第四章沉淀分离技术

第四章 沉淀分离技术盐析有机溶剂沉析等电点沉析有机聚合物沉析其他沉析技术 一、盐析原理 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。影响盐析的因素（一）盐离子浓度 在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子表面电荷，使生物分子水合作用增强，具有促进溶解的作用，称盐溶现象。当盐浓度达一定值后,盐浓度升高，生物分子溶解度不断降低,产生了盐析作用,不同的生物分子，“盐溶”与“盐析”的分界值不同。（二）生物分子种类 生物分子的分子结构不同，其分子表面亲水基团与疏水基团不相同，不同生物分子产生盐析现象所需中性盐的浓度（离子强度）亦不同。（三）生物分子浓度 溶液中生物分子的浓度对盐析的效果有很大的影响，要得到理想的沉析效果，必须将生物分子的浓度控制在一定的范围内。一般对于蛋白质溶液，其浓度为2%3%比较合适。（四）pH值 在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶液的pH值调整到该成分的等电点，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液的pH值偏离该成分的等电点。（五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。盐析的操作与应用（一）盐析的操作1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。2、加盐的方法（1）直接加入固体硫酸铵法 （2）加入饱和硫酸铵溶液法 3、盐析操作注意事项（1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离。（2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进行第二次盐析要靠试验确定。（3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控制。（4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长的离心时间。（5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。（二）盐析的主要应用 盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能达到很好的分离效果。由于成本低，操作安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、多肽、多糖、核酸等物质的分离纯化。二、有机溶剂沉析原理（一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。（二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸引而聚集。影响有机溶剂沉析的因素（一）温度 大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过浓。温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发。（二）生物样品的浓度与盐析相似，样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降。一般认为，对于蛋白质溶液0.5%2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%2%为起始浓度为宜。（三）pH有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生。（四）离子强度 在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。盐的浓度太大(0.10.2molL以上)，就需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止变性。（五）金属离子在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到某些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+、Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量，0.0050.02molL的Zn2+可使有机溶剂用量减少l3至12,使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根)的存在。有机溶剂沉析的应用（一）有机溶剂沉析的特点优点：分辨能力比盐析高,即一种生物分子或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉析；沉析不用脱盐，过滤比较容易。缺点：是某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。（二）应用 有机溶剂沉析技术经常用于蛋白质、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分离。使用时先要选择合适的有机剂，然后注意调控样品的浓度、温度、pH和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉析所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉析物，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱除有机溶剂，以免影响样品的生物活性 三、等电点沉析 等电点沉析原理 调节两性生化物质溶液的pH值，以达到某一生化物质的等电点，使其从溶液中沉淀析出而实现分离的技术称为等电点沉析技术。等电点(pI)是两性物质在其质点的净电荷为零时介质的pH值,溶质净电荷为零，分子间排斥电位降低，吸引力增大，能相互聚集起来，沉淀析出，此时溶质的溶解度最低 等电点沉析的注意事项（一）等电点的改变（二）目的物的稳定性（三）盐溶作用（四）pH的调节 等电点沉析的应用（一）在生化产品的分离纯化过程中，常利用两性物质如氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等具有不同的等电点的特性来进行产品的分离纯化。（二）等电点沉析只适用于水化程度不大，在等电点时溶解度很低的物质，如四环素等在等电点(pH=5.4)附近,难溶于水，能产生沉析。有机聚合物沉析 有机聚合物沉析原理 利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而析出的分离技术称为有机聚合物沉析。非离子型多聚物沉析的机理 离子型多聚物沉析的机理 有机聚合物的种类（一）水溶性非离子型聚合物（二）离子型表面活性剂聚合物（三）离子型多聚物 有机聚合物沉析的应用 非离子型聚合物最早在20世纪60年代时被用来沉析分离血纤维蛋白原、免疫球蛋白，和沉析一些细菌与病毒，近年来广泛用于核酸和酶的分离纯化。其他沉析技术一、金属离子沉析（一）许多生物活性物质（如蛋白质、核酸、多肽、抗生素和有机酸等）能与金属离子形成难溶性的复合物而沉析。（二）金属离子沉析生物活性物质已有广泛的应用，如锌盐可用于沉淀杆菌肽和胰岛素等，CaCO3用来沉析乳酸、枸橼酸、人血清蛋白等。此外，该技术还能用来除去杂质。二、有机酸沉析含氮有机酸如苦味酸和鞣酸等能够与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。但这些有机酸与蛋白质形成盐复合物沉析时，常常发生不可逆的沉析反应。工业上应用此法制备蛋白质时，需采取较温和的条件，有时还加入一定的稳定剂，以防止蛋白质变性。三、选择变性沉析选择变性沉析法原理是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，而有选择地使之变性沉析，以达到目的物与杂蛋白分离的技术，称为选择变性沉析。1、选择性热变性2、选择性酸碱变性 3、选择性变性剂 实验四实验四 等电点沉析法分离牛乳中等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白的酪蛋白 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。掌握等电点沉析分离的基本操作技术。掌握等电点沉析分离的基本操作技术。原理原理 蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为该物质的等电点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离材料用具材料用具 鲜牛奶醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液其配制如下：配A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAcH2O 5.44g溶至200ml。配B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优级纯醋酸2.4g溶至200ml。取A液约17.7ml，B液约12.3ml混合，用酸度计调得pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液30ml。等等电电点点沉沉析析制制备备酪酪蛋蛋白白 1、将鲜牛奶30 ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加热40左右。并用8层纱布过滤牛奶。2、量取加热后的牛奶20ml。在搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20ml。用酸度计调pH至4.7。3、将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min，弃去上清液，得酪蛋白粗制品。4、用水洗沉淀3次，离心（3500r/min）10min，弃去上清液操作方法操作方法等等电电点点沉沉析析制制备备酪酪蛋蛋白白5、在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。6、将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。7、准确称量，计算含量和收率。含量=酪蛋白g/100mL牛乳操作方法操作方法测得含量理论含量收率=100%式中理论含量为3.5 g/100mL牛乳注意事项注意事项1、醋酸-醋酸钠缓冲液的配制应规范，pH值应用酸度计测试，以准确达到酪蛋白的等电点。2、加入醋酸-醋酸钠缓冲液时，动作要缓慢，并慢慢加入，不可操之过急而大量一次加入。3、离心前温度一定要降至室温。思考思考 题题1、为何用醋酸、为何用醋酸-醋酸钠缓冲液来调酪蛋白的等醋酸钠缓冲液来调酪蛋白的等电点，可否改用酸或碱来？电点，可否改用酸或碱来？2、如何提高酪蛋白的收率？、如何提高酪蛋白的收率？实验五实验五 乙醇沉析法提取柑橘皮乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶中的果胶 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求掌握机械破碎法及酸碱法从柑橘皮制得果胶粗提液方法。掌握机械破碎法及酸碱法从柑橘皮制得果胶粗提液方法。取得灭酶、提取温度及取得灭酶、提取温度及PH控制等最佳操作技术参数。控制等最佳操作技术参数。原理原理 果胶是植物胶，属于多糖类，存在于高等植物的叶、茎、根的细胞壁内，与细胞彼此粘合在一起，尤其是果实及叶的含量较多；也是一种亲水的植物胶，能溶于20倍水中生成粘稠溶液，不溶于乙醇及一般有机溶剂，在酸性条件下稳定。由于其水溶液在适当的条件下可以形成凝胶，具有良好的胶凝化和乳化作用，因此可用于制造果酱、果冻或胶状食物，也可用作食品添加剂、微生物培养基及保护剂等。材料用具材料用具 新鲜柑橘皮50g正磷酸、0.2molL盐酸、焦磷酸钠（又称磷酸四钠）。组织捣碎机、大烧杯（500mL）、磁力搅拌器、恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、不锈钢锅。分分离离 将提取液加入1的硅藻土作助滤剂，然后送入板框压滤机。过滤后得无色透明的果胶稀溶液，滤渣弃去。操作方法操作方法浓浓缩缩 将过滤收集的滤液置于真空浓缩装置中，于75温度下浓缩，直至浓缩到果胶浓度为4左右。操作方法操作方法沉沉析析 将浓缩液置于搪瓷桶中，并冷至室温，然后乙醇以喷淋方式加至已浓缩好的果胶溶液中，乙醇含量控制在4050的范围内，不断搅动。这时，果胶聚结成海绵状析出。操作方法操作方法分分离离 将果胶乙醇混合物经12h静置后，送入板框压滤机过滤。收集滤饼(果胶)，然后用80操作方法操作方法干干燥燥 将以上滤好的果胶置于真空干燥器中于55左右干燥，即得果胶纯品。操作方法操作方法注意事项注意事项1、提取温度 温度过高容易引起果胶解聚，降低果胶胶凝能力。温度过低，则会延长萃取时间，造成果胶过分脱脂，一般以7582为宜。提取时间 时间短，提取不完全；时间过长，则会引起果胶降解，难以得到高质量的果胶。提取时间以40min60min为宜。2、提取的pH值 pH值高，获得果胶的胶凝能力强，但果胶收率低，当pH值大于3.5时，就很难得到果胶。pH值低，果胶收率提高，但质量下降。在提取过程中，体系的pH值会发生变化，要经常用试纸检测溶液的pH值，要使之保持稳定，以保证提取正常进行。注意事项注意事项3、脱色及醇洗 灭酶后的柑橘皮水洗脱色及进行分离操作时助滤剂的使用都有一定的脱色作用。脱色处理要彻底及最后的高浓度乙醇洗涤果胶滤饼时要充分，否则影响所得果胶纯品色泽及含量。思考思考 题题1、柑橘皮预处理时为何要加热至沸而灭酶？、柑橘皮预处理时为何要加热至沸而灭酶？2、如何提高果胶的收率和质量？、如何提高果胶的收率和质量？3、提取时加入焦磷酸钠的作用？、提取时加入焦磷酸钠的作用？实验六实验六 硫酸铵分级盐析分离血硫酸铵分级盐析分离血清中的主要蛋白质清中的主要蛋白质 实验原理实验原理 2材料用具材料用具 3操作方法操作方法 4目的要求目的要求 2155注意事项注意事项 目的要求目的要求了解盐析法分离血清中的主要蛋白质的基本原理；了解盐析法分离血清中的主要蛋白质的基本原理；掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术掌握硫酸铵分级盐析的基本操作技术原理原理 盐析是最常用分离蛋白质的方法，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，从而在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。一般粗提取物常用它进行粗分离。常用的盐析剂有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸二氢钠等，其中最常用的是硫酸铵。用盐析法分离蛋白质，简便安全，而且所得的蛋白质并不丧失活性，是分离纯化中最佳的一种方法。材料用具材料用具 新鲜动物血浆或血清（无溶血现象）：100ml 离心机、大烧杯（500ml）、烧杯（250ml）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。pH7.2饱和硫酸铵溶液0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）。清清蛋蛋白白与与球球蛋蛋白白分分离离1、取100ml血浆或血清置于500ml烧杯中，加PBS 100ml搅拌10min。2、在搅拌下慢慢滴加200ml pH7.2饱和硫酸铵溶液。3、加完饱和硫酸铵溶液后继续搅拌2030min以充分沉淀球蛋白。4、离心（3500r/min）20min，弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。操作方法操作方法各各种种球球蛋蛋白白的的分分离离1、用100ml PBS溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移至250ml烧杯中搅拌15min。2、在搅拌下，慢慢滴加25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达20%。3、离心（3500r/min）20min，沉淀含少量纤维蛋白质，取上清液4、上清液在搅拌下，慢慢滴加18ml25ml饱和硫酸铵溶液，饱和度达30%33%。5、离心（3500r/min）20min得上清液和沉淀（主要含-球蛋白和少量-球蛋白）。操作方法操作方法各各种种球球蛋蛋白白的的分分离离6、取5中沉淀溶于PBS中使体积达100ml并转移至250ml烧杯中搅拌15min。7、在搅拌下，慢慢滴加43ml50ml饱和硫酸铵溶液，约达30%33%饱和度。8、离心（3500r/min）20min得上清液（含-球蛋白）和沉淀（主要含-球蛋白）。9、取5中上清液在搅拌下，慢慢滴加35ml40ml饱和硫酸铵溶液，饱和度约达45%。10、离心（3500r/min）20min得上清液（主要为-球蛋白）和沉淀（主要为-球蛋白）。操作方法操作方法注意事项注意事项1、缓冲液的配制应准确。2、滴加饱和硫酸铵溶液的速度要慢一些及搅拌的速度应适中。3、加完硫酸铵溶液后要静置一段时间，至少20 min30 min，使沉淀完全。思考思考 题题为什么所用离心管等器皿必须灭菌？为什么所用离心管等器皿必须灭菌？蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？