcoR （ 1） 识 别 双 链 DNA分 子 的 某 种 特 定 的 核 苷 酸 序 列例 如 ： 大 肠 杆 菌 的 EcoR 限 制 酶 只 能 识 别 GAATTC序列 ，一 、 限 制 性 核 酸 内 切 酶 “ 分 子 手 术 刀 ”（ 2） 在 特 定 的 位 点 切 割 DNA分 子 。并 在 G和 A之 间 切 开 。特 异 性 能 被 限 制 性 内 切酶 特 异 性 识 别 的 切 割部 位 都 具 有 回 文 序 列 ：在 切 割 部 位 ， 一 条 链正 向 读 的 碱 基 顺 序 与另 一 条 链 反 向 读 的 顺序 完 全 一 致 。 切 割 DNA分 子 实 质 是 断 开 两 个核 苷 酸 之 间 的 磷 酸 二 酯 键 。 产 生 黏 性 末 端 或 平 末 端一 、 限 制 性 核 酸 内 切 酶 “ 分 子 手 术 刀 ” 平 末 端 平 末 端 脱 氧 核 糖 和 磷 酸催 化 磷 酸 二 酯 键 形 成二 、 DNA连 接 酶 “ 分 子 缝 合 针 ” 3. 种 类 ： （ 1） EcoliDNA连 接 酶 （ 2） T4DNA连 接 酶恢 复磷 酸二 酯 键 只 能 连 接 黏 性 末 端能 连 接 黏 性 末 端 和平 末 端 (效 率 较 低 )二 、 DNA连 接 酶 “ 分 子 缝 合 针 ” DNA聚 合 酶 DNA连 接 酶模 板作 用 底 物作 用 特 点相 同 点 DNA连 接 酶 与 DNA聚 合 酶 是 一 回 事 吗 ?为 什 么 ?形 成 磷 酸 二 酯 键以 一 条 DNA链 为 模 板 ，单 个 核 苷 酸 连 接 成一 条 互 补 的 DNA链 将 DNA双 链 上 的 两 个缺 口 同 时 连 接 起 来 ，不 需 要 模 板需 要 不 需 要单 个 脱 氧 核 苷 酸 DNA分 子 片 段 运 载 体 必 备 的 条 件 ： 在 受 体 细 胞 中 能 自 我 复 制 并 稳 定 保 存 有 1个 至 多 个 限 制 酶 切 割 位 点 有 特 殊 的 标 记 基 因 ， 便 于 鉴 定 和 选 择 对 受 体 细 胞 的 生 存 无 决 定 性 作 用 常 用 运 载 体 ： 质 粒 噬 菌 体 的 衍 生 物 动 植 物 病 毒三 、 基 因 进 入 受 体 细 胞 的 载 体 “ 分 子 运 输 车 ” 常 存 在 于 原 核 细 胞 中 ， 是 一 种 裸 露 的 、 结 构 简 单 、 独立 于 拟 核 之 外 能 自 我 复 制 的 很 小 的 双 链 环 状 DNA分 子 。