REST蛋白和细胞升压抵抗衰老与阿尔茨海默氏症

REST 蛋白和细胞升压抵抗衰老与阿尔茨海默氏症摘要：人类神经元在整个生命周期中都起作用，,然而，其起保护功能和在老化过程中防止神 经退化的机制还是未知的。本文中我们发现，抑制元素1-沉默转录因子(REST，也称为神经 抑制沉默子,NRSF)的表达抑制是人类大脑皮层和海马神经元细胞正常老化的一个普遍特征。 然而,在轻度认知障碍和阿尔茨海默氏症中没有REST蛋白。染色质免疫沉淀反应深度测序和 基因表达分析表明 ，REST 蛋白抑制促进细胞死亡和引起阿尔茨海默病的基因表达，并诱发 应激反应基因的表达。此外,REST蛋白能够强有力地保护神经元免受氧化应激和淀粉质蛋白 的毒性作用，同时,有条件的去除老鼠大脑内的 REST 蛋白息会导致老年性神经退化。 REST 的一个功能性正源基因线虫 SPR-4 也能保护神经元免于氧化应激反应和淀粉质蛋白毒 性。在正常细胞老化中,REST的表达部分受细胞非自治Wnt信号的诱导。然而，在阿尔茨海 默氏症、额颞痴呆和路易体痴呆中,REST是一种在核中消失而一起出现在自噬体中的病理性 错误折叠的蛋白质。最后，本文说明REST蛋白水平在细胞老化过程中与认知保护和长寿密 切相关。因此,REST的激活状态可能辨别大脑老化中神经退行性变中的保护作用。老龄化中认知功能的保存已成为21 世纪的主要医疗的挑战之一。一个基本 的问题是为什么有些人年龄与认知功能相对完整匹配而另一些人下降并发展为 阿尔茨海默病(AD)。早期研究表明，神经元的损失是大脑老化的重要特征。随着 体视神经量化的出现，很明显的发现神经元细胞数目大部分保留在老化人类大脑 的海马中，仅在神经变性疾病 1-3 的模式中下降。强大的应激反应机制必须进化 以在整个生命周期中保护神经元和认知功能。REST是胚胎发育阶段神经元的抑 制基因,一旦终端神经元分化发生其表达将受到抑制。我们发现 REST 在老化人的 大脑中调节细胞死亡，抗压性和AD病理的基因网络。当REST在细胞核中消失时， 这种基因网络即在AD早期阶段特异表达。在小鼠与线虫中选择性敲除REST基因， 线虫模型表明 REST 可保护神经元免受与老化相关的有毒物质的侵害。老年人中 REST 水平的升高与维持认知功能和延长寿命密切相关,甚至在 AD 中也是如此。 因此,REST调节可能核心是老化细胞认知功能保存的神经应激反应。REST 在细胞衰老和阿尔茨海默病衰退中表达转录分析表明了在老年人前额叶皮层神经元基因表达中的显著变化。使用智 慧系统 IPA 平台分析这个数据集表明，老化大脑中被激活最强烈的转录因子是 REST （P=9X1O-1。）。此外,rest的21个碱基RE1识别序列在年龄下调基因组 中富集（P=3X1O-7）。为探究 REST 在大脑老化中的作用，我们测量了从年轻成人（20-35 岁）和没 有患阿尔茨海默氏症的老年人（73-106岁）的前额皮层（PFC）提取物中的REST 水平。通过定量PCR反转录（定量RT-PCR ）和Wes tern印迹法测定，REST的表 达在老年人PFC的信使RNA和蛋白质水平显著增加，全长REST的能力明显增多; 截短的剪接变体REST4是次要组分，其包括REST mRNA的0.1-0.5%。使用三种 不同的抗体针对REST的氨基或羧基末端结构域进行免疫荧光显微术,显示出PFC 和海马老化神经元细胞核中 REST 的显著表达。在小神经胶质细胞和星形胶质细 胞中检测到的 REST 水平要低得多（数据未显示）。 REST 特异性抗体受到在预吸 附一个无与之匹配的非特异性IgG免疫反应性，并在神经SHSY5Y细胞shRNA的 介导 REST 击倒后失去免疫反应性的 REST 封闭肽之后免疫反应性发生消融的指 导。然后我们研究了诱导 REST 在老化的神经元中表达是否会增加的 REST-RE1 位 点结合。为了评估REST在神经元特异性靶向，我们通过特异性核抗原的流式细 胞术（FACS）方法从PFC神经细胞中分离出细胞核。染色质免疫沉淀反应（芯 片）-PCR分析显示在年老者PFC的REST靶基因中显著诱导RE1序列的绑定。这 些结果表明，REST的表达和功能发挥在老化神经元中增加。接下来我们检测患有轻度认知障碍或阿尔茨海默氏症的老年人 REST 的表达 水平。我们发现REST几乎不存在于阿尔茨海默病患者的大脑皮质和海马神经元 中。在某些AD神经元中发现有点状细胞质REST的免疫反应，但在其它细胞中没 有检测到。核REST的损失是由77例散发性AD与72年龄匹配的认知正常对照组 的免疫细胞化学定量分析相比较，并用流式细胞仪分析神经元细胞核证实的。 在24个遗忘的轻度认知障碍中有23例，其核REST的水平相对降低到老年对照 的平均值。脑区的一项调查显示，显著降低核REST的水平，AD患者受影响的神 经元群体包括前额叶皮层神经元和海马 CA1， CA3 和 CA4 子域的神经元。与此相 反，核REST未减少的齿状回和小脑的神经元，其相对未受影响减小。AD患者中 REST 水平降低已被前额叶皮层灰质样本免疫印迹法，以及孤立的皮质细胞核证 实。此外，神经元细胞核ChIPPCR分析表明显著减少或缺失AD的REST-RE1的结 合位点涉及对于正常老化控制。因此,REST是在正常大脑老化出现，但在脆弱的 神经元集群和 AD 中明显减少。REST 抑制基因参与细胞死亡和阿尔茨海默病为了获得更深入地了解REST诱导功能在大脑老化中的影响，我们通过染色质 免疫共沉淀和深度测序技术（ChlP-SEQ）寻找神经细胞系SH-SY5Y中REST的靶 蛋白。ChIP-qPCR证实了 REST结特异结合目标基因。REST ChlPseq结合位点在 人类PFC （P=1.65X 10-12年龄调控基因中显著丰富，并随年龄增加主要从生命 的第三到第十个十年逐渐减少。 ChIP-seq 数据库的路径分析显示一个非常重要 的高度富集基因的细胞死亡途径和基因都与AD/老年痴呆症有关。细胞死亡的基 因包括 p38 的 MAP 激酶（MAPK11）, FAS，FADD，TRADD，BAX，BID，DAXX，PUMA （又称asBBC3）,线粒体通透性转换孔ANT1 （又称asSLC25A4）和相关的细胞色 素C。REST靶标与AD病理相关表现在包括基因编码的Y -分泌酶复合物的成员早 衰素2和早衰素增强子2牵连amyloidb蛋白质（抗体）的产生，还有CDK5R1 （也 称为P35），CDK5R2 （也称为P39）的p38 MAP激酶（也称为MAPK11，12和14） 和14-3-3 zeta电（也称为YWHAZ）牵连的tau蛋白（也称为MAPT）的磷酸化。 REST抑制这些基因在SH-SY5Y细胞的表达，并强烈抑制tau蛋白的磷酸化在与 AD 有关的 AT8 和 PHF1 的表位。接下来，我们检测了这EST的靶基因在正常脑老化和AD中的调节。为了区分 在认知能力下降的不同阶段的影响，我们将AD患者分为最不严重（者AD1;简易 精神状态检查（MMSE）得分18）和最严重者（AD2, MMSE评分8）。与细胞死亡 和AD病理相关的REST靶标在AD的两个阶段都出现减少的REST锚定和升高的 mRNA表达。但是相关的神经传递REST靶基因则在早期AD1显示出升高的mRNA 的表达，而在稍后阶段AD2表达减少蛋白质水平的回归分析表明，核REST与促 凋亡（BAX和DAXX）和正常老化AD神经元中的AD相关蛋白（老素2）的水平呈 负相关。同时观察到用于在正常老化和早期AD1 （不是后期AD）与神经传递（SST 和CALB1）相关联的REST的目标。激活相关的组蛋白修饰H3K9ac，这通常降低 了 REST ，在正常老化的 PFC 神经元中 REST 水平全面下调，即 H3K9ac 的激活与 REST水平呈负相关。相比之下，神经H3K9ac在早期AD显著增加。因此，核REST 在 AD 中的缺失与潜在致病基因的表观遗传去阻遏有关。REST 的神经保护性由于REST抑制促凋亡基因表达，我们通过评测易受氧化应激和低聚抗体，与 脑老化和AD相关的应激源探讨神经保护作用。小鼠E16皮层神经元的原代培养 的建立来自于巢蛋白Cre重组：REST lx/ lx（REST cKO）和同窝出生控制的胚 胎。1-2周的培养后，神经细胞的分化可以与REST缺陷和控制系相比。经与过 氧化氢或低聚 Ab42 治疗， REST 缺失的神经元表现出显著增加的相对变性和与细 胞死亡相关的控制。REST缺陷的神经元被野生型REST的慢病毒转导恢复，由此 导致相对于野生型2 2.5倍的表达水平。与此相反，一个缺乏核易位（A REST） 的REST突变是无法恢复的。REST缺陷的神经元表现出应答氧化应激反应和低聚 抗体的促凋亡基因表达增加。因此，内源性REST是神经保护性的。REST 缺陷的小鼠表现出渐进的与年龄有关的神经退行性表型。 在一月龄 REST CKO 的小鼠皮层和海马中的神经元数量与控制组没有显著差别。通过裂解 半胱氨酸蛋白酶和原位标记法标记阳性神经元显示神经元变性和凋亡出现在 8 月龄。同时伴随着大脑皮质和海马大量的神经元丢失和明显的胶质增生。这些结 果表明， REST 是用以在大脑老化中维持神经元的生存力必不可少的。为了验证对REST缺陷神经元的研究结果，我们评估SH-SY5Y细胞系中REST 过表达或短发夹RNA介导的REST水平降低后氧化应激的脆弱性。当REST过量表 达3- 20倍时过氧化氢诱导的细胞死亡显著降低。更高水平的REST表达将增加 细胞死亡。通过慢病毒转导shRNA导致REST水平降低显著增加SH-SY5Y细胞系 与培养的人皮质神经元经 H O 诱导的细胞凋亡数量。 因而 shRNA 的抗性小鼠2 2REST可以抑制细胞凋亡。此外，shRNA的介导REST减少增加了抗氧化剂N-乙酰 半胱氨酸（NAC）的水平控制的活性氧簇（ROS）水平。此外，REST降低引起DNA 氧化损伤，从而减少了 REST的表达。为了检验人类大脑REST的表达与DNA氧化 损伤的关系，我们对REST和DNA氧化损伤标志物8-羟基鸟嘌吟（8-oxoG）双 标。线性回归分析表明在正常老化神经元和 AD 核中 REST 和 8-oxoG 水平呈显著 负相关关系。因此，老龄化过程中的REST表达可以减少氧化损伤。线虫 Caenarhobditis 作为一个老化和抗应激能力的模型系统。两个多锌指转 录因子在C.elegans结构上类似于哺乳动物的REST (SPR-3and SPR-4),而另一 基因是与之密切同源的CoREST (SPR-1)。为了测试这些基因在氧化应激抗性中 的作用，我们把线虫成虫的生长培养基中补充百草枯，一种超氧化物产生物。线 虫和突变体SPR-1, SPR-3和SPR-4相对于野生型对照都表现出生存力减弱现象。 SPR-4 (byl05)突变体显示出最大的脆弱性。此外，RNA干扰破坏突变体SPR-4 在受百草枯处理后相比于野生型虫存活率显著降低。 SPR-4 主要在神经元中表 达，并诱导氧化应激。PR-4突变体的线虫对氧化应激的敏感性增加是由于野生型SPR-4或人类REST 的转基因表达显著降低。为确定是否SPR-4和REST直接调节ROS水平，线虫被 标记有荧光的ROS指示剂2，7-二氯二乙酸酯(DCFDA)。经百草枯处理的突变 体SPR-4 (byl05)相对于野生型表现出显著升高的ROS水平。而ROS水平原来 受野生型SPR-4或人类REST的转基因表达影响而降低。要确定的REST是否能代 替SPR-4作为转录抑制因子，我们评估了由SPR-4抑制的老素基因hop-1表达。 在成年 SPR-4 突变体中相对于野生型虫 hop-1 表达升高，并同时受到野生型 SPR-4和人类REST的抑制。这些结果表明，人类的REST可以在功能上代替线虫 的 SPR-4。SPR-4还调节Ap的神经毒性在线虫中表达Ap 42在谷氨酸能神经元和经历年 龄依赖神经元损失的线。当此抗体表达线路越过SPR-4 (byl05)突变体，所得 到的线表示Ap 42在一个 丧失功能的SPR-4的背景中表现神经退行性病变显著 加速。因此，SPR-4能同时抵御氧化应激和Ap的毒性，与一般的抗压作用相一 致。由压力和Wnt信号通路介导的REST为确定氧化和其它形式的压力能否诱导REST在大脑老化中表达，我们主要受 到人脑皮层神经元的各种压力源。与氧化还原活性铁(Fe+2)，过氧化氢，谷胱 甘肽合成酶抑制剂丁硫氨酸亚砜(BS0)，或Ab42诱导REST的mRNA和蛋白质结 合，并增加REST-RE1位点结合。为确定分泌的因子是否有助于REST诱导表达， 将皮层神经元在 H 2 O 2 中培养后，在除去过氧化氢的条件培养基中传代培养。 添加应力的条件培养基诱导幼稚神经细胞REST mRNA的显著表达。因此，各种压 力源诱导REST表达，这种表达至少部分是通过细胞非自主信号传导介导的。为了探讨细胞非自主信号在大脑老化的作用，我们采集从年轻成人和年长者 得到的 PFC 提取物并评估其对 SH-SY5Y 细胞的影响。 REST 在老龄人皮质提取物 中大量表达，但在年轻人中表达量却最低。此外， AD 患者皮质提取物表现出 REST 诱导活性相对于年龄匹配的对照有减少。因为 REST已被确定为经典Wnt-0 -catenin信号18的目标，我们研究了这种细胞非自主信号通路的作用。老年皮 质提取物和条件培养基经过氧化氢处理培养的压力细胞，衣霉素或渥曼青霉素诱 导0 -catenin与REST并行处理。REST和0 -连环蛋白的诱导部分受到Wnt信号 拮抗剂Dickkopf抑制。REST也是通过添加纯化的Wnt-3A和Wnt-7a抑制表达。 此外，GSK3氯化锂和凯龙星99021激活Wnt信号诱导REST表达增加了 REST的 RE1位点结合，并增强核易位。为了评估Wnt信号在人的大脑中作用，我们测得 的年轻成人和老年病例的PFC核0 -连环蛋白水平。核0 -连环蛋白在衰老的PFC 神经元显著升高，并与 REST 共定位。这些结果表明 Wnt-0 -连环蛋白信号可能 有助于 REST 在老化大脑中的诱导表达。REST 在神经退行性疾病的自噬在AD中，细胞核REST缺失往往伴随着定位到点状的被自噬体记号LC3, ATG7 和ATG12标记，但不是溶酶体标记LAMP1和LAMP2的细胞质结构。以确定是否自 噬能否改变核REST的细胞质分布，自噬在SH-SY5Y细胞中通过血清剥夺激活， 引起了核REST显著减少，可以通过3-甲基腺嘌吟或巴弗洛霉素这两种自体吞 噬的抑制剂逆转。因为激活自噬是许多与年龄有关的神经退行性疾病的特点，我 们怀疑REST是否也在其他痴呆疾病中耗尽。从检查患者的额颞叶痴呆（FTD）或 路易体痴呆（DLB）皮质切片显示了核REST的显著枯竭。神经退行性疾病中诱导自噬已与致病错折叠蛋白如抗体相关联。在AD中，许 多皮质和海马神经元表现出REST与Abin LC3阳性的自噬体一个显着共定位。与 此相反，REST没有与Abin淀粉样蛋白斑共定位。磷酸化的tau蛋白和TDP-43 一直被认为是在FTD异常折叠的致病蛋白质，其中SA-突触核蛋白与DLB关联。 每一个 tau 蛋白阳性 FTD 检查显示在 LC3 阳性的自噬体中 REST 与磷酸化 tau （PHF1 表位）共存。相似的，每一种 TDP-43 阳性 FTD 中显示 REST 与 TDP-43 和LC3的共存。所有10种DLB情形的研究表明REST与a -突触核蛋白的部分共 定位出现在自噬体。因此，REST的自噬以及致病错误折叠的蛋白质，可能减少AD 和其他神经退行性疾病中核转位。REST，认知保存与长寿一个核心问题是 REST 在 AD 中的损失是否会导致认知能力下降。我们通过使 用来源于神经病学的神经认知功能评估方法，进行纵向的宗教秩序研究和快速记 忆以及老龄项目(方法)来探讨这个问题。线性回归分析表明，前额叶皮层神经 元核的 REST 水平与普遍的认知措施和单独情节措施，语义和高水平统计学意义 的工作记忆显著性相关。类似的结果也在海马 CA1 区锥体神经元获得。对于这两 个脑区， REST 水平在很大程度上与患者情景记忆有关，而这种记忆通常在 AD 的 病程早期下降。 REST 水平的升高还预测 AD 的神经病理症状的减轻。接下来我们思考，是 REST 水平的升高可能赋予机体对 AD 病症的抵抗性。国 家老年研究院和里根研究所(NIA-Reagan)联盟以建立一个阿尔茨海默氏病联合 登记处(CERAD)得分表指示AD病症，但轻度或无认知障碍病例与严重认知功能 障碍病例进行了 AD病理性比较。尽管两组病例都满足标准AD,认知保存完好的 病例相对于认知障碍病例核 REST 水平显著升高。因此， REST 的升高水平与符合 标准病理 AD 的个体认知保存相关联。因为 REST 与抗应激能力和保存认知功能相关，我们研究其与人类长寿的关 系.PFC神经元核REST水平表现出与长寿显著的正相关关系(R=0.53, P30),相关系数的分布渐近正态 分布。因此，在P值的Pearson相关系数为图6a，b,d是基于正常分布来计算。 图6a示REST蛋白水平与认知测试为多个单独的科目的分数的关系。REST蛋白 水平和认知变量之间的相关系数是基于N =111计算的。图6b示的REST蛋白水 平与Braak得分的关系。REST蛋白水平和Braak分数之间的相关系数是基于N =37计算的。图6d示了 REST蛋白水平与死亡年龄的关系。REST蛋白水平与年 龄之间的相关系数是基于N =61计算的。扩展图2A比较了 REST的靶基因的加 权平均表达水平与死亡年龄的关系。每个点代表342 REST基于微阵列的年龄调 节相关的靶探针集合的表达加权平均值。 这些平均值被总表达量加权，并进一 步标准化为最年轻成人值(100；24岁)。30. 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