实验二DNA的酶切、电泳与Southern杂交

实 验 目 的学 习 并 掌 握 DNA酶 切 、 电 泳 技 术学 习 掌 握 Southern杂 交 的 原 理 和 技 术 实 验 原 理限 制 性 内 切 酶 能 特 异 地 结 合 于 一 段 被 称 为 限 制 性 酶 识 别 序 列 的DNA序 列 之 内 或 其 附 近 的 特 异 位 点 上 ， 并 切 割 双 链 DNA。 它 可分 为 三 类 ：类和类酶在 同 一 蛋 白质分 子 中 兼 有 切 割 和 修饰（甲 基 化 ）作 用且 依赖于 ATP的 存 在 。类酶结合 于识别位 点 并 随 机 的 切 割识别位 点 不远处的 DNA，而类酶在识别位 点 上 切 割 DNA分 子 ，然 后从 底 物 上 解 离 。类由 两 种酶组成 ： 一 种为限 制 性 内 切 核 酸酶（限 制酶）,它 切 割 某一 特 异 的 核 苷 酸 序 列 ； 另 一 种为独 立 的 甲 基 化酶，它 修饰同 一识别序 列 。 类中 的 限 制 性 内 切酶在 分 子 克 隆 中 得 到 了 广 泛应用 ，它们是 重组DNA的 基础。 类 中 的 限 制 性 内 切 酶 在 分 子 克 隆 中 得 到 了 广 泛 应 用 ， 它 们 是 重 组DNA的 基 础 。绝 大 多 数 类 限 制 酶 识 别 长 度 为 4至 6个 核 苷 酸 的 回 文 对 称 特 异 核 苷酸 序 列 (如 EcoR 识 别 六 个 核 苷 酸 序 列 ： 5- G AATTC-3)， 有 少 数酶 识 别 更 长 的 序 列 或 简 并 序 列 。 类 酶 切 割 位 点 在 识 别 序 列 中 ， 有 的 在 对 称 轴 处 切 割 ,产 生 平 末 端 的DNA片 段 (如 Sma ： 5-CCC GGG-3);有 的 切 割 位 点 在 对 称 轴 一 侧 ，产 生 带 有 单 链 突 出 末 端 的 DNA片 段 称 粘 性 未 端 ， 如 EcoR 切 割 识别 序 列 后 产 生 两 个 互 补 的 粘 性 末 端 。 5 5GAATTCCTTAAG GAATTCCTTAAGEcoRI 5GCTTAA pAATTCG5 p 5 5GAATTCCTTAAG GAATTCCTTAAGEcoRI 5GCTTAA pAATTCG5 p5 5AGCTTCGAAlu I 5AGTC pCTGA5 p AGCTTCGA酶切后平末端酶切后粘性末端 DNA纯 度 、 缓 冲 液 、 温 度 条 件 及 限 制 性 内 切 酶 本 身 都 会 影 响 限 制性 内 切 酶 的 活 性 。大 部 分 限 制 性 内 切 酶 不 受 RNA或 单 链 DNA的 影 响 。 当 微 量 的 污 染物 进 入 限 制 性 内 切 酶 贮 存 液 中 时 ， 会 影 响 其 进 一 步 使 用 ， 因 此 在吸 取 限 制 性 内 切 酶 时 ， 每 次 都 要 用 新 的 吸 管 头 。如 果 采 用 两 种 限 制 性 内 切 酶 ， 必 须 要 注 意 分 别 提 供 各 自 的 最 适 盐浓 度 。 若 两 者 可 用 同 一 缓 冲 液 ,则 可 同 时 水 解 。 若 需 要 不 同 的 盐 浓度 ,则 低 盐 浓 度 的 限 制 性 内 切 酶 必 须 首 先 使 用 ， 随 后 调 节 盐 浓 度 ，再 用 高 盐 浓 度 的 限 制 性 内 切 酶 水 解 。 也 可 在 第 一 个 酶 切 反 应 完 成后 ， 用 等 体 积 酚 /氯 仿 抽 提 ， 加 0.1倍 体 积 3mol/L NaAc和 2倍 体 积无 水 乙 醇 ， 混 匀 后 置 -70 低 温 冰 箱 30分 钟 ， 离 心 、 干 燥 并 重 新 溶于 缓 冲 液 后 进 行 第 二 个 酶 切 反 应 。酶 切 过 程 中 的 注 意 事 项 在 酶 切 过 程 中 ， 为 了 获 得 条 带 清 晰 的 电 泳 图 谱 ， 一 般 DNA用 量 约为 0.5-1g。限 制 性 内 切 酶 的 酶 解 反 应 最 适 条 件 各 不 相 同 ,各 种 酶 有 其 相 应 的 酶切 缓 冲 液 和 最 适 反 应 温 度 (大 多 数 为 37 )。对 质 粒 DNA酶 切 反 应 而 言 , 限 制 性 内 切 酶 用 量 可 按 标 准 体 系 1g DNA加 1单 位 酶 ,消 化 1-2小 时 。 但 要 完 全 酶 解 则 必 须 增 加 酶 的 用 量 ,一 般 增 加 2-3倍 ,甚 至 更 多 ,反 应 时 间 也 要 适 当 延 长 。酶 切 过 程 中 的 注 意 事 项 DNA限 制 性 内 切 酶 酶 切 图 谱 又 称 DNA的 物 理 图 谱 ， 它 由 一 系 列位 置 确 定 的 多 种 限 制 性 内 切 酶 酶 切 位 点 组 成 ， 以 直 线 或 环 状 图 式表 示 。 在 DNA序 列 分 析 、 基 因 组 的 功 能 图 谱 绘 制 、 DNA的 无 性繁 殖 、 基 因 文 库 的 构 建 等 工 作 中 ， 建 立 限 制 性 内 切 酶 图 谱 都 是 不可 缺 少 的 环 节 ， 近 年 来 发 展 起 来 的 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 (RFLP)技 术 更 是 建 立 在 它 的 基 础 之 上 。技 术 应 用 DNA限 制 性 内 切 酶 酶 切 图 谱目 标 DNA片 段 分 析基 因 工 程 中 外 源 DNA与 载 体 的 连 接 目 标 DNA片 段 分 析 基 因 工 程 中 外 源 DNA与 载 体 的 连 接 DNA限 制 性 内 切 酶 酶 切 图 谱 Southern杂 交 建 立 酶 切 反 应 体 系适 量 DNA2ul 10 x限 制 性 内 切 酶 缓 冲 液2ul 40 mmol/L spermidine1ul 100 mmol/L DTT限 制 性 内 切 酶 2 /ug DNA加 ddH2O定 容 至 20ul注 意 ： 酶 、 缓 冲 液 等 需 置 于 冰 上 ； 反 应 中 酶 应 该 是 最 后 一 个 加 入 的 试 剂 。37摄 氏 度 保 温 1小 时 Southern杂 交 技 术 原 理 与 流 程Southern印 迹 杂 交 （ Southern blot） 是 1975年 由 英 国 人 southern创 建 ，是 研 究 DNA图 谱 的 基 本 技 术 ， 在 遗 传 病 诊 断 、 DNA图 谱 分 析 及PCR产 物 分 析 等 方 面 有 重 要 价 值 。基 本 原 理 ： 具 有 一 定 同 源 性 的 两 条 核 酸 单 链 在 一 定 的 条 件 下 ， 可 按碱 基 互 补 的 原 则 形 成 双 链 ， 此 杂 交 过 程 是 高 度 特 异 的 。 由 核 酸 分 子的 高 度 特 异 性 及 检 测 方 法 的 灵 敏 性 ， 综 合 凝 胶 电 泳 和 核 酸 内 切 酶 的分 析 结 果 ， 便 可 绘 制 出 DNA分 子 的 限 制 图 谱 。 但 为 了 进 一 步 构 建出 DNA分 子 的 遗 传 图 ， 或 进 行 目 的 基 因 序 列 的 测 定 以 满 足 基 因 克隆 的 特 殊 要 求 ， 还 必 需 掌 握 DNA分 子 中 基 因 编 码 区 的 大 小 和 位 置 。这 类 数 据 资 料 均 可 应 用 Southern杂 交 技 术 获 得 。 Southern印 迹 杂 交 技 术 包 括 两 个 主 要 过 程 ：1、 将 待 测 定 核 酸 分 子 通 过 一 定 的 方 法 转 移 并 结 合 到一 定 的 固 相 支 持 物 （ 硝 酸 纤 维 素 膜 或 尼 龙 膜 ） 上 ，即 印 迹 （ blotting） ；2、 固 定 于 膜 上 的 核 酸 同 位 素 标 记 的 探 针 在 一 定 的 温度 和 离 子 强 度 下 退 火 ， 即 分 子 杂 交 过 程 。 Southern印 迹 杂 交 基 本 方 法 及 主 要 步 骤一 、 待 测 核 酸 样 品 的 制 备（ 一 ） 制 备 待 测 DNA（ 二 ） DNA限 制 酶 消 化二 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 待 测 DNA样 品三 、 电 泳 凝 胶 预 处 理四 、 转 膜五 、 探 针 标 记六 、 预 杂 交 （ prehybridizafion）七 、 Southern杂 交 八 、 洗 膜九 、 放 射 性 自 显 影 检 测 1天1天1天1天2天1天3-7天 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离 待 测 DNA样 品0.9%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳建 议 大 家 使 用 大 胶 进 行 电 泳20-30V电 泳 (过 夜 电 泳 )Southern印 迹 杂 交 是 先 将 DNA样 品 (含 不 同 大 小 的 DNA片 段 )先 按 片 断 长短 进 行 分 离 ， 然 后 进 行 杂 交 。 这 样 可 确 定 杂 交 靶 分 子 的 大 小 。 因 此 ， 制备 DNA样 品 后 需 要 进 行 电 泳 分 离 。 在 恒 定 电 压 下 ， 将 DNA样 品 放 在0.8 1.0%琼 脂 糖 凝 胶 中 进 行 电 泳 ， 标 准 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 可 分 辨 7080000bp的 DNA片 段 ， 故 可 对 DNA片 段 进 行 分 离 。 转 膜DNA样 品 在 制 备 和 电 泳 过 程 中 始 终 保 持 双 链 结 构 。 为 了 进 行 有 效 地 实 现Southern印 迹 转 移 ， 对 电 泳 凝 胶 做 预 处 理 十 分 必 要 。 超 过 10kb的 较 大 的DNA片 段 与 较 短 的 小 分 子 量 DNA相 比 ， 需 要 更 长 的 转 移 时 间 。 所 以 为 了使 DNA片 段 在 合 理 的 时 间 内 从 凝 胶 中 移 动 出 来 ， 必 须 将 最 长 的 DNA片 段控 制 在 大 约 2kb以 下 。 DNA的 大 片 段 必 须 被 打 成 缺 口 以 缩 短 其 长 度 。 因 此 ，通 常 是 将 电 泳 凝 胶 浸 泡 在 0.25mol/L 的 HCl溶 液 短 暂 的 脱 嘌 呤 处 理 之 后 ， 移至 于 碱 性 溶 液 中 浸 泡 ， 使 DNA变 形 并 断 裂 形 成 较 短 的 单 链 DNA片 段 ， 再用 中 性 PH的 缓 冲 液 中 和 凝 胶 中 的 缓 冲 液 。 探 针 标 记预 杂 交 （ prehybridizafion）Southern杂 交用 于 Southern印 迹 杂 交 的 探 针 可 以 是 纯 化 的 DNA片 段或 寡 核 苷 酸 片 段 。 探 针 可 以 用 放 射 性 物 质 标 记 或 用 地高 辛 标 记 ， 放 射 性 标 记 灵 敏 度 高 ， 效 果 好 ； 地 高 辛 标记 没 有 ， 安 全 性 好 。 人 工 合 成 的 短 寡 核 苷 酸 可 以 用 T4多 聚 核 苷 酸 激 酶 进 行 末 端 标 记 。 探 针 标 记 的 方 法 有 随机 引 物 法 、 切 口 平 移 法 和 末 端 标 记 法 。将 固 定 于 膜 上 的 DNA片 段 与 探 针 进 行 杂 交 之 前 ， 必 须 先 进 行 一 个 预 杂 交 的 过 程 。因 为 能 结 合 DNA片 段 的 膜 同 样 能 够 结 合 探 针 DNA， 在 进 行 杂 交 前 ， 必 须 将 膜 上所 有 能 与 DNA结 合 的 位 点 全 部 封 闭 ， 这 就 是 预 杂 交 的 目 的 。 转 印 后 的 滤 膜 在 预 杂 交 液 中 温 育 4-6h， 即 可 加 入 标 记 的 探 针 DNA（ 探 针 DNA预先 经 加 热 变 性 成 为 单 链 DAN分 子 ） ， 即 可 进 行 杂 交 反 应 。 杂 交 是 在 相 对 高 离 子强 度 的 缓 冲 盐 溶 液 中 进 行 。 杂 交 过 夜 ， 然 后 在 较 高 温 度 下 用 盐 溶 液 洗 膜 。 离 子强 度 越 低 ， 温 度 越 高 ， 杂 交 的 严 格 程 度 越 高 ， 也 就 是 说 ， 只 有 探 针 和 待 测 顺 序之 间 有 非 常 高 的 同 源 性 时 ， 才 能 在 低 盐 高 温 的 杂 交 条 件 下 结 合 。 采 用 核 素 标 记 的 探 针 或 发 光 剂 标 记 的 探 针 进 行 杂 交 还 需 注 意 的 关键 一 步 就 是 洗 膜 。 在 洗 膜 过 程 中 ， 要 不 断 振 荡 ， 不 断 用 放 射 性 检测 仪 探 测 膜 上 的 放 射 强 度 。 当 放 射 强 度 指 示 数 值 较 环 境 背 景 高 1-2倍 时 ， 即 停 止 洗 膜 。 洗 完 的 膜 浸 入 2 SSC中 2min， 取 出 膜 ， 用滤 纸 吸 干 膜 表 面 的 水 分 ， 并 用 保 鲜 膜 包 裹 。 注 意 保 鲜 膜 与 NC膜之 间 不 能 有 气 泡 。洗 膜放 射 性 自 显 影 检 测1 将 滤 膜 正 面 向 上 ， 放 入 暗 盒 中 （ 加 双 侧 增 感 屏 ） 。2 在 暗 室 内 ， 将 2张 X光 底 片 放 入 曝 光 暗 盒 ， 并 用 透 明 胶 代 固 定 ，合 上 暗 盒 。3 将 暗 盒 置 -70 低 温 冰 箱 中 使 滤 膜 对 X光 底 片 曝 光 （ 根 据 信 号 强弱 决 定 曝 光 时 间 ， 一 般 在 1-3天 ） 。4 从 冰 箱 中 取 出 暗 盒 ， 置 室 温 1-2h， 使 其 温 度 上 升 至 室 温 ， 然 后 冲 洗 X光 底 片 （ 洗 片 时 先 洗 一 张 ， 若 感 光 偏 弱 ， 则 在 多 加 两 天 曝光 时 间 ， 再 洗 第 二 张 片 子 ） 。 Thank you !