细胞融合与单克隆抗体

第 一 节 细 胞 融 合 概 述 细 胞 融 合 （ cell fusion)， 又 称 体 细 胞 杂 交 （ somatic hybridiazation） ， 或 细 胞 杂 交 （ cell hybridiazation） ， 是指 在 离 体 条 件 下 将 不 同 种 生 物 或 同 种 生 物 不 同 类 型 的 单 细 胞 通过 无 性 方 式 融 合 成 一 个 杂 合 细 胞 的 技 术 。一 、 细 胞 融 合 的 定 义 uMuller于 1838年 观 察 到 脊 椎 动 的 肿 瘤 细 胞 能 在 体 内 自 发 地 融 合 产 生 多 核 的 肿 瘤 细 胞 。uVirchow于 1858年 描 述 了 正 常 组 织 、 发 炎 组 织 以 及 肿 瘤 组 织 中 的 多 核 细 胞 现 象 。uLuginbuhl于 1873年 观 察 到 天 花 病 人 的 血 液 中 也 有 多 核 的 血 细 胞 存 在 。uLange于 1875年 第 一 个 观 察 到 脊 椎 动 物 （ 蛙 类 ） 的 血 液 细 胞 发 生 融 合 的 过 程 。uCienkawski(1876)、 Buck(1877)、 Geddes(1880)在 无 脊 椎 动 中 发 现 了 细 胞 合 并 现 象 。u1958年 日 本 学 者 冈 田 （ Okada） 发 现 仙 台 病 毒 具 有 触 发 动 物 细 胞 融 合 的 效 应 。u1974年 华 裔 加 拿 大 学 者 高 国 楠 创 立 了 聚 乙 二 醇 （ PEG） 化 学 融 合 法 。u1975年 Kohler和 Milstein成 功 地 融 合 了 小 鼠 B-淋 巴 细 胞 和 骨 髓 瘤 细 胞 而 产 生 能 分 泌 预 定单 克 隆 抗 体 的 杂 交 瘤 细 胞 。 u20世 纪 80年 代 出 现 了 电 融 合 技 术 。 二 、 细 胞 融 合 研 究 进 展 生 物 种 类 细 胞 来 源 成 功 年 代烟 草 两 个 种 间苷 蓝 青 菜大 豆 马 唐 草矮 牵 牛 龙 面 花大 麦 花 生大 麦 大 豆小 麦 矮 牵 牛油 菜 大 豆玉 米 大 豆大 豆 野 豌 豆大 麦 蚕 豆大 豆 草 香 木 犀酵 母 菌 鸡 大 豆 烟 草大 豆 秋 水 仙人 胡 萝 卜番 茄 马 铃 薯人 小 鼠 叶 叶叶 根愈 伤 组 织 叶叶 花 瓣种 子 种 子叶 悬 浮 细 胞叶 花 瓣叶 悬 浮 细 胞叶 悬 浮 细 胞悬 浮 细 胞 悬 浮 细 胞叶 根悬 浮 细 胞 叶原 生 质 体 血 红 细 胞悬 浮 细 胞 叶悬 浮 细 胞 叶腹 水 癌 细 胞 原 生 质 体叶 根 尖纤 维 肉 瘤 细 胞 畸 胎 瘤 细 胞 197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972 几 种 细 胞 融 合 成 功 的 例 子 植 物 融 合 细 胞 成 长 状 态 对 比 ,右 瓶 为 地 面 融 合 的细 胞 ， 左 瓶 中 为 太 空 微 重 力 环 境 下 融 合 的 细 胞 动 物 细 胞 融 合 实 验 使 用 的 小 白 鼠 三 、 动 植 物 细 胞 的 融 合 过 程 植 物 细 胞 融 合 过 程 人 造 小 鼠 培 育 过 程 示 意 图 四 、 细 胞 融 合 的 意 义u理 论 上 说 任 何 细 胞 ， 都 有 可 能 通 过 体 细 胞 杂 交 而 成 为 新 的 生 物 资 源 。 这 对 于 种 质 资 源 的 开 发 和 利 用 具 有 深 远 的 意 义 。u融 合 过 程 不 存 在 有 性 杂 交 过 程 中 的 种 性 隔 离 机 制 的 限 制 ， 为 远 缘 物 种 间 的 遗 传 物 质 交 换 提 供 了 有 效 途 径 。u体 细 胞 杂 交 产 生 的 杂 种 细 胞 含 有 来 自 双 亲 的 核 外 遗 传 系 统 ， 在 杂 种 的 分 裂 和 增 殖 过 程 中 双 亲 的 叶 绿 体 、 线 粒 体 DNA亦 可 发 生 重 组 ， 从 而 产 生 新 的 核 外 遗 传 系 统 。u淋 巴 细 胞 杂 交 瘤 和 单 克 隆 抗 体 的 制 备 。 第 二 节 细 胞 融 合 的 基 本 原 理 显 微 镜 下 细 胞 融 合 过 程 融 合 过 程 中 两 个 细 胞 膜 从 彼 此 接 触 到 破 裂 形 成 细 胞 桥 的 变 化 过 程 图 解 用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图 第 三 节 细 胞 融 合 的 常 用 方 法 一 、 仙 台 病 毒 法仙 台 病 毒 诱 导 细 胞 融 合 经 四 个 阶 段 ： 两 种 细 胞 在 一 起 培 养 ， 加 入 病 毒 ， 在 4 条 件 下 病 毒 附 着 在 细 胞 膜 上 。 并 使 两 细 胞 相 互 凝 聚 ； 在 37 中 ， 病 毒 与 细 胞 膜 发 生 反 应 ， 细 胞 膜 受 到 破 环 ， 此 时 需 要 Ca2+和 Mg2+， 最 适 PH为 8.0一 8.2； 细 胞 膜 连 接 部 穿 通 ， 周 边 连 接 部 修 复 ， 此 时 需 Ca2+和 ATP； 融 合 成 巨 大 细 胞 ， 仍 需 ATP 。 病 毒 促 使 细 胞 融 合 的 主 要 步 骤 如 下 ：1.两 个 原 生 质 体 或 细 胞 在 病 毒 黏 结 作 用 下 彼 此 靠 近 ；2.通 过 病 毒 与 原 生 质 体 或 细 胞 膜 的 作 用 使 两 个 细 胞 膜间 互 相 渗 透 ， 胞 质 互 相 渗 透 ；3.两 个 原 生 质 体 的 细 胞 核 互 相 融 合 ， 两 个 细 胞 融 为 一体 ；4.进 入 正 常 的 细 胞 分 裂 途 径 ， 分 裂 成 含 有 两 种 染 色 体的 杂 种 细 胞 。 用 灭 活 的 病 毒 诱 导 的 动 物 细 胞 融 合 过 程 示 意 图 u 优 点 是 易 得 ， 用 法 简 单 ， 融 合 效 果 稳 定 。u聚 乙 二 醇 (PEG)结 构 为 ： HOH2C（ CH20CH2） nCH2OH， 分 子 量 大 于 200小 于 6000者 均 可 用 作 细 胞 融 合 剂 。uPEG浓 度 以 W/W； 如 将 10克 PEG与 10mlEagLe氏 液 混 合 （ 假 定 1ml 培 养 液 为 1g重 )， 即 成 50 PEG溶 液 。uPEG经 高 压 灭 菌 后 ， 与 温 热 的 Engle氏 液 混 合 。u通 常 用 分 子 量 低 于 1000的 PEG作 融 合 剂 最 好 ， 50 PEG溶 液 能 产 生 最 多 杂 交 细 胞 。uPEG溶 液 在 pH6.0时 细 胞 融 合 率 最 高 。二 、 聚 乙 二 醇 （ PEG） 法 聚 乙 二 醇 （ PEG） 法 细 胞 融 合 过 程 PEG的 作 用 机 理 ： Kao等 认 为 ， 由 于 PEG分 子 具 有轻 微 的 负 极 性 ， 故 可 以 与 具 有 正 极 性 基 团 的 水 、 蛋 白 质和 碳 水 化 合 物 等 形 成 H键 ， 从 而 在 在 质 膜 之 间 形 成 分 子桥 ， 其 结 果 是 使 细 胞 质 膜 发 生 粘 连 进 而 促 使 质 膜 的 融 合 ；另 外 ， PEG能 增 加 类 脂 膜 的 流 动 性 ， 也 使 细 胞 的 核 、 细胞 器 发 生 融 合 成 为 可 能 。 PEG诱 导 融 合 的 特 点 ： 其 优 点 是 融 合 成 本 低 ， 勿 需 特 殊设 备 ； 融 合 子 产 生 的 异 核 率 较 高 ； 融 合 过 程 不 受 物 种 限 制 。其 缺 点 是 融 合 过 程 繁 琐 ， PEG可 能 对 细 胞 有 毒 害 。 聚 乙 二 醇 （ PEG） 法 细 胞 融 合 步 骤（ 1） 将 两 种 不 同 亲 本 细 胞 各 5 l06混 匀 ；（ 2） 离 心 沉 淀 ， 吸 去 上 清 液 ；（ 3） 加 1ml 50 PEG溶 液 ， 用 吸 管 吹 打 ， 使 之 与 细 胞 接 触 1分 钟 ；（ 4） 加 9ml 培 养 液 ， 离 心 沉 淀 ， 吸 去 上 清 液 ；（ 5） 加 5ml 培 养 液 ， 分 别 接 种 5个 直 径 60mm平 皿 ， 每 个 平 皿 加 培养 液 至 5ml， 37 的 CO 2培 养 箱 中 培 养 。（ 6） 624小 时 后 ， 换 成 选 择 培 养 液 筛 选 杂 交 细 胞 。 三 、 电 融 合 法 电 融 合 法 是 80年 代 出 现 的 细 胞 融 合 技 术 ， 在 直 流 电 脉 冲 的诱 导 下 ， 细 胞 膜 表 面 的 氧 化 还 原 电 位 发 生 改 变 ， 使 异 种 细 胞 粘合 并 发 生 质 膜 瞬 间 破 裂 ， 进 而 质 膜 开 始 连 接 ， 直 到 闭 和 成 完 整的 膜 ， 形 成 融 合 体 。电 融 合 法 的 优 点 ：u融 合 率 高 、 重 复 性 强 、 对 细 胞 伤 害 小 ；u装 置 精 巧 、 方 法 简 单 、 可 在 显 微 镜 下 观 察 或 录 像 观 察 融 合 过 程 ； u免 去 PEG诱 导 后 的 洗 涤 过 程 、 诱 导 过 程 可 控 性 强 。 电 融 合 的 基 本 过 程 ：细 胞 膜 的 接 触 ： 当 原 生 质 体 置 于 电 导 率 很 低 的 溶 液 中 时 ， 电 场 通电 后 ， 电 流 即 通 过 原 生 质 体 而 不 是 通 过 溶 液 ， 其 结 果 是 原 生 质 体 在电 场 作 用 下 极 化 而 产 生 偶 极 子 ， 从 而 使 原 生 质 体 紧 密 接 触 排 列 成 串 ；膜 的 击 穿 ： 原 生 质 体 成 串 排 列 后 ， 立 即 给 予 高 频 直 流 脉 冲 就 可 以使 原 生 质 膜 击 穿 ， 从 而 导 致 两 个 紧 密 接 触 的 细 胞 融 合 在 一 起 。 电 融 合 诱 导 法 原 理 示 意 图 第 三 节 杂 种 细 胞 的 筛 选根 据 已 经 发 生 融 合 的 细 胞 中 所 含 有 核 的 类 型 ， 可 将 其分 为 以 下 几 种 类 型 ：u异 核 细 胞 ： 非 同 源 细 胞 的 融 合 体 。u同 核 细 胞 ： 两 个 相 同 细 胞 的 融 合 体 。u多 核 细 胞 ： 含 有 双 亲 不 同 比 例 核 物 质 的 融 合 体 。 u基 于 酶 缺 陷 型 细 胞 和 药 物 抗 性 所 建 立 的 杂 种 筛 选u基 于 营 养 缺 陷 型 细 胞 所 建 立 的 杂 种 筛 选u由 温 度 敏 感 型 细 胞 组 成 的 杂 种 细 胞 的 筛 选u具 有 所 需 性 状 杂 种 细 胞 的 筛 选常 用 的 杂 种 细 胞 筛 选 方 法 第 四 节 细 胞 杂 交 瘤 技 术 与 单 克 隆 抗 体 一、何谓单克隆抗体？ 只 针 对 某 一 抗 原 决 定 簇 的 抗 体 分 子 称 为 单 克 隆 抗 体 。 单 克 隆 抗 体 技 术 的 核 心 是 用 骨 髓 瘤 细 胞 (myeloma cell)与经 特 定 抗 源 免 疫 刺 激 的 B淋 巴 细 胞 (antigen stimulated B lymphoblast)融 合 得 到 杂 交 瘤 细 胞 (hybridoma cell)， 杂 交 瘤细 胞 既 能 象 骨 髓 瘤 细 胞 那 样 在 体 外 无 限 增 殖 ， 又 具 有 B淋 巴 细胞 产 生 特 异 性 抗 体 的 能 力 。 因 此 ， 单 克 隆 抗 体 技 术 又 称 为 杂交 瘤 技 术 (hybridoma technology ） 。 Niels K. Jerne G. Kohler C. Milstein 二 、 杂 交 瘤 技 术 的 基 本 原 理 三 、 杂 交 瘤 细 胞 的 制 备（ 一 ） 骨 髓 瘤 细 胞 选 择 及 选 择 性 培 养 基骨 髓 瘤 细 胞 本 身 不 能 分 泌 抗 体选 择 次 黄 嘌 呤 鸟 嘌 呤 转 磷 酸 核 糖 激 酶 缺 陷 型 （ HGPRT-）胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 缺 陷 型 （ TK-） HAT培 养 基 次 黄 嘌 呤 （ hypoxanthine， H）氨 基 喋 呤 （ aminopterin， A）胸 腺 嘧 啶 脱 氧 核 苷 （ thymidine， T）次 黄 嘌 呤 鸟 嘌 呤 转 磷 酸 核 糖 激 酶 缺 陷 型 （ HGPRT-）胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 缺 陷 型 （ TK-） （ 二 ） 免 疫 小 鼠 免 疫 程 序 是 取 68周 龄 Balb C雌 鼠 ， 基 础 免 疫 2周 ， 静 脉 再 加 强免 疫 一 次 ， 35天 后 用 于 融 合 。 免 疫 时 是 否 采 用 佐 剂 和 事 先 处 理 抗 原 ，要 依 抗 原 性 的 强 弱 而 定 。 一 般 来 讲 可 溶 性 抗 原 用 完 全 佐 剂 效 果 较 好 。抗 原 量 同 样 与 抗 原 强 弱 有 关 ， 以 IgG为 例 ， 第 一 次 为 loog， 第 二 次 为50g， 免 疫 途 径 第 一 次 可 经 腹 腔 注 射 。 对 于 细 胞 性 抗 原 不 用 佐 剂 ， 每次 腹 腔 注 射 1 l0 6一 1 107。 （ 三 ） 脾 细 胞 的 制 备(1)引 颈 处 死 小 鼠 ， 用 酒 精 消 毒 体 表 ；(2)无 菌 条 件 下 取 出 脾 脏 ， 剃 除 结 缔 组 织 和 脂 肪 ， 用 5ml无 血 清 培 养 液 冲 洗 一 次 ；(3)把 脾 脏 置 于 已 消 毒 的 90一 100目 不 锈 钢 网 或 尼 龙 纱 网 中 ；(4)在 脾 中 部 切 开 一 小 口 ， 用 注 射 器 芯 从 一 端 轻 轻 压 挤 ， 再 用 无 血 清 培 养 液 冲 洗 ， 令 细 胞 通 过 纱 网 ， 收 集 入 平 皿 中 ， 或 用 注 射 器 向 脾 脏 内 注 入 3ml无 血 清 培 养 液 ， 反 复 抽 吸 数 次 方 法 获 取 细 胞 ， 再 制 成 细 胞 悬 液 亦 可 ；(5)把 细 胞 悬 液 注 入 50ml离 心 管 中 ， 加 l0一 20ml培 养 液 ： 轻 轻 吹 打 数 次 ， 室 温 中 置 5分 钟 ；(6)离 心 (800一 1000转 分 )计 数 、 备 用 。 （ 四 ） 细 胞 准 备（ 1） 收 集 骨 髓 瘤 细 胞 ， 用 无 血 清 培 养 液 洗 3次 (37 )， 计 数 活 力 细 胞 (不 少 于 90 )；（ 2） 收 集 小 鼠 脾 细 胞 ， 用 无 血 清 培 养 液 洗 3次 (37 )， 并 计 细 胞 数 和 测 定 活 力 细 胞 ；（ 3） 按 1： 5或 1： 10混 合 脾 细 胞 和 骨 髓 瘤 细 胞 后 ， 离 心 弃 去 上 清 ， 并 以 消 毒 滤 纸 吸 净 多 余 上 清 。 （ 五 ） 细 胞 融 合(1)将 1ml 40 的 PEG液 一 滴 滴 加 入 列 细 胞 团 中 ， 在 60秒 内 加 完 ， 同 时 并 不 断 轻 微 转 动 离 心 管 或 用 手 指 轻 弹 离 心 管 ；(2)在 不 断 转 动 离 心 管 中 加 1ml无 血 清 培 养 液 ， 60秒 钟 内 加 完 ；(3)于 5分 钟 内 慢 慢 加 完 20ml无 血 清 培 养 液 ； 此 时 细 胞 对 机 械 损 伤 非 常 敏 感 ，(4)离 心 (800转 分 ， 8分 钟 )， 去 上 清 ， 用 完 全 培 养 液 10ml悬 浮 ， 轻 轻 混 匀 ；(5)取 96孔 板 ， 每 孔 加 50l； (6)取 等 体 积 细 胞 悬 液 ， 向 另 一 96孔 板 中 加 50P1；(7)送 入 5 CO2， 温 箱 中 37 培 养 ， 24小 时 后 更 换 成 HAT选 择 性 培 养 掖 。 （ 六 ） 融 合 后 细 胞 培 养(1)融 合 后 7 10天 用 HAT培 养 液 半 量 换 液 (留 一 半 旧 的 加 一 半 新 的 ) 后 每 隔 2 3天 半 量 换 液 一 次 ；(2)两 周 后 可 改 用 HA培 养 液 半 量 换 液 ， 或 仍 用 HAT培 养 液 ；(3)2 3周 后 出 现 杂 交 细 胞 集 落 ， 细 胞 个 大 、 圆 且 透 明 ；(4)待 集 落 增 殖 生 长 至 1 3孔 时 ， 应 进 行 抗 体 检 测 。 HAT培 养 基 次 黄 嘌 呤 （ hypoxanthine， H）氨 基 喋 呤 （ aminopterin， A）胸 腺 嘧 啶 脱 氧 核 苷 （ thymidine， T）次 黄 嘌 呤 鸟 嘌 呤 转 磷 酸 核 糖 激 酶 缺 陷 型 （ HGPRT-）胸 腺 嘧 啶 核 苷 激 酶 缺 陷 型 （ TK-） （ 七 ） 抗 体 检 测免 疫 荧 光 试 验放 射 免 疫 试 验 (RIA)联 免 疫 吸 附 试 验 (ELISA) （ 八 ） 单 克 隆 抗 体 的 大 量 制 备体 内 法培 养 法 四 、 单 克 隆 抗 体 的 应 用单 克 隆 抗 体 具 有 高 度 的 特 异 性 与 灵 敏 性 ， 可 以 广 泛 地 由 于 临 床 医 学 的 疾 病 诊 断 ， 以 提 高 疾 病 诊 断 的 准 确 性 。利 用 单 克 隆 抗 体 技 术 可 以 生 产 各 种 免 疫 疫 苗 ， 这 不 仅 能 大 大 降 低 生 产 成 本 ， 同 时 也 增 加 了 疫 苗 的 安 全 性 。单 克 隆 抗 体 还 有 可 能 用 于 某 些 肿 瘤 的 治 疗 ， 是 人 类 战 胜 癌 症 十 分 有 望 的 潜 在 技 术 。单 克 隆 抗 体 技 术 还 可 广 泛 用 于 各 种 基 础 医 学 研 究 ， 从 而 推 动 现 代 医 学 的 不 断 发 展 。 第 五 节 人 源 单 克 隆 抗 体主 要 困 难（ 1） 缺 乏 合 适 的 人 骨 髓 瘤 细 胞 株 作 为 融 合 亲 本 。 现 有 的 细 胞 株 大 多 是 融 合率 不 高 ， 杂 交 瘤 抗 体 产 生 水 平 低 ， 而 且 细 胞 不 稳 定 ， 易 丧 失 抗 体 分 泌 能 力 ；（ 2） 获 得 抗 原 特 异 的 人 B淋 巴 细 胞 十 分 困 难 ， 因 为 对 人 来 说 ， 高 度 免 疫 获得 抗 原 特 异 的 B淋 巴 细 胞 的 方 法 显 然 是 不 可 行 的 ；（ 3） 大 量 繁 殖 杂 交 瘤 细 胞 以 获 得 所 需 量 的 抗 体 ， 鼠 类 杂 交 瘤 可 通 过 小 鼠 腹腔 接 种 杂 交 瘤 细 胞 诱 生 腹 水 达 到 这 一 目 的 ， 但 是 人 杂 交 瘤 细 胞 在 鼠 类 中 诱 生 腹 水 是 很 困 难 的 。 本 章 小 结u细 胞 融 合 又 称 体 细 胞 杂 交 ， 是 两 个 或 更 多 个 相 同 或 不 同 细 胞 通 过 膜 融 合 形 成 单 个 细 胞 的 过 程 。u细 胞 融 合 的 方 法 主 要 有 生 物 法 （ 仙 台 病 毒 法 ） 、 化 学 法 （ 聚 乙 二 醇 法 ） 和 物 理 法 （ 电 融 合 法 ） 。u杂 合 细 胞 的 筛 选 方 法 主 要 有 基 于 酶 缺 陷 型 细 胞 和 药 物 抗 性 所 建 立 的 杂 种 筛 选 、 基 于 营 养 缺 陷 型 细 胞 所 建 立 的 杂 种 筛 选 、 由 温 度 敏 感 型 细 胞 组 成 的 杂 种 细 胞 的 筛 选 及 具 有 所 需 性 状 杂 种 细 胞 的 筛 选 。 u基 于 细 胞 融 合 的 杂 交 瘤 技 术 和 单 克 隆 抗 体 技 术 具 有 广 泛 的 应 用 价 值 。