定量PCR基本原理及方法

定 量 PCR基 本 原 理 及 方 法 荧 光 定 量 PCR基 本 原 理 荧 光 定 量 PCR标 记 方 法 荧 光 定 量 PCR不 同 方 法 学 的 应 用内 容 定 量 PCR技 术 的 产 生1992年 由 Higuchi等 人 第 一 次 报 告 ： 使 用 EB加 入 PCR反 应 体 系 ，经 改 装 的 带 有 冷 CCD的 PCR仪 检 测 样 品 的 荧 光 强 度核 酸 染 料 荧 光后 来 用 与 双 链 DNA有 更 强 结 合 力 的 SYBR Green I取 代 EB 荧 光 定 量 PCR基 本 原 理 Real-time ChemistriesPCR的 理 论 方 程 ： Y=x (1+ Ev)n Y： 扩 增 物 数 量 ； X ： 起 始 模 板 数 量 ； Ev： 扩 增 效 率 ； n： 扩 增 循 环 数1. 终 点 法 定 量 原 理前 提 ： 在 最 佳 实 验 、 循 环 次 数 n一 定 、 Ev相 同原 理 ： 根 据 扩 增 产 物 的 量 计 数 反 应 物 中 原 始 分 子 数 ， 即 ：lnx=lnY-n ln(1+Ev)=lnY - b (b为 常 数 )2. 实 时 检 测 法 定 量 原 理前 提 ： 在 最 佳 实 验 、 相 同 Ev以 、 扩 增 产 物 量 相 同原 理 ： 反 应 物 中 原 始 分 子 数 （ X） 与 其 所 需 要 的 扩 增 循 环 次 数 （ n）成 反 比 ， 由 此 计 算 出 标 本 中 靶 分 子 的 准 确 含 量 ， 即 ： LgX=LgYn Lg(1+Ev)=b - n a (a、 b为 常 数 ) 荧 光 定 量 PCR的 定 量 原 理 阈 值 ： PCR扩 增 信 号 进 入 相 对 稳定 的 对 数 增 长 期 时 的 荧 光 值 。阈 值 （ threshold） 的 设 定PCR efficiency=10(-1/slope)-1Where slope=1/m Slope -3.322100%efficiency PCR循 环 在 到 达 Ct值 所 在 的 循 环 数时 ， 刚 刚 进 入 真 正 的 指 数 扩 增 期 （对 数 期 ） ， 此 时 微 小 误 差 尚 未 放 大， 因 此 Ct值 的 重 现 性 极 好 ， 即 同 一模 板 不 同 时 间 扩 增 或 同 一 时 间 不 同管 内 扩 增 ， 得 到 的 Ct值 是 恒 定 的 。Ct值 n： 扩 增 循 环 数 n: 扩 增 循 环 数 的 确 定 logN=log N0 +nlogE n=Ct每 个 模 板 的 Ct值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关 系 。 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数的 标 准 品 作 出 标 准 曲 线 ， 根 据 未 知 样 品 的 Ct值 ， 即 可 计 算 出 该 样 品 的 起 始 拷 贝 数 。 Ct值 与 起 始 模 板 的 关 系Y轴 Ct值 X起 始 拷 贝 数 的 对 数 标 准 曲 线 由 系 列 稀 释 的 已 知 浓 度 的 样 品 做 标 准 曲 线 计 算 待 测 样 品 的 初 始 模 板 浓 度log N0 =-Ct logE+logN 绝 对 定 量 未 知 浓 度 的 样 品 与 标 准 曲 线 相 比 较 l 内 掺 式 染 料 SYBR Green I, LC Greenl 序 列 特 异 性 探 针 Taqman Molecular Beacons FRETl 引 物 特 异 性 探 针 Amplifluor (Intergen) LUX 荧 光 定 量 PCR 标 记 方 法 535 3SGExcitation SGSGSGSG Emission 535 3SGSG SGSG SGExcitation Emission R Q 535 3535 3Excitation RR QExcitation R QExcitationR Q QRExcitation Emission Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640Excitation EmissionTransfer 荧 光 定 量 PCR不 同 方 法 学 的 应 用 研 究 目 的 标 记 方 法 l 定 量 分 析 （ 基 因 拷 贝 数 的 绝 对 定 量 ， 基 因 表 达 调 控 的 相 对 定 量 ） Sybr-Green (LC Green), Taqman, Molecular Beacon, etc 研 究 目 的l 基 因 型 分 析 （ SNP、 突 变 型 分 析 ） Taqman, Molecular Beacon, FRET, LC Greenl 熔 解 曲 线 分 析 Sybr-Green, LC Green, Molecular Beacon, FRET 某 科 研 用 户 使 用 Rotor-Gene 3000进 行 基 因 表 达 检 测 结 果 （ 自 备 标 准 品 ， 检 测 样 品 做 复 管 ）l 绝 对 定 量 某 科 研 用 户 使 用 Rotor-Gene 3000进 行 基 因 表 达 相 对 定 量 分 析 ， 下 图 为 用Ct法 得 出 的 分 析 结 果 。 （ 自 备 标 准 品 ， 检 测 样 品 做 3次 重 复 复 管 ） HouseKeeper Gene Gene of Interest l 相 对 定 量 利 用 溶 解 曲 线 进 行 实 验 条 件 的 优 化 （ RG3000）l 熔 解 曲 线 分 析 deg.73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 dF/ dT .35 .3 .25 .2 .15 .1 .05 Bin A Bin B Annealing at 60 deg.73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 dF/ dT 1.2 1.1 1 .9 .8 .7 .6 .5 .4 .3 .2 .1 0 Bin A Annealing at 63 标 记 方 法l Taqman 定 量 分 析 ， 基 因 型 分 析l Sybr-Green 定 量 分 析 ， 熔 解 曲 线 分 析 ， 基 因 型 分 析 (LC Green)l Molecular Beacon 定 量 分 析 ， 熔 解 曲 线 分 析 ， 基 因 型 分 析l FRET 定 量 分 析 ， 熔 解 曲 线 分 析 ， 基 因 型 分 析 l Ampliflour Probe， LUX 定 量 分 析 基 因 型 分 析l 利 用 扩 增 信 号 的 种 类 来 分 型 Taqmanl 根 据 熔 解 曲 线 的 不 同 来 分 型 FRET, Molecular Beacon LC Green 双 Taqman探 针 法 检 测 野 生 型 和 突 变 型 在 基 因 型 分 析 中 ， 可 采 用 两 种 不 同 的 Taqman探 针 （ 分 别 针 对 野 生 型 和 突 变 型 )， 即 一 个 突变 型 探 针 以 一 种 荧 光 素 （ Flr） 标 记 ， 而 野 生 型 探 针 则 用 不 同 的 荧 光 物 （ Tet） 标 记 。 如 果 只 有一 种 信 号 被 扩 增 出 来 ， 则 样 本 为 对 应 的 基 因 型 （ 野 生 型 或 突 变 型 ） 的 纯 合 子 ； 如 二 者 都 被 有 效地 扩 增 出 来 ， 则 样 本 为 杂 合 型 。l 利 用 扩 增 信 号 的 种 类 来 分 型 杂 合 型野 生 型突 变 型 FRET探 针 进 行 熔 解 曲 线 分 析 确 定 基 因 型 FRET探 针 与 模 板 结 合 时 ， 因 共 振 能 量 的 传 递 而 信 号 增 强 ， 而 当 在 Tm 值 时 ，FRET探 针 与 PCR产 物 分 开 ， 荧 光 信 号 减 弱 。 通 过 实 时 捕 捉 到 的 PCR产 物 在 熔 解 过 程中 荧 光 信 号 的 变 化 ， 得 到 PCR产 物 的 熔 解 曲 线 。 因 为 发 生 基 因 突 变 的 PCR产 物 有 特 定的 Tm 值 ， 通 过 测 定 探 针 与 PCR产 物 分 开 时 的 熔 解 温 度 Tm值 ， 就 能 确 定 样 品 的 基 因 型 。l 利 用 熔 解 曲 线 检 测 基 因 突 变 杂 合 型野 生 型突 变 型 利 用 内 掺 式 染 料 进 行 高 分 辨 率 熔 解 曲 线 （ HRM） 分 析 基 因 型HRM根 据 序 列 长 度 、 GC含 量 和 互 补 性 分 析 样 品 ， 可 精 确 到 单 碱 基 差 异 。相 比 其 它 方 法 节 约 了 探 针 和 标 记 的 费 用 。 上 图 ： 用 内 掺 式 染 料 （ 无 探 针 ） 区 分 ACTIN3（ R577X） SNP基 因 型 （ C到 T替 代 ） 。同 源 野 生 型 、 突 变 型 及 杂 合 样 品 如 图 所 示 （ 10次 重 复 ） ， 由 随 机 软 件 自 动 分 型 。 片段 预 先 进 行 40个 循 环 的 快 速 扩 增 （ 40分 钟 ） 。 l 利 用 熔 解 曲 线 检 测 基 因 突 变 谢 谢 ！专 才 服 务 专 家