67 kD层粘连蛋白受体对HepG2细胞增殖的影响

67 kD层粘连蛋白受体对HepG2细胞增殖的影响 目的 探讨67 kD层粘连蛋白受体(67LR)与肝癌细胞生长增殖的关系。 方法 流式细胞术检测67LR 转染的HepG2细胞稳定株细胞膜表面67LR的表达,采用CCK-8试剂盒测定细胞生长曲线,将不同细胞接种于裸鼠皮下,观察其成瘤能力的差异,采用免疫组织化学分析细胞增殖核抗原Ki-67的表达。 结果 67LR高表达的HepG2细胞株其细胞增殖速度明显降低,从第2 d开始有明显差异(P受体,层粘连蛋白; 癌,肝细胞; 肿瘤细胞,培养的; 细胞增殖ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect of 67 kD laminin receptor(67LR) on the proliferation of hepatocellular carcinoma cell.MethodsOne subclone with high expression of membrance 67LR(LR4), and another subclone with low expression of membrance 67LR(LR6), besides their controll(pcDNA-1) were used.The expression of 67LR was detected by flow cytometric analysis.Cell viability was measured using cell counting Kit-8.Cells were subcutaneously injected into nude mice and the grown tumors were weighted after 6 weeks.The expression of Ki-67 in each tumors was detected by immunohistochemistry.ResultsThe growth of LR4 cells was significantly slower than LR6 and pcDNA-1 since the second day(PKEY WORDS:receptors,laminin; carcinoma,hepatocellular; tumor cells,cultured; cell proliferation层粘连蛋白是细胞外基质重要的糖蛋白,与肿瘤细胞表达的相应受体相互作用,影响肿瘤的侵袭和转移。目前已经发现有多种受体可以和层粘连蛋白结合,其中某些受体的表达水平与肝癌发生、发展及预后存在密切关系1。Ozaki等应用RT-PCR技术对肝癌中多种层粘连蛋白受体的表达进行研究,发现67 kD层粘连蛋白受体(67 kD laminin receptor,67LR)与整合素6、1的表达均显著高于非癌组织2。Zheng等发现转移性肝癌67LR无论在蛋白水平还是在mRNA水平均显著高于非转移肝癌3,表明67LR在肝癌的转移中起着重要作用。笔者探讨体外转染67LR后细胞膜表面67LR高表达的HepG2细胞生长增殖的变化。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞培养HepG2肝癌细胞(中国科学院上海细胞研究所细胞库),用含10%新生牛血清RPMI-1640培养液(美国Gibco BRL公司),置于体积分数为0.05的CO2、饱和水汽、37 培养箱中培养。转染67LR的HepG2稳定细胞株LR4、LR6;转染空载体的HepG2细胞株pcDNA-1为对照组,由本实验室筛选获得,按上述方法培养并保种。1.1.2动物5周龄BALB/c-nu/nu裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司)30只,雌雄各半,由福建医科大学实验动物中心饲养,实验和饲养均在SPF条件下超净层流架中进行,灭菌处理的水和饲料供动物自由饮用。1.1.3主要试剂鼠抗67LR抗体(克隆号:MuLC5,美国NeoMarker公司),FITC标记的兔抗鼠IgG(深圳晶美生物工程有限公司),细胞增殖和毒性检测试剂盒(CCK-8,日本熊本市同仁化学研究所),小鼠抗人Ki-67单克隆抗体以及S-P免疫组织化学试剂盒(美国Maxim公司)。1.2方法1.2.1检测细胞膜表面67LR表达LR4、LR6与pcDNA-1细胞株复苏后培养至对数生长期,各取1瓶,胰酶消化后用4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗2遍,制成106mL-1细胞悬液,加入鼠抗67LR抗体,4 孵育过夜,PBS洗2遍,加入FITC标记的兔抗小鼠二抗,37 孵育45 min,PBS洗3遍,重悬细胞,用只加二抗的细胞作为对照,在流式细胞仪上分析荧光强度。1.2.2绘制细胞生长曲线采用CCK-8试剂盒并按说明书进行操作。各取1瓶对数生长期的LR4、LR6及pcDNA-1细胞,胰酶消化后计数,接种于96孔培养皿,每孔2 500个细胞,每隔24 h将CCK-8 10 L(按101)加入待测孔中,37 继续培养1 h,读取光密度值D(450 nm),每组每次三复孔,计算均值和标准差,连续测量7 d,绘制生长曲线图,重复3次。1.2.3裸鼠体内成瘤实验收集对数生长期的LR4、LR6及pcDNA-1细胞,用胰酶消化,计数,裸鼠右后肢皮下接种,每组10只,雌雄各半,每只0.2 mL含107个细胞,观察裸鼠的生活状况及局部肿瘤生长情况。6周后,取裸鼠皮下移植瘤,称质量。1.2.4检测增殖细胞核抗原Ki-67新鲜裸鼠移植瘤标本经福尔马林固定,常规石蜡包埋,4 m厚度连续切片。采用链菌素亲生物素-过氧化酶连接图4裸鼠移植瘤Ki-67表达(S-P法 200)Fig 4Expression of Ki-67 in transplanted tumor by immunohistochemistry (S-P200)法(S-P)免疫组织化学染色方法,应用Ki-67抗体检测细胞增殖指数,抗体工作浓度为150,按照说明书操作。阳性染色为细胞核呈现深棕色颗粒,每张切片上观察5个高倍视野,随机计数1 000个细胞中的阳性细胞数,即为标记细胞数,计算阳性率。2结果2.1细胞膜表面67LR表达复苏后HepG2 LR4、LR6及pcDNA-1细胞经流式细胞术检测细胞膜表面67LR表达,其中pcDNA-1基本不表达67LR,而LR6低表达,LR4高表达(图1)。图1流式细胞术分析HepG2 LR4、LR6与pcDNA-1细胞膜表面67LR的表达Fig 1The expression of 67LR on HepG2 pcDNA-1,LR4 and LR6 cell membrance detected by flow cytometric analysis2.2细胞生长曲线采用CCK-8试剂盒测定,组间差异较小,重复性良好。LR6、LR4与pcDNA-1细胞的生长曲线见图2。细胞膜67LR低表达细胞株LR6生长速度比pcDNA-1略慢,但差别无统计学意义(P0.05,n=3),而细胞膜67LR高表达的细胞株LR4与pcDNA-1以及LR6组比较,生长速度明显下降,从第2 天开始,D(450 nm)就有明显差异(P