荧光定量PCR的原理及应用

大 型 仪 器 管 理 中 心黄 雪 玲2010-9-27实 时 荧 光 定 量 PCR原 理 及 其 应 用 荧 光 定 量 PCR仪 的 应 用v基础研究中基因表达丰度的测定；v差异基因的表达检测，基因型分析；v临床医疗领域病原体的检测和基因诊断：包括特定基因的检测、细菌和病毒等病原体的检测；v环境监测，包括水质、空气的污染检验； v检验检疫工作：食品卫生检验，转基因作物的检验；v法医的遗传学鉴定； PCR的 反 应 过 程 CycleFluorescence 实 时 荧 光 定 量 PCR 实 时 荧 光 定 量 PCR （ Real-time Q-PCR ） 技 术 ， 是 指 在 PCR反 应 体 系 中 加入 荧 光 基 团 ， 利 用 荧 光 信 号 累 积 ， 实 时监 测 整 个 PCR进 程 ， 最 后 通 过 参 照 标 准曲 线 对 反 应 体 系 中 未 知 模 板 进 行 定 量 分析 的 方 法 。 实 时 荧 光 定 量 PCR中 的 三 个 概 念 增 长 曲 线 (primary curve) 荧 光 阈 值 （ threshold) CT 值 (Cycle Threshold) 增 长 曲 线 反 映 荧 光 强 度 与 循 环 数 的 对 应 关 系CycleFluorescence 域 值 ： PCR扩 增 信 号 进 入 相 对 稳 定 对 数 增 长 期 时 的 荧 光 值 。荧 光 域 值 （ Threshold） 的 设 定 Ct值Ct值 :C代 表 Cycle， t代 表 threshold， Ct值 的 含 义 是 ： 每 个 反 应 管 内 的 荧 光信 号 到 达 设 定 的 域 值 时 所 经 历 的 循 环 数 。 Ct值 与 起 始 模 板 的 关 系 每 个 模 板 的 CT值 与 该 模 板 的 起 始 拷 贝 数 的 对 数 存 在 线 性 关系 。 起 始 拷 贝 数 越 多 ， CT值 越 小 ； 模 板 DNA的 起 始 拷 贝 数越 少 ， CT值 越 大 。 一 般 正 常 的 CT值 范 围 在 15-35之 间 ， 过 大 和 过 小 都 将 影 响实 验 数 据 的 精 度 。 I 535 3SGExcitation SGSGSGSG Emission 535 3SGSG SGSG SGExcitation Emission 优 点 ：u使 用 方 便 ， 可 以 应 用 于 不 同 的 模 板u灵 敏 ， 便 宜缺 点 ：u与 非 特 异 性 产 物 结 合 ， 但 可 以 通 过 熔 解 曲 线 进 行 辨别 熔 解 温 度 (Tm值 ) Tm值 ： 50%DNA变 成 单 链 时 的 温 度 ， 此 温 度与 双 链 DNA的 长 度 、 GC含 量 有 关 ， 可 部 分 代表 序 列 的 特 异 性 。 Melt Curve Analysis R Q 535 3535 3Excitation RR QExcitation双 标 记 探 针 （ Taqman Probe） 优 点 ：u对 目 标 序 列 有 很 高 的 特 异 性 ， 在 病 原 微 生 物 特 异 性 检 测 上有 独 特 优 势u设 计 简 单 ， 准 确 性 好缺 点 ：只 适 合 于 一 种 特 异 目 标 的 检 测 ， 相 对 价 格 略 高双 标 记 探 针 （ Taqman Probe） 荧 光 定 量 PCR实 验 技 术 路 线v查 询 目 的 基 因 序 列 v选 择 合 适 的 荧 光 标 记 方 法 选 染 料 法 则 购 买 SyBr Green I或 相 应 试 剂 盒 ； 探 针 法 则 设 计 并 合 成 荧 光 探 针v 设 计 特 异 引 物 或 探 针 引 物 设 计 的 一 般 原 则 ：u产 物 长 度 在 80-300bp之 间u产 物 GC含 量 在 50-60%之 间u引 物 的 GC含 量 在 50-60%之 间 ， 熔 解 温 度 在 55-65 之 间u应 避 免 引 物 中 有 连 续 的 G或 C， 但 推 荐 在 引 物 的 末 端 含 有 G或 C Primer 5.0 http:/ 荧 光 定 量 PCR实 验 技 术 路 线v 实 验 时 先 对 普 通 PCR产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳检 测 ， 在 条 带 特 异 的 情 况 下 才 能 采 用 染 料 法 进行 荧 光 定 量 PCR实 验v 注 意 模 板 浓 度 ： 在 普 通 PCR基 础 上 可 以 稀 释 10100倍 引 物 浓 度 ： 0.4 0.9 M （ 一 般 略 低 于 PCR引 物 量 ） 荧 光 物 质 浓 度 ： 按 说 明 书 操 作 ， 根 据 实 验 结 果 优 化 加 样 准 确 性 ： 避 免 微 小 加 样 荧 光 定 量 PCR实 验 技 术 路 线v模 板v Plasmid DNA 目 的 片 段 在 Plasmid DNA 中 很 易 被 扩 增 ， 可 以 适 当 稀 释 Total DNA 目 的 片 段 在 Total DNA中 丰 度 相 对 较 低 ， 因 此 Total DNA量 要 略 高 于Plasmid DNA cDNA 以 cDNA为 模 板 时 一 般 将 反 转 录 产 物 原 液 稀 释 1050倍 后 作 模 板 荧 光 定 量 PCR实 验 技 术 路 线v 荧 光 定 量 PCR反 应 灵 敏 ， 微 小 差 异 都 能 被 反 映 ，实 验 中 要 避 免 核 酸 污 染 ， 尤 其 是 避 免 PCR产 物 污染 。v 试 剂 反 复 冻 融 对 实 验 也 有 影 响 ， 各 组 分 采 用 少 量分 装 保 存v 低 浓 度 模 板 反 复 冻 融 容 易 降 解 ， 少 量 分 装 保 存 定 量 方 法v绝 对 定 量v相 对 定 量 标 准 曲 线 由 系 列 稀 释 的 已 知 浓 度 的 样 品 做 标 准 曲 线 计 算 待 测 样 品 的 浓 度log N0 =- Ct logE +logN绝 对 定 量 未 知 浓 度 的 样 品 与 标 准 曲 线 相 比 较 绝 对 定 量v标 准 品 ： 含 有 目 的 片 段 的 浓 度 已 知 的 核 酸v绘 制 标 准 曲 线 时 ， 一 般 选 取 4-5个 点 （ 多 于 5个 更 好 ） ， 被 选 点 的 模 板 浓 度 范 围 要 包 括 待测 样 本 浓 度 相 对 定 量 在 一 定 样 本 中 靶 基 因 相 对 于 另 一 参 照样 本 的 量 的 变 化 v 只 需 要 了 解 相 对 于 参 照 样 本 目 的 基 因 的 表 达 量 的 变 化量 ， 而 不 需 要 确 切 的 知 道 基 因 的 表 达 量 具 体 是 多 少 ，采 用 相 对 定 量 即 可 。v 比 较 的 依 据 是 实 验 时 不 同 样 本 的 总 核 酸 模 板 一 致v 用 表 达 量 基 本 恒 定 的 看 家 基 因 作 为 内 参 照 来 体 现 上 样模 板 的 量 u 比 较 CT法 （ CT ） 前 提 ： 每 个 循 环 增 加 一 倍 的 产 物 数 量 ， 靶 基 因 和 看 家基 因 的 扩 增 效 率 基 本 一 致u 双 标 准 曲 线 法 利 用 两 组 标 准 曲 线 分 别 得 到 目 的 基 因 及 持 家 基 因 的 表达 量 样 本 目 的 基 因 表 达 量 =相 对 定 量 方 法目 的 基 因 标 准 曲 线 测 得 值持 家 基 因 标 准 曲 线 测 得 值 目 标 基 因 与 持 家 基 因 扩 增 效 率 差 别 举 例 对 于 每 一 个 稀 释 梯 度 ， 都 用 GAPDH 和 c-myc 引 物 进 行 扩 增 。 计 算 出 c-myc 和 GAPDH 的 平 均 CT值 以 及 CT值 ， 通 过 cDNA 浓 度 梯 度 的 log 值对 CT值 作 图 ， 如 果 所 得 直 线 斜 率绝 对 值 接 近 于 0 ， 说 明 目 标 基 因 和内 标 基 因 的 扩 增 效 率 相 同 ， 就 可 以通 过 C T 方 法 进 行 相 对 定 量 。 Kenneth J. Livak and Thomas D. Schmittgen,METHODS 25, 402408 (2001) 相 对 定 量 方 法 二 双 标 准 曲 线 法 当 两 个 扩 增 反 应 效 率 不 同 或 者 不 方 便 证 明 的 时 候 ， 则 需 要 通 过 双标 准 曲 线 的 方 法 来 进 行 相 对 定 量 ； 或 者 也 可 以 重 新 设 计 引 物 ， 优 化反 应 条 件 使 得 目 标 序 列 和 内 参 序 列 具 有 相 同 的 扩 增 效 率 。v 对 于 所 用 的 标 准 品 只 要 知 道 其 稀 释 比 例 即 可 。v 最 终 结 果 必 须 除 以 参 照 物 的 量 ， 即 参 照 物 是 1*的样 本 ， 其 它 的 样 本 为 参 照 物 量 的 n倍 。v 在 反 应 中 同 时 扩 增 一 内 源 控 制 物 ， 如 持 家 基 因 等以 标 准 化 起 始 模 板 的 量 谢 谢 !