生物大分子分离纯

生 物 大 分 子 分 离 纯 化 及肝 酶 提 取 一 、 生 物 大 分 子 的 分 离 与 纯 化 技 术二 、 肝 酶 提 取 引 言 在 自 然 科 学 ， 尤 其 是 生 命 科 学 高 度 发 展的 今 天 ， 蛋 白 质 、 酶 和 核 酸 等 生 物 大 分 子 的结 构 与 功 能 的 研 究 是 探 求 生 命 奥 秘 的 中 心 课题 ， 而 生 物 大 分 子 结 构 与 功 能 的 研 究 ， 必 须首 先 解 决 生 物 大 分 子 的 制 备 问 题 ， 有 能 够 达到 足 够 纯 度 的 生 物 大 分 子 的 制 备 工 作 为 前 题 ，结 构 与 功 能 的 研 究 就 无 从 谈 起 。 然 而 生 物 大分 子 的 分 离 纯 化 与 制 备 是 一 件 十 分 细 致 而 困难 的 工 作 。 什 么 是 生 物 大 分 子 ？ 生 物 体 内 结 构 具 有 一 定 的 规 律性 ， 由 基 本 结 构 单 位 按 一 定 顺 序 和方 式 连 接 而 形 成 的 多 聚 体 称 为 生 物大 分 子 。 其 分 子 量 一 般 大 于 10000。有 ： 蛋 白 质 (包 括 酶 )、 多 聚 糖 和 核酸 类 化 合 物 等 。 生 物 大 分 子 分 离 纯 化 的 特 殊 性 生 物 材 料 的 组 成 极 其 复 杂 ， 常 常 包 含 有 数 百 种乃 至 几 千 种 化 合 物 。 许 多 生 物 大 分 子 在 生 物 材 料 中 的 含 量 极 微 ，分 离 纯 化 的 步 骤 繁 多 ， 流 程 长 。 许 多 生 物 大 分 子 一 旦 离 开 了 生 物 体 内 的 环 境时 就 极 易 失 活 ， 因 此 分 离 过 程 中 如 何 防 止 其 失 活 ，就 是 生 物 大 分 子 提 取 制 备 最 困 难 之 处 。 生 物 大 分 子 的 制 备 几 乎 都 是 在 溶 液 中 进 行 的 ，温 度 、 pH值 、 离 子 强 度 等 各 种 参 数 对 溶 液 中 各 种组 成 的 综 合 影 响 ， 很 难 准 确 估 计 和 判 断 。 设 计 思 路 前 期 准 备 生 物 材 料 的 选 择及 预 处 理组 织 与 细 胞 破 碎初 级 提 取 分 离精 细 分 离 纯 化 纯 度 鉴 定产 物 处 理 前 期 准 备一 、 明 确 目 的 和 要 求二 、 了 解 的 生 物 大 分 子 的 物 学 性 质 1)在 水 和 各 种 有 机 溶 剂 中 的 溶 解 性 。 2)在 不 同 温 度 、 pH 值 和 各 种 缓 冲 液 中 生 物 大 分 子 的稳 定 性 3)固 态 时 对 温 度 、 含 水 量 和 冻 干 时 的 稳 定 性 。 4)各 种 物 理 性 质 ： 如 分 子 的 大 小 、 穿 膜 的 能 力 、 带 电的 情 况 、 在 电 场 中 的 行 为 、 离 心 沉 降 的 表 现 、 在 各 种 凝 胶 、树 脂 等 填 料 中 的 分 配 系 数 5)其 他 化 学 性 质 ： 如 对 各 种 蛋 白 酶 、 水 解 酶 的 稳 定 性和 对 各 种 化 学 试 剂 的 稳 定 性 。 6)对 其 他 生 物 分 子 的 特 殊 亲 和 力 。 生 物 材 料 选 择 制 备 生 物 大 分 子 ， 首 先 要 选 择 适 当 的 生 物 材 料 。 材 料 的 来 源无 非 是 动 物 、 植 物 和 微 生 物 及 其 代 谢 产 物 。 选 择 的 材 料 应 含 量 高 、 来 源 丰 富 、 制 备 工 艺 简 单 、 成 本低 ， 尽 可 能 保 持 新 鲜 ， 尽 快 加 工 处 理 。 动 物 组 织 要 先 除 去 结 缔 组 织 、 脂 肪 等 非 活 性 部 分 ， 绞 碎后 在 适 当 的 溶 剂 中 提 取 ， 如 果 所 要 求 的 成 分 在 细 胞 内 ， 则 要 先破 碎 细 胞 。 植 物 要 先 去 壳 、 除 脂 。 微 生 物 材 料 要 及 时 将 菌 体 与 发 酵 液 分 开 。 生 物 材 料 如 暂 不 提 取 ， 应 冰 冻 保 存 。 动 物 材 料 则 需 深 度冷 冻 保 存 。 组 织 细 胞 的 破 碎 不 同 的 生 物 体 或 同 一 生 物 体 的 不 同 部 位 的 组 织 ， 其 细 胞 破碎 的 难 易 不 一 ， 使 用 的 方 法 也 不 相 同 ， 如 动 物 脏 器 的 细 胞膜 较 脆 弱 ， 容 易 破 碎 ， 植 物 和 微 生 物 由 于 具 有 较 坚 固 的 纤维 素 、 半 纤 维 素 组 成 的 细 胞 壁 ， 要 采 取 专 门 的 细 胞 破 碎 方法 。(1)机 械 法 ：1) 研 磨 ： 将 剪 碎 的 动 物 组 织 置 于 研 钵 或 匀 浆 器 中 ， 加 入 少量 石 英 砂 研 磨 或 匀 浆 。2) 组 织 捣 碎 器 ： 这 是 一 种 较 剧 烈 的 破 碎 细 胞 的 方 法 ， 通 常可 先 用 家 用 食 品 加 工 机 将 组 织 打 碎 ， 然 后 再 用10000r/min 20000r/min的 内 刀 式 组 织 捣 碎 机 (即 高 速 分散 器 )将 组 织 的 细 胞 打 碎 。 (2)物 理 法 ：1) 反 复 冻 融 法 ： 将 待 破 碎 的 细 胞 冷 至 15 到 20 ， 然后 放 于 室 温 (或 40 )迅 速 融 化 ， 如 此 反 复 冻 融 多 次 ， 由 于细 胞 内 形 成 冰 粒 使 剩 余 胞 液 的 盐 浓 度 增 高 而 引 起 细 胞 溶 胀破 碎 。2) 超 声 波 处 理 法 ： 此 法 是 借 助 超 声 波 的 振 动 力 破 碎 细 胞 壁和 细 胞 器 。 破 碎 微 生 物 细 菌 和 酵 母 菌 时 ， 时 间 要 长 一 些 。3) 压 榨 法 ： 这 是 一 种 温 和 的 、 彻 底 破 碎 细 胞 的 方 法 。 在1000 105Pa 2000 105Pa 的 高 压 下 使 细 胞 悬 液 通 过 一个 小 孔 突 然 释 放 至 常 压 ， 细 胞 将 彻 底 破 碎 。4) 冷 热 交 替 法 ： 从 细 菌 或 病 毒 中 提 取 蛋 白 质 和 核 酸 时 可 用此 法 。 在 90 左 右 维 持 数 分 钟 ， 立 即 放 入 冰 浴 中 使 之 冷 却 ，如 此 反 复 多 次 ， 绝 大 部 分 细 胞 可 以 被 破 碎 。 (3)化 学 与 生 物 化 学 方 法 ：1) 自 溶 法 ： 将 新 鲜 的 生 物 材 料 存 放 于 一 定 的 pH和 适 当 的 温 度下 ， 细 胞 结 构 在 自 身 所 具 有 的 各 种 水 解 酶 （ 如 蛋 白 酶 和 酯 酶 等 ）的 作 用 下 发 生 溶 解 ， 使 细 胞 内 含 物 释 放 出 来 。2) 溶 胀 法 ： 细 胞 膜 为 天 然 的 半 透 膜 ， 在 低 渗 溶 液 和 低 浓 度 的 稀盐 溶 液 中 ， 由 于 存 在 渗 透 压 差 ， 溶 剂 分 子 大 量 进 入 细 胞 ， 将 细胞 膜 胀 破 释 放 出 细 胞 内 含 物 。 3) 酶 解 法 ： 利 用 各 种 水 解 酶 ， 如 溶 菌 酶 、 纤 维 素 酶 、 蜗 牛 酶和 酯 酶 等 ， 于 37 ， pH8， 处 理 15分 钟 ， 可 以 专 一 性 地 将 细 胞壁 分 解 。 4) 有 机 溶 剂 处 理 法 ： 利 用 氯 仿 、 甲 苯 、 丙 酮 等 脂 溶 性 溶 剂 或SDS（ 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ） 等 表 面 活 性 剂 处 理 细 胞 ， 可 将 细 胞 膜溶 解 ， 从 而 使 细 胞 破 裂 ， 此 法 也 可 以 与 研 磨 法 联 合 使 用 。 “提 取 ” 是 在 分 离 纯 化 之 前 将 经 过 预 处 理 或 破 碎 的 细 胞 置 于 溶 剂 中 ， 使被 分 离 的 生 物 大 分 子 充 分 地 释 放 到 溶 剂 中 ， 并 尽 可 能 保 持 原 来 的 天 然 状态 不 丢 失 生 物 活 性 的 过 程 。 影 响 提 取 的 因 素 主 要 有 ： 目 的 产 物 在 提 取 的 溶 剂 中 溶 解 度 的 大 小 ； 由 固 相 扩 散 到 液 相 的 难 易 ； 溶 剂 的 pH值 和 提 取 时 间 等 。通 常 ： 极 性 物 质 易 溶 于 极 性 溶 剂 ， 非 极 性 物 质 易 溶 于 非 极 性 溶 剂 ； 碱 性 物 质 易 溶 于 酸 性 溶 剂 ， 酸 性 物 质 易 溶 于 碱 性 溶 剂 ； 温 度 升 高 ， 溶 解 度 加 大 ； 远 离 等 电 点 的 pH值 ， 溶 解 度 增 加 。 提 取 时 所 选 择 的 条 件 应 有 利 于 目 的 产 物 溶 解 度 的 增 加 和 保 持 其 生 物 活 性 。 生 物 大 分 子 的 提 取 水 溶 液 提 取 ： 蛋 白 质 和 酶 的 提 取 一 般 以 水溶 液 为 主 。 稀 盐 溶 液 和 缓 冲 液 对 蛋 白 质 的 稳定 性 好 ， 溶 解 度 大 ， 是 提 取 蛋 白 质 和 酶 最 常用 的 溶 剂 。 有 机 溶 剂 提 取 ： 一 些 和 脂 类 结 合 比 较 牢 固或 分 子 中 非 极 性 侧 链 较 多 的 蛋 白 质 和 酶 难 溶于 水 、 稀 盐 、 稀 酸 、 或 稀 碱 中 ， 常 用 不 同 比例 的 有 机 溶 剂 提 取 。 分 离 纯 化 刚 提 取 得 到 的 大 分 子 物 质 ， 往 往 是 粗 制 品 ，含 有 许 多 杂 质 ， 必 须 进 一 步 分 离 纯 化 。 分离 提 纯 各 种 生 物 大 分 子 ， 主 要 根 据 各 种 物质 的 分 子 大 小 、 溶 解 度 、 带 电 性 、 亲 和 力大 小 等 差 异 ， 选 用 有 机 溶 剂 沉 淀 ， 等 电 点沉 淀 ， 盐 析 ， 层 析 ， 电 泳 ， 超 离 心 ， 吸 附 ，结 晶 等 方 法 分 离纯 化 刚 提 取 得 到 的 大 分 子 物 质 ， 往 往 是 粗 制 品 ， 含 有 许 多杂 质 ， 必 须 进 一 步 分 离 纯 化 。 分 离 提 纯 各 种 生 物 大 分子 ， 主 要 根 据 各 种 物 质 的 分 子 大 小 、 溶 解 度 、 带 电 性 、亲 和 力 大 小 等 差 异 ， 选 用 有 机 溶 剂 沉 淀 ， 等 电 点 沉 淀 ，盐 析 ， 层 析 ， 电 泳 ， 超 离 心 ， 吸 附 ， 结 晶 等 方 法 。离 子 交 换 层 析 法 电 泳 法电 荷 性 质 的 差 异分 子 大 小 形 状 差 异 凝 胶 过 滤 法 超 滤 法 透 析 法 离 心 法溶 解 度 差 异 分 配 层 析 萃 取结 晶 盐 析有 机 溶 剂 沉 淀 选 择 性 沉 淀沉淀法 产 品 处 理 浓 缩 、 干 燥 经 过 分 离 、 纯 化 得 到 的 提 取 液 有 时 很 稀 ， 体 积 较大 ， 需 要 采 用 蒸 馏 法 、 冰 冻 法 、 吸 收 法 、 超 滤 法等 ， 去 除 水 分 而 浓 缩 、 干 燥 。 保 存 保 存 应 在 低 温 避 光 环 境 下 ， 有 时 还 需 加 入 防 腐 剂或 稳 定 剂 ， 防 止 生 物 大 分 子 变 性 失 活 。 肝 酶 分 离 纯 化 与 鉴 定 设 计 从 动 物 肝 组 织 中 分 离 、 提 取 、 纯化 、 和 鉴 定 一 种 酶 （ 该 酶 由 不 同 的 亚 基 组成 ， 为 结 合 酶 ， pI=6.2） 的 技 术 路 线 ， 并 说明 试 验 各 步 骤 的 原 理 相 关 问 题 亚 基 ： 组 成 蛋 白 质 四 级 结 构 最 小 的 共 价 单 位 ， 是 指 四 级结 构 的 蛋 白 质 中 具 有 三 级 结 构 的 球 蛋 白 结 合 酶 ： 分 蛋 白 质 部 分 ： 酶 蛋 白 (apoenzyme)和 辅 助 因 子(cofactor)， 辅 助 因 子 中 含 金 属 离 子 、 小 分 子 化 合 物 PI： 等 电 点 ： 在 某 一 pH的 溶 液 中 ， 氨 基 酸 解 离 成 阳 离 子和 阴 离 子 的 趋 势 及 程 度 相 等 ， 所 带 净 电 荷 为 零 ， 呈 电 中 性 ，此 时 溶 液 的 pH称 为 该 氨 基 酸 的 等 电 点 。 取 动 物 肝 脏 组 织制 作 组 织 浆 液所 需 蛋 白 的 粗 提 蛋 白 的 纯 化活 性 的 检 验凝 胶 电 泳 鉴 定 提 取 纯 度实 验 主 要 流 程 取 动 物 肝 脏 组 织 材 料 选 择 。 选 取 新 鲜 的 ， 饥 饿 24小 时 的 动物 的 肝 脏 ， 生 理 盐 水 多 次 洗 涤 ， 低 温 保 存 。 制 作 组 织 浆 液取 新 鲜 动 物 肝 脏 剪 碎冰 放 进 培 养 皿 中 移入匀浆器过 滤匀 浆 液为 减 低 研 磨 或 匀 浆 过 程 中 发 热 ， 所 用器 皿 和 溶 液 需 要 预 冷 蛋 白 质 的 粗 提原 理 中 性 盐 类 能 破 坏 溶 液 中 蛋 白 分 子 表 面 的双 电 层 和 水 膜 ， 从 而 使 蛋 白 质 从 溶 液 中凝 聚 沉 淀 析 出 。 （ 但 沉 淀 不 同 的 蛋 白 质所 需 盐 类 的 浓 度 不 同 。 例 如 ， 50 饱 和的 硫 酸 铵 能 使 血 清 中 的 球 蛋 白 沉 淀 ， 而33 饱 和 的 硫 酸 铵 则 使 -球 蛋 白 沉 淀 。 ）因 此 ， 可 根 据 所 要 分 离 的 蛋 白 质 ， 选 择不 同 饱 和 度 的 硫 酸 铵 溶 液 进 行 盐 析 。 加 磷 酸 缓 冲 溶 液 、 再 加 硫 酸 铵 饱 和 溶 液 。 要 在 搅 拌 下 缓慢 匀 少 量 多 次 地 加 入 尽 量 避 免 局 部 硫 酸 铵 浓 度 过 大 而 造成 不 应 有 的 蛋 白 质 沉 淀 。 在 低 浓 度 硫 酸 铵 中 盐 析 可 采 用 离 心 分 离 。匀 浆 液 +药 品 混 匀 转 移 离 心粗 蛋 白 等 电 点 沉 淀 技 术 许 多 蛋 白 质 在 其 等 电 点 （ pI） 处 净 电 荷 为零 ， 溶 解 度 最 低 ， 可 以 沉 淀 出 来 。 故 选 用适 当 的 缓 冲 液 ， 调 节 pH， 可 将 目 的 物 以 沉淀 状 态 分 离 ， 再 重 新 溶 于 适 当 的 缓 冲 液 ，以 供 进 一 步 纯 可 尝 试 调 配 pi=6.2 ， 沉 淀 所 需 蛋 白 。 蛋 白 的 纯 化 层 析 ： 离 子 交 换 层 析 ： 定 相 是 具 有 固 定 电 荷 的 离 子 交 换 剂 ，动 相 是 具 有 不 同 PH值 和 离 子 强 度 的 溶 液 凝 胶 层 析 ： 又 称 凝 胶 过 滤 、 分 子 筛 层 析 、 凝 胶 渗 透 层析 等 。 主 要 是 根 据 多 孔 凝 胶 对 不 同 大 小 分 子 的 排 阻 效应 不 同 而 进 行 分 离 的 。 吸 附 层 析 ： 主 要 根 据 物 质 对 活 性 固 体 表 面 吸 附 亲 和 力的 差 异 来 分 离 。 分 配 层 析 ： 是 根 据 素 质 在 定 相 中 溶 解 度 的 差 异 或 在定 相 和 动 相 中 溶 解 度 的 差 异 来 进 行 分 离 的 亲 和 层 析 ： 是 根 据 生 物 大 分 子 的 生 物 特 异 性 吸 附 来 进行 分 离 的 。 粗 蛋 白 纯化蛋白 活 性 的 检 验 根 据 不 同 的 蛋 白 酶 的 不 同 结 构 ， 有 相 对 的药 品 进 行 检 验 ， 造 成 颜 色 反 应 等 。 如 谷 丙 转 氨 酶 加 丙 氨 酸 和 a-酮 戊 二 酸 ， 生 成丙 酮 酸 和 谷 氨 酸 ， 再 加 显 色 剂 2， 4-二 硝 基苯 肼 生 成 丙 酮 酸 二 硝 基 苯 肼 ， 用 比 色 法 ，可 计 算 其 活 性 。 纯 化 蛋 白标 准 蛋 白 SDS凝 胶电 泳 根 据 与 标 准 蛋白 的 比 对 鉴 定出 蛋 白