《过柱纯化》PPT课件

6、 电 泳 、 割 胶 、 纯 化 DNA 1、 实 验 目 的 ： (p140) 将 所 需 要 的 DNA片 段 进 行 回 收 ， 纯 化 。 （ TaKaRa公 司 凝 胶 回 收 试 剂 盒 ）2、 实 验 原 理 ： 实 验 操 作1.在 紫 外 灯 下 切 出 含 有 目 的 DNA的 琼 脂 糖 凝 胶 ， 用 纸 巾 吸 尽 凝 胶 表 面 的 液 体 。 此 时 应 注 意 尽 量 切 除 不 含 目 的 DNA部 分 的 凝 胶 ， 尽 量 减 小 凝 胶 体 积 ， 提 高 DNA回 收 率 *。 2.切 碎 胶 块 。 胶 块 切 碎 后 可 以 加 快 操 作 步 骤 6的 胶 块 融 化 时 间 ， 提 高 DNA的 回 收 率 。 3.称 量 胶 块 重 量 ， 计 算 胶 块 体 积 。 计 算 胶 块 体 积 时 ， 以 1 mg=1l 进 行 计 算 。4.向 胶 块 中 加 入 胶 块 融 化 液 DR-I Buffer， DR-I Buffer的 加 量 如 下 表 ：5.均 匀 混 合 后 75 加 热 融 化 胶 块 (低 熔 点 琼 脂 只 需 在 45 )， 间 断 振 荡 混 合 ， 使 胶 块 充 分 融 化 （ 约 6 10分 钟 )。 *切 胶 时 请 注 意 不 要 将 DNA长 时 间 暴 露 于 紫 外 灯 下 ， 以 防 止 DNA损 伤 。 6.加 入 DR-I Buffer量 的 1/2体 积 量 的 DR-II Buffer， 均 匀 混 合 。7.将 溶 液 转 移 至 Spin Column中 ， 12,000 rpm离 心 1分 钟 ， 弃 滤 液 (可 重 复 一 次 ， 提 高 DNA回 收 率 )。 8.将 500 l的 Rinse A加 入 Spin Column中 ， 12,000 rpm离 心 30s， 弃 滤 液 。 9.将 700 l的 Rinse B加 入 Spin Column中 ， 12,000 rpm离 心 30秒 ， 弃 滤 液 。 10.重 复 操 作 步 骤 9， 然 后 12,000 rpm再 离 心 1分 钟 。 11.将 Spin Column安 置 于 新 的 1.5 ml的 离 心 管 上 ， 在 Spin Column 膜 的 中 央 处 加 入 25 l 的 灭 菌 蒸 馏 水 *， 室 温 静 置 1分 钟 *。 12. 12,000 rpm离 心 2分 钟 洗 脱 DNA。 *把 灭 菌 蒸 馏 水 加 热 至 60 使 用 时 有 利 于 提 高 洗 脱 效 率 。 mark未 纯 化 前质 粒 DNA 未 纯 化 前质 粒 DNA未 纯 化 前PCR产 物