《RNA剪切加工》PPT课件

第 6章 多 数 转 录 的 初 始 产 物 无 生 物 活 性 ， 在 生 物 体 内 进行 加 工 处 理 后 才 具 有 生 物 活 性 。转 录 后 加 工 （ post-transcriptional modification） （ post-transcriptional processing） : 是 指 将 各 种 前 体 RNA分 子 加 工 转 变 成 有 功 能 的 、成 熟 的 各 种 RNA(mRNA、 rRNA或 tRNA等 ) 的 过 程 加 工 的 三 种 形 式 是 ： 减 少 部 分 片 段 ： 如 切 除 5 端 前 导 序 列 ，3 端 尾 巴 和 中 部 的 内 含 子 ； 增 加 部 分 片 段 ： 5 加 帽 ,3加 ploy(A)和 通 过 编 辑 加 入 一 些 碱 基 ； 修 饰 ： 对 某 些 碱 基 进 行 甲 基 化 等 o 原 核 生 物 tRNA和 rRNA加 工o 真 核 生 物 tRNA和 rRNA加 工1.1 tRNA 和 rRNA 的 加 工 1.1.1 tRNA加 工 原 核 生 物 tRNA初 始 转 录 本 有 三 种（ 1） 多 数 为 串 连 在 一 起 的 多 顺 反 （ polycistron）（ 2） 少 数 为 单 顺 反 子（ 3） 由 tRNA和 rRNA串 连 组 成 原 核 生 物 tRNA和 rRNA的 加 工 原 核 生 物 有 两 种 类 型 的 tRNA基 因 ： 1、 具 CCA序 列 型 tRNA CCA下 游 仍 有 一 段 序 列 ， 需 在 酶 的 作 用 下 切 除 2、 无 CCA序 列 型 tRNA 需 在 酶 的 作 用 下 添 加 CCA序 列 （ 1） RNaseP (由 蛋 白 质 和 RNA组 成 的 复合 体 )可 切 除 E.coli前 体 tRNA 5的 前 导 序列 （ 41nt） 。 该 酶 不 识 别 特 殊 的 序 列 ， 而是 识 别 二 级 结 构 发 夹 所 组 成 的 tRNA。（ 2） 去 尾 ， 形 成 3 OH末 端 。 由 内 切 酶和 外 切 酶 共 同 参 与 。 2. rRNA的 加 工 在 E.coli中 rRNA有 7个 转 录 单 位 ,每 个 转 录 单 位 含有 16S、 23S、 5S rRNA 及 一 个 或 几 个 tRNA。 rRNA前 体 的 加 工 由 RNase 负 责 。 真 核 生 物 tRNA 和 rRNA的 加 工 1. tRNA的 加 工 真 核 tRNA的 基 因 与 原 核 不 同 ： 1） 真 核 的 前 体 分 子 tRNA数 目 多 、 单 顺 反 子 、 成 簇 排列 、 有 基 因 间 隔 区 。 例 如 ： 爪 蟾 tRNA基 因 数 目 200拷 贝 ， 酵 母 约 有 400个 tRNA基 因 ， 是 一 种 重 复 序 列 ； 2） 真 核 的 前 体 分 子 tRNA中 含 有 内 含 子 。 其 加 工 过 程 要 剪 接 内 含 子 ， 都 要 加 CCA tRNA半 分 子 tRNA半 分 子 真 核 tRNA内 含 子 的 切 除 和 其 他 内 含 子 的 切除 是 不 同 的 ： 1） 没 有 交 界 序 列 ， 没 有 内 部 引 导 序 列 ; 2） 切 除 是 依 赖 于 蛋 白 质 的 RNase; 3） 不 是 转 酯 反 应 ； 4） 其 剪 切 原 则 上 是 依 赖 于 对 tRNA共 同 的 二 级 结 构 的 识别 。 2.真 核 rRNA的 加 工 真 核 生 物 的 18S、 5.8S和 28S rRNA基 因 串 联 在 一起 形 成 一 个 转 录 本 ， 初 级 转 录 本 为 45S前 体 ， 5S RNA与 它 们 分 开 转 录 ， 这 和 原 核 的 rRNA基 因 不 同 。 1） 真 核 rRNA基 因 中 没 有 内 含 子 。 2） 在 转 录 时 或 转 录 后 有 110个 甲 基 化 酶 立 即 结 合导 转 录 本 上 ： 保 持 到 rRNA加 工 成 熟 。 18S RNA 结 合 39个 甲 基 化 酶 （ 胞 质 中 加 上 4个 ） 28S RNA 结 合 74个 甲 基 化 酶 表 明 甲 基 化 用 于 标 明 转 录 本 的 加 工 区 域 1.2 前 体 mRNA的 加 工1.2.1 原 核 前 体 mRNA的 加 工1.2.2 真 核 前 体 mRNA的 加 工 1.2.1 原 核 前 体 mRNA的 加 工 原 核 生 物 的 mRNA一 般 不 经 过 加 工 ， 由于 转 录 和 翻 译 偶 联 ， 中 间 没 有 加 工 的 时 间 。 少 数 情 况 ： 多 顺 反 子 mRNA先 被 内 切 酶切 成 较 小 的 单 位 再 作 为 翻 译 的 模 板 。 1.2.2 真 核 mRNA的 加 工 真 核 mRNA的 加 工 一 般 要 经 过 四 个 步 骤 ： 1） mRNA的 5 端 加 帽 2） mRNA的 3 端 多 聚 腺 苷 酸 化 （ 加 尾 ） 3） 切 除 内 含 子 4） 修 饰 （ 对 某 些 碱 基 进 行 甲 基 化 ） 1.2.2.1 mRNA的 5加 帽n 成 熟 的 真 核 生 物 并 没 有 游 离 的 5 端 ， 只 有 所 谓 的 帽 子 结 构 ， 该结 构 是 通 过 转 录 加 工 加 上 去 的 。n mRNA的 5加 帽 是 一 个 多 步 加 工 过 程 ， 第 一 步 是 鸟 苷 转 移 酶 （ guanylyl transferase） 将 一 个 鸟 苷 酸加 在 5 RNA的 前 端 ， 产 生 5-5对 接 的 磷 酸 二 酯 键 。 第 二 步 由 鸟 嘌 呤 甲 基 转 移 酶 （ quanine methyl transferase ）将 一 个 甲 基 基 团 加 到 嘌 呤 环 的 7位 氮 原 子 使 5帽 子 鸟 嘌 呤 转 变 为7-甲 基 鸟 嘌 呤 。 1.2.2 真 核 mRNA的 加 工 存 在 于 各 类 帽 子 中 存 在 于 类 帽 子 中存 在 于 类 帽 子 中CH3CH 3 mRNA 5加 帽 的 功 能 主 要 表 现 在 4个 方 面 ： 1） 保 护 mRNA5 端 不 被 降 解 细 胞 内 存 在 许 多 RNA酶 （ RNase） ， 它 们 可 攻 击 游 离 的 RNA分 子 。 RNA酶 的 降 解 从 5端 起 始 ， 当 在 mRNA的 5端 加 上 m7GpppG帽 子 后 ， 带 有 3个 连 接 磷 酸 的 5帽 可 阻 止 RNase切 割 。 2） 为 核 糖 体 识 别 mRNA提 供 信 号 ， 提 高 翻 译 效 率 真 核 生 物 mRNA必 须 通 过 5帽 结 合 蛋 白 才 能 接 触 核 糖 体 ， 起 始 翻 译 。 缺 少加 帽 的 mRNA由 于 不 能 被 5帽 结 合 蛋 白 识 别 ， 其 翻 译 效 率 比 加 帽 的 mRNA低 二 十 倍 。 3） 作 为 进 出 细 胞 核 的 识 别 标 记 。 4） 提 高 mRNA的 剪 接 效 率 。 1.2.2.2 mRNA的 加 尾 （ 3 端 多 聚 腺 苷 酸 化 ）n 几 乎 所 有 真 核 生 物 成 熟 的 mRNA末 端 都 有 一 串 约 250个 腺 嘌 呤 核 苷 酸尾 巴 。 它 们 并 非 模 板 DNA编 码 ， 而 是 在 转 录 完 成 后 由 poly (A) 多 聚 酶 合 成 。 加 尾 位 置 不 在 转 录 物 的 最 末 端 ， 而 是 在 接 近 末 端 的 内 部 位 点 。 在 切 除 mRNA 3末 端 的 一 段 序 列 后 ， 再 加 上 多 聚 腺 苷 酸 。n 真 核 生 物 mRNA poly (A)长 度 并 非 固 定 不 变 。 细 胞 核 中 的 poly (A)长 度 平 均 为 210 20 nt， 细 胞 质 poly (A )长 度190 20 nt。 输 送 到 细 胞 质 中 的 mRNA其 poly (A)可 由 RNase切 短 ， 但 又 能 经 细 胞 质 poly（ A） 酶 重 新 加 长 ， 保 持 有 限 的 长 度 。 细 胞 质 中 mRNA的 poly (A)长 度 总 的 趋 势 是 逐 渐 变 短 ， 直 到 丢 失 大 部 分 或全 部 poly（ A） ， 此 时 mRNA的 寿 命 亦 接 近 终 点 。 1.2.2 真 核 mRNA的 加 工 加 尾 信 号 新 合 成 的 mRNA的 3 -端 含 两 个 明 显 的 加 尾 信 号 。 第 一 个 加 尾 信 号 位 于 poly (A)上 游 约 1020个 核 苷 酸 处 。 其一 致 顺 序 为 5AAUAAA3。 该 加 尾 信 号 中 最 多 的 变 异 发 生在 第 二 个 碱 基 ， 其 它 位 置 的 碱 基 代 换 将 使 Poly (A)加 尾 效 率急 剧 下 降 。 第 二 个 加 尾 信 号 位 于 5AAUAAA3顺 序 下 游 约 15-24 bp位 置 处 ， 有 一 段 富 GU序 列 ， 紧 随 其 后 通 常 有 一 串 富 T的 顺序 ： 5-AAUAAA-24 bp-GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT-3 CPSF: cleavage and polyadenylation specifity factorCstF:cleavage stimulation factor 如 果 改 变 5AAUAAA3位 置 ， 加 尾 位 点 改 变 。 缺 失 5AAUAAA3顺 序 ， 则 不 发 生 加 尾 。 富 GU序 列 和 紧 随 其 后 的 富 T序 列 对 正 常 的 加 尾 不可 缺 一 ， 如 保 留 富 GU顺 序 ， 除 去 富 T顺 序 ， 加 尾效 率 仅 及 对 照 的 30%。 如 保 留 富 T顺 序 ， 除 去富 GU顺 序 ， 加 尾 效 率 降 至 10%。 同 时 缺 失 GU序 列 和 富 T序 列 ， 即 使 保 留 5AAUAAA3顺 序也 不 能 进 行 加 尾 。 此 外 ， GU/T序 列 与5AAUAAA3顺 序 的 相 对 位 置 也 很 重 要 ， 如在 5AAUAAA3顺 序 的 下 游 插 入 16 bp， 加尾 效 率 只 有 正 常 的 10%。 如 在 GU序 列 和 富 T序列 之 间 插 入 5 bp， 加 尾 效 率 丧 失 70%。 mRNA的 多 聚 腺 苷 酸 化 mRNA的 多 聚 腺 苷 酸 化 涉 及 两 个 步 骤 ， 首 先 必 须 在 加 尾 的 核 苷 酸 位 置切 断 RNA， 然 后 在 游 离 的 3末 端 进 行 多 聚 腺 苷 酸 化 。 有 许 多 蛋 白 质 参 与 poly(A)的 加 尾 事 件 。 1） 参 与 Poly(A)加 尾 的 蛋 白 质 称 为 切 割 与 多 聚 腺 苷 酸 化 专 性 因 子（ cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF） ， CPSF专 一 性 与 加 尾 信 号 5AAUAAA3结 合 。 2） 另 一 个 蛋 白 即 切 割 激 发 因 子 CstF（ cleavage stimulation factor, CstF） 特 异 附 着 在 富 GU区 。 因 此 CPSF和 CstF实 际 结 合 的位 置 处 于 切 割 与 多 聚 腺 苷 酸 化 位 点 两 侧 。 CPSF或 CstF单 个 因 子 与 信号 顺 序 结 合 都 是 不 稳 定 的 ， 只 有 两 者 同 时 附 着 在 两 个 信 号 位 置 才 保 持稳 定 状 态 。 3） 此 外 还 有 另 两 个 蛋 白 对 RNA的 切 割 必 不 可 少 ， 它 们 分 别 是 切 割 因子 I和 II（ cleavage factors I and II， CFI和 CFII） ， 可 与RNA结 合 。 poly（ A） 多 聚 酶 ， CFI和 CFII与 RNA结 合 的 位 置 处 于两 个 加 尾 信 号 之 间 。 虽 然 切 割 与 加 尾 是 两 个 性 质 不 同 的 事 件 ， 但 实 际进 行 时 几 乎 同 时 发 生 ， 实 验 设 计 很 难 将 其 分 开 。 严 格 说 来 切 割 信 号 和 加 尾 信 号 是 不 相 同 的 。 前 体 mRNA切 割 的 位 置 处 于 5AAUAAA3下 游 15-25 nt之间 ， 由 切 割 酶 专 一 性 识 别 。 poly（ A） 多 聚 酶 只 是 利 用 已 产 生 的 3游 离 末 端 将 腺 苷 酸 逐 个连 接 ， 加 尾 信 号 实 际 上 是 5AAUAAA3以 及 下 游 一 段 不 能少 于 8 nt的 顺 序 。 一 旦 mRNA前 体 被 切 断 之 后 ， 多 聚 腺 苷 酸 化立 即 开 始 。 多 聚 腺 苷 酸 化 可 细 分 为 两 个 阶 段 ， 首 先 依 赖 5AAUAAA3信 号 和 与 之 结 合 的 CPSF缓 慢 合 成 约 10个 核 苷 酸 ， 然 后 依 赖 已合 成 的 寡 聚 腺 苷 酸 迅 速 在 其 末 端 加 上 200或 更 多 个 腺 苷 酸 。 Cleavage of the 3 end of histone mRNA may require a small RNA H istone mRNAs are not polyadenylated; their 3 ends are generated by a cleavage reaction that depends on the structure of the mRNA. The cleavage reaction requires the SLBP to bind to a stem-loop structure, and the U7 snRNA to pair with an adjacent single-stranded region. 增 加 mRNA的 稳 定 性 将 携 带 或 缺 少 poly（ A） 的 球 蛋 白 mRNA注 入 到 蛙 卵 中 ， 结 果 发 现 ， 在 6小时 后 缺 少 poly（ A） 的 球 蛋 白 mRNA不 再 进 行 翻 译 ， 而 携 带 poly（ A） 的 处理 仍 然 正 常 合 成 球 蛋 白 。 最 简 单 的 解 释 是 ， poly（ A） 有 助 于 增 加 mRNA的稳 定 性 提 高 mRNA翻 译 效 率 mRNA的 翻 译 需 要 PAB I（ poly（ A） binding protein I， poly（ A）结 合 蛋 白 I） 的 蛋 白 参 与 ， 它 们 与 poly（ A） 的 结 合 可 提 高 mRNA的 翻 译 效 率 。如 果 在 mRNA样 品 中 加 入 过 量 的 poly（ A） ， 可 急 剧 降 低 蛋 白 质 合 成 的 数 量 。原 因 在 于 大 量 poly（ A） 与 PAB I因 子 竟 争 性 结 合 ， 使 mRNA缺 少 必 需 的PAB I， 因 而 不 能 有 效 翻 译 。 此 外 适 当 延 长 poly（ A） 核 苷 酸 数 目 可 控 制mRNA的 翻 译 。 活 细 胞 中 很 少 mRNA的 poly（ A） 长 度 少 于 30 nt， 低 于 这一 长 度 mRNA不 能 翻 译 。 poly（ A） 可 影 响 mRNA前 体 最 后 一 个 内 含 子 的 剪 切 ， 缺 少poly（ A） 使 剪 接 效 率 降 低 5-10倍 。 o1、 核 酶o2、 RNA中 的 内 含 子o3、 RNA的 剪 切o4、 RNA的 编 辑 和 修 饰 RNA的 剪 接 转 录 后 加 工 是 产 生 各 种 成 熟 RNA分 子 的 重 要 过程 在 真 核 生 物 的 mRNA前 体 中 ， 将 内 含 子 （ intron）去 除 ， 而 把 外 显 子 （ exon） 连 接 起 来 形 成 成 熟 RNA分子 的 过 程 ， 称 为 RNA剪 接 （ RNA splicing） 。 加 工 过 程 推 测 的 生 理 功 能加 帽 反 应 mRNA从 核 内 向 胞 质 运 输加 尾 反 应 转 录 终 止 ， 翻 译 起 始 和 mRNA降 解RNA剪 接 从 mRNA、 tRNA和 rRNA分 子 中 切 除 内 含 子RNA切 割 从 前 体 RNA中 释 放 成 熟 tRNA和 rRNARNA加 工 过 程 及 其 生 理 功 能 1. 核 酶 (ribozyme)o 核 酶 (ribozyme)有 的 译 为 核 糖 拟 酶 ， 核 酶 等 。o 核 酶 是 T Cech和 S Altman (1981年 )在 研究 四 膜 虫 rRNA时 发 现 的 ， 1982年 T Cech由核 糖 核 酸 (ribonucleic acid)和 酶 (enzyme)这 两 个 词 “ 重 组 ” 成 一 个 新 的 词 ：“ ribozyme”。o 它 是 指 本 质 为 RNA或 以 RNA为 主 含 有 蛋 白 质 辅 基 的 、具 有 催 化 功 能 的 一 类 物 质 。 一 、 核 酶核 酶 和 酶 的 区 别 ， 主 要 在 ：1. 一 般 的 酶 是 纯 的 蛋 白 质 ， 而 核 酶 是 RNA或 带 有 蛋 白的 RNA；2. 核 酶 既 是 催 化 剂 又 是 底 物 ， 随 着 反 应 的 进 行 ， 本身 也 消 失 了 。 而 酶 却 不 同 ， 仅 催 化 反 应 ， 反 应 前后 其 本 身 的 质 和 量 都 不 发 生 改 变 。 核 酶 催 化 的 反 应 分 为 两 类 ：自 体 催 化 包 括 ： 第 一 组 内 含 子 的 自 我 剪 接 ； 第 二 组 内 含 子 的 自 我 剪 切 ； 植 物 类 病 毒 和 拟 病 毒 的 自 我 剪 切 。半 自 体 催 化 包 括 ： 核 mRNA内 含 子 的 剪 切 ； 锥 虫 SLRNA的 反 式 拼 接 ； tRNA 5加 工 （ 不 属 于 转 酯 反 应 内 含 子 的 剪 接 ， 但 也 是 核 酶 的 活 性 之 一 ） 除 核 酶 之 外 ， 核 酸 酶 和 由 内 含 子 本 身 编 码 的 成 熟 酶 也 参 与某 些 内 含 子 的 剪 切 ， 如 真 核 tRNA内 含 子 和 酵 母 cob基 因 的 内 含子 的 2的 剪 接 。 2. RNA中 的 内 含 子基 因 长 度 /kb 内 含 子 数 量 内 含 子 所 占 比 例 /%胰 岛 素 1.4 2 67球 蛋 白 1.4 2 69血 清 蛋 白 18 13 89胶 原 蛋 白 组 分 31 117 71 因 子 186 25 95 萎 缩 性 肌 强 直 因 子 2 400 78 99部 分 人 类 基 因 中 ， 内 含 子 序 列 所 占 比 重 的 分 析 内 含 子 去 除 、 RNA的 剪 接 基 本 方 式 ： 在 高 等 真 核 生 物 ， 核 RNA内 含 子 的 去 除 由 剪 接 装 置(splicing apparatus)完 成 ， 在 外 显 子 和 内 含 子 交 界 处和 内 含 子 内 部 有 可 供 识 别 的 特 异 序 列 ， 剪 接 装 置 由 多种 蛋 白 质 和 核 蛋 白 组 成 ； 有 两 类 内 含 子 的 去 除 属 自 剪 接 ， 具 有 中 部 核 心 结 构 ，形 成 特 定 的 二 级 结 构 ， RNA具 有 催 化 剪 接 的 作 用 ； 酵 母 tRNA的 剪 接 需 要 蛋 白 质 酶 的 参 与 ， 该 酶 与 tRNA后 加 工 过 程 中 的 酶 有相 似 之 处 。 除 tRNA的 剪 接 之 外 ， 其 他 RNA的 剪 接 尽 管 参 与 反 应 的 要 素 不同 ， 但 都 属 于 转 酯 反 应 。 1. 内 含 子 的 边 界 顺 序 由 保 守 的 基 序 组 成比 较 大 量 的 真 核 生 物 mRNA内 含 子 发 现 ， 它 们 的 两 侧 边 界 均 有 一 对 保 守 顺 序 ， 即5-端 为 GU， 3-端 为 AG， 这 类 称 为 GUAG的 内 含 子 均 以 相 同 方 式 剪 切 。 在 不 同 的 真 核 生 物 中 ， 内 含 子 的 一 致 顺 序 有 不 少 变 化 ， 动 物 中 典 型 的 剪 接位 置 一 致 顺 序 组 成 为 ： 5AGGUAAGU-YNYURAY-Y10-20-YAG3 其 中 Y为 U或 C， N为 任 何 核 苷 酸 ， 箭 头 所 指 为 外 显 子 与 内 含 子 的 交 界 。 5端 剪 接 位 称 供 体 位 （ donor site） ， 3 端 剪 接 位 称 受 体 位 （ acceptor site） 。 仅 仅 GUAG边 界 顺 序 并 不 能 保 证 内 含 子 的 正 确 剪 切 ， 因 为 在 内 含 子 中 有 不少 相 同 的 GUAG顺 序 。 内 含 子 中 还 有 另 一 段 识 别 剪 接 边 界 必 不 可 少 的 序 列称 为 分 枝 点 ， 位 于 3 -端 剪 接 位 的 上 游 ， 具 有 特 征 性 组 成 ： -YNCURAY-，Y表 示 嘧 啶 （ U或 C） ， R表 示 嘌 呤 （ A或 G） ， A是 剪 接 时 参 与 形 成 分 枝 的特 别 位 点 。 紧 接 在 分 枝 点 的 下 游 有 一 段 多 嘧 啶 序 列 ， 也 是 参 与 剪 接 事 件 蛋白 接 合 的 位 置 。 酵 母 中 分 枝 点 序 列 为 5UACUAAC3， 位 于 3剪 接 位 上 游 18到 140 bp 之 间 ， 其 作 用 不 同 于 高 等 真 核 生 物 。 类 型 分 布GU-AG内 含 子 真 核 生 物 细 胞 核 前 体 mRNAAU-AC内 含 子 真 核 生 物 细 胞 核 前 体 mRNAI型 （ Group ） 内 含 子 真 核 生 物 细 胞 核 前 体 rRNA细 胞 器 RNA,少 数 细 菌 RNAII型 （ Group ） 内 含 子 细 胞 器 RNA， 某 些 原 核 RNAIII型 （ Group ） 内 含 子 细 胞 器 RNA双 内 含 子 （ Twintron） 细 胞 器 RNA前 体 tRNA内 含 子 真 核 生 物 细 胞 核 前 体 tRNA古 细 菌 内 含 子 不 同 的 RNA 3、 RNA的 剪 切o3.1 mRNA前 体 的 剪 切 3.1.1 核 内 小 RNA 3.1.2 RNA的 剪 切 过 程o3.2 类 内 含 子 剪 切o3.3 类 内 含 子 剪 切o3.4 顺 式 剪 切 与 反 式 剪 切 3.1.1 核 内 小 RNA 3.1.2 RNA的 剪 切 过 程3.1 mRNA前 体 的 剪 切 3.1.1 剪 接 要 求 snRNAs的 参 与 U1 snRNA 碱 基 互 补 配 对 方 式识 别 mRNA前 体 5剪 切 点U2辅 助 因 子 与 3剪 切 点 上 游 的 富 嘧 啶 区 结 合识 别 mRNA前 体 3剪 切 点 U2 snRNP 与 分 支 点 结 合U2 snRNA 剪 切 前 体 60S剪 切 体 spliceosome U4、 U5、 U6 snRNP三 聚 体 3.1.2 核 mRNA的 剪 接n 核 mRNA的 剪 接 过 程 和 类 内 含 子 十 分 相 似 ，根 本 区 别 是 ： 核 mRNA前 体 本 身 不 能 形 成 二 级结 构 ， 必 需 依 赖 于 snRNP(U1,U2,U4,U5和 U6)的 帮 助 才 能 形 成 剪 接 体 ， 进 行 自 我 剪 接 。n 结 构 特 点 ： 边 界 顺 序 完 全 符 合 GU-AG法 则 含 分 枝 点 序 列 内 含 子 5 端 保 守 序 列 （ 5 GUAAGUA3） 和 U1snRNA的 5 端 保 守 序 列 3 CAUUCAU5互 补 The first complex formed during splicing is the E (early presplicing) complex, which contains U1 snRNP, the splicing factor U2AF, and members of a family called SR proteins, which comprise an important group of splicing factors and regulators. u1u2u5u4u6 u1 u4u5u4u6u2 u5u5u2u6 u1u1u2u2u2u6 E complex + U2 A complex (U2与 分 枝 位 结 合 )B1 complex (U5/U4/U6三 聚 体结 合 ， U5结 合 在 外 显 子 5 端 ，U6与 U2结 合 )B2 complex (释 放 出 U1,U5从外 显 子 向 内 含 子 移 动 ， U6结 合在 5 剪 接 位 点 )C1 complex (释 放 出 U4,U6/U4催 化 转 酯 反 应 ， U5结 合 在 外 显子 3 剪 接 位 点 .5 位 点 被 切 开 ，形 成 套 索 )C2 complex (U2/U5/U6仍 结 合在 套 索 上 。 3 位 点 被 切 开 ， 外显 子 被 连 接 )释 放 出 剪 接 了 的 RNA,套 索 脱 分 枝 成 线 状 。 播 放 动 画 mRNA splicing. mov 3.2 类 内 含 子 及 其 剪 接n 1.发 现 Cech et al. 1981 研 究 四 膜 虫 （ Tetrahymena thermophila） 35S的 前 体 rRNA（ 含 有 413nt 的 内 含 子 ） 在 体 外 能 够 进 行 自 我 剪 接 2.分 布 类 内 含 子 常 分 布 于 低 等 真 核 生 物 的 细 胞 器 中 ， 如 四 膜 虫 的 rRNA； 大 部 分 真 菌 如 酵 母 的 mtDNA； 植 物 叶 绿 体 基 因 的 内 含 子 ； T4噬 菌 体 的 3个 基 因 中 也 存 在 类 内 含 子 3.结 构 特 点 边 界 序 列 为 5 UG3 内 含 子 中 有 中 部 核 心 结 构 (central core stucture) 内 部 引 导 序 列 （ internal guide sequenece,IGS） IGS 内 部 引 导 序 列 （ internal guide sequenece,IGS ） ：1982年 由 Davies提 出 ， 由 6个 nt组 成 ， GGAGGG（ 四 膜 虫 ） 。 内 含 子 中 可 与 外 显 子 配 对 的 序 列 称 为内 部 引 导 区 。最 初 认 为 IGS的 作 用 是 通 过 和 两 个 外 显 子 近 侧 区 配 对 ，使 外 显 子 并 在 一 起 ， 现 在 认 为 其 作 用 是 决 定 剪 接 的专 一 性 。 类 内 含 子的 剪 接 机 制 自 剪 接 （ self-splicing） 反应 ， 通 过 3次连 续 的 转 酯 反应 完 成 。 只 是 磷 酸 酯 键的 直 接 转 移 ，没 有 水 解 ， 不需 能 量 。 3.3 类 内 含 子 的 剪 接n 类 内 含 子 的 剪 接 和 类 内 含 子 不 同 ， 而 和 核 mRNA内 含 子 的 剪 切 有 些 相 似 。n 分 布 ： 在 酵 母 mtRNA,细 胞 色 素 氧 化 酶 的 a亚 基 、 b亚基 ， 玉 米 mtRNA、 tRNA以 及 真 核 mRNA前 体 中 。 n 边 界 序 列 为 5 GUGCG- - -YnAG,符 合 GTAG法则 v 与 前 所 叙 的 核 基 因 mRNA的 剪 接 过 程 相 比 ， 类 内 含 子 的 最 大 特 定 是 不 需 要 其 他 成 分 的参 与 ， RNA分 子 本 身 能 形 成 剪 接 所 需 的 空 间结 构 和 催 化 活 性 区 域 。 在 核 基 因 mRNA的 剪接 过 程 中 ， 需 要 多 种 成 分 特 别 是 snRNA与RNA前 体 共 同 作 用 才 能 形 成 剪 接 所 需 的 空 间结 构 ， 产 生 具 催 化 功 能 的 区 域 。 3.4 顺 式 剪 切 与 反 式 剪 接 3.4.1 顺 式 剪 接 （ cis-splicing） 内 含 子 的 剪 接 一 般 都 是 发 生 在 同 一 个 基 因 内 ， 切 除内 含 子 ， 相 邻 的 外 显 子 彼 此 连 接 ， 称 为 顺 式 剪 接 。 对 很 多 基 因 而 言 ， RNA剪 接 是 一 个 不 变 的 加 工 过 程 。基 因 转 录 时 所 有 细 胞 中 产 生 同 样 的 成 熟 转 录 本 及 单 种 产物 。 这 称 为 组 成 型 剪 接 (constructive splicing)。 其 他 一 些 基 因 ， RNA剪 接 可 以 作 为 基 因 调 节 的 机 制 ，也 就 是 说 在 两 种 组 织 中 同 一 基 因 表 达 不 同 ， 尽 管 它 以 相同 的 方 式 和 速 度 转 录 。 这 样 的 调 节 以 两 种 方 式 发 生 。 第 一 种 情 况 : 加 工 或 去 除 调 节 (processing ordiscard regulation)， 初 始 转 录 本 在 一 些 组 织 中 加 工 ， 在 其 他 组织 中 不 剪 接 。 在 有 些 低 等 真 核 生 物 中 (如 海 胆 )， 这 是 主 要 调 节 机 制 。 大 部 分基 因 在 大 部 分 组 织 中 转 录 ， 由 RNA加 工 调 节 来 决 定 那 些 基 因 被 翻 译 。在 果 蝇 中 ， 一 个 类 似 的 机 制 用 来 控 制 P因 子 转 座 酶 (参 阅 )的 合 成 ， 在这 种 情 况 下 虽 然 只 有 一 个 内 含 子 未 被 剪 接 ， 但 却 限 制 了 P因 子 转 座 只发 生 在 生 殖 细 胞 中 。 转 座 酶 基 因 包 含 三 个 内 含 子 ， 在 生 殖 细 胞 中 产 生 成 熟 的 编 码 转座 酶 的 转 录 本 ， 然 而 在 其 他 组 织 中 ， 第 三 个 含 终 止 密 码 子 的 内 含 子被 保 留 ， 使 转 座 酶 蛋 白 截 短 ， 从 而 阻 止 体 细 胞 中 P因 子 的 转 座 。 内 源 性 基 因 也 用 同 样 的 策 略 ， 如 哺 乳 动 物 GABAA受 体 E亚 基 的 mRNA前 体 除 了 脑 以 外 其 他 组 织 都 不 剪 接 。 第 二 种 情 况 : 差 别 或 选 择 性 剪 接 (differential alternative splicing)基 本 转 录 体 通 过 选 择 使 用 外 显 子 以 不 同 方 式 加 工 相 关 成 熟 转 录 体 家 族 产 生 不 同 基 因 产 物 ， 称 为 剪 接 变 异 体 (splicevariants)或 剪 接 异 构 体(spliceisoforms)。 可 变 剪 接 产 生 多 种 RNA 选 择 性 剪 接 以 多 种 方 式 进 行 ： 1） 利 用 不 同 的 外 显 子 由 于 不 同 细 胞 类 型 有 着 不 同 修 饰 的 反 式 因 子 ， 导 致 利 用不 同 的 外 显 子 。 例 如 动 物 细 胞 的 原 肌 球 蛋 白 (atropomyosin) 基 因 有 13个 外 显 子 。 2) 两 个 相 互 排 斥 的 外 显 子 的 剪 接 有 两 类 外 显 子 对 ， 每 对 之 中 只 有 一 个 成 员 能 剪 接 到 成 熟 的mRNA中 ， 看 来 像 是 相 互 排 斥 似 的 。 降 钙 素 (calcitonin)和 降钙 素 基 因 相 关 肽 (calcitoningenerelatedpeptide， CGRP)分别 利 用 相 邻 的 两 个 外 显 子 ， 得 到 的 两 种 产 物 分 别 为 甲 状 腺 和神 经 元 细 胞 中 所 特 有 。 (3)半 个 起 始 位 点 ， 多 个 加 poly(A)位 点 一 些 真 核 病 毒 转 录 物 存 在 多 至 5个 这 样 的 位 点 (Tsurshital988)。 对 于 一 个 有 两个 加 poly(A)位 点 的 转 录 物 ， 大 多 数 细 胞 类 型 通 过 利 用 内 侧 的 位 点 产 生 分 泌 型的 蛋 白 ， 一 些 分 化 的 细 胞 类 型 犀 其 产 物 是 膜 蛋 白 的 转 录 物 ， 则 利 用 外 侧 的 位 点产 生 具 有 膜 锚 序 列 的 膜 结 合 蛋 白 。 还 是 用 降 钙 素 和 CGRP的 例 子 ， 前 者 利 用 内侧 的 加 poly(A)位 点 ， 后 者 则 利 用 外 侧 的 。 可 能 存 在 某 种 细 胞 类 型 特 异 的 反 式激 活 因 子 提 高 外 侧 位 点 的 利 用 效 率 。 (4)多 个 5 剪 接 位 点 竞 争 同 一 3 剪 接 位 点 有 一 些 基 因 含 有 多 个 5 剪 接 位 点 ， 它 们 的 选 择 依 赖 于 5 剪 接 位 点 的 强 度 (高 度适 配 者 强 )、 与 3 剪 接 位 点 的 接 近 程 度 、 空 间 限 制 等 因 素 之 间 的 平 衡 。在 大 多 数 细 胞 类 型 中 将 选 择 上 游 的 5 剪 接 位 点 ， 而 使 处 于 下 游 的 5 剪 接 位 点 无效 ， 主 要 是 因 为 后 者 与 分 叉 点 的 距 离 一 般 太 近 而 不 利 于 建 立 剪 接 体 之 故 (Noble l988)。也 有 的 分 别 利 用 不 同 的 5剪 接 位 点 ， 得 到 不 同 的 产 物 。 (5)内 含 子 保 留 和 框 式 外 显 子 有 的 情 况 下 ， 一 个 内 含 子 不 被 剪 接 而 保 留 下 来 ， 如 果 维 持 可 读框 架 ， 便 是 一 个 多 肽 片 段 的 插 入 ； 如 果 移 格 ， 便 会 产 生 功 能 不同 的 产 物 或 者 关 掉 基 因 的 表 达 。 所 谓 盒 式 外 显 子 是 指 那 些 与 其 他 邻 近 的 外 显 子 的 剪 接 无 关 而 独立 剪 接 的 外 显 子 。 当 几 个 盒 式 外 显 子 存 在 于 同 一 个 转 录 物 中 ，其 产 物 会 产 生 高 度 的 趋 异 ， 如 一 个 基 因 含 有 5个 盒 式 外 显 子 ，再 加 上 一 对 相 互 排 斥 的 外 显 子 ， 在 理 论 上 可 以 生 64种 同 工 型 多肽 。 真 核 基 因 存 在 5个 以 上 的 外 显 子 是 常 有 的 ， 甚 至 多 达 37个 外 显子 ， 由 此 产 生 蛋 白 质 的 多 样 性 是 十 分 丰 富 的 。 肌 钙 蛋 白 T有 13个 外 显 子 ， 编 码 259个 氨 基 酸 残 基 ， 然 而 此蛋 白 的 长 度 在 体 内 不 同 部 位 的 肌 肉 中 是 不 同 的 。有 11个 外 显 子 (黑 框 )是 所 有 mRNA都 有 的 ；外 显 子 48(白 框 )则 可 自 由 组 合 (4、 6、 8， 4、 7、 8， 7、 8等 等 )， 共 有 32种 可能 性 ；外 显 子 16和 17(灰 框 )是 相 互 排 斥 的 ， 两 者 只 能 有 一 个 出 现 在 成 熟 的 蛋 白 质 中 。这 样 ， 总 共 就 有 64种 可 能 的 mRNA。 (6)非 剪 接 位 点 的 序 列 参 与 调 节 一 些 真 核 生 物 的 病 毒 RNA其 初 级 转 录 物 即 使 有 正 确 的 功 能 剪 接 位 点 ，有 时 也 会 有 一 部 分 甚 至 大 部 分 不 发 生 剪 接(ArrigoandBeemon1988)。 这 是 由 于 其 内 含 子 中 存 在 一 种 负 调节 元 件 使 剪 接 无 效 ， 也 有 的 基 因 在 外 显 子 中 存 在 一 些 促 进 和 抑 制 剪 接的 序 列 。 返 回返 回返 回 U群 snRNA+多 肽 snRNPU群 snRNA是 一 群 丰 富 的 小 分 子 RNA,其 序列 进 化 上 相 对 保 守 ， 但 通 过 转 录 后 碱 基 修 饰会 导 致 其 二 级 结 构 的 改 变 ， 因 而 构 成 不 同 功能 的 snRNP,使 之 识 别 和 竞 争 不 同 的 剪 接 位点 。剪 接 体 /拼 接 体 的 装 配 ：1、 U1 snRNP与 5 剪 接 位 点结 合2、 U2 snRNP与 分 枝 点 结 合3、 U4/U6和 U5snRNP结 合 上4、 最 后 形 成 剪 接 体 ， U5既 与5 剪 接 位 点 也 与 3 剪 接 位 点结 合 。 参 加 剪 接 反 应 的 蛋 白 质 因 子 有 两 种 类 型 ： 一 类 结 合 在 UsnRNA上 形 成 snRNP复 合 物 ， 例 如 Sm蛋 白 ， 共 同 地 与 U1、 U2、 U5 snRNA紧 密 结 合 ； U1 snRNP中 有 3种 而 U5snRNP有 7种 蛋 白 紧 密 地 与 之 特 异 结 合 。 另 外 ， 还 有 一 些 蛋 白 暂 时 地 与 snRNP组 分 相 互作 用 并 起 着 特 殊 的 作 用 ， 它 们 是 一 些 RNA依 赖 的ATPase和 螺 旋 酶 ， 如 酵 母 的 PRP24促 进 U4U6复 合 物 的 形成 ， PRP4通 过 蛋 白 蛋 白 相 互 作 用 结 合 U4U6snRNP和U5snRNP形 成 上 述 的 三 元 snRNP复 合 物 ； PRP8与 U5snRNP结 合 并和 3 剪 接 位 点 相 互 作 用 。 这 些 蛋 白 的 一 部 分 基 序 结 合 到 RNA上 ， 另 一 部 分 结 合 到 蛋 白 质 上 形 成 蛋 白 “ 桥 ” ， 介 导 RNA-RNA相 互 作 用 ， 以 及 剪 接 体 构 象 改 变 ， 通 过 决 定 构 象 改 变 的 计 时来 影 响 剪 接 。 另 一 类 是 一 些 结 构 相 关 进 化 上 保 守 的 蛋 白 质 因 子 ， 称 之 为SR(SRP)家 族 。已 发 现 此 家 族 的 成 员 有 SRP20、 SRP30a、 (SF2 ASF)、SRP30b(PR264 SC35)、 SRP40、 SRP55、 SRP70 75(数 字 表 示分 子 质 量 ， kDa)， 这 些 蛋 白 的 N端 有 一 个 共 同 的 基 序 (RRM或RBD)识 别 和 结 合 RNA； 其 C端 长 度 变 化 ， 由 交 替 的 丝 氨酸 和 精 氨 酸 残 基 组 成 的 结 构 域 可 能 和 结 合 特 异 性 有 关 。这 些 蛋 白 在 剪 接 过 程 早 期 起 着 帮 助 前 mRNA投 入 剪 接 ， 后 期 护 送snRNP加 入 剪 接 体 ， 在 剪 接 的 两 步 反 应 中 一 直 与 剪 接 体 缔 合 。 由 于 这些 蛋 白 因 子 的 表 达 量 是 组 织 特 异 的 ， 而 它 们 存 在 的 量 和 剪 接 位 点 的 选择 又 相 关 ， 因 而 不 同 的 SRP蛋 白 对 不 同 的 剪 接 位 点 的 优 先 利 用 表 现 为 一 种 组 织 特 异 性 。 SRP蛋 白 在 离 体 剪 接 中 都 表 现 出 活 性 的 互 补 ， 但 不同 的 SRP蛋 白 有 其 保 守 性 ， 又 说 明 每 种 SRP蛋 白 应 有 其 不 同 的 功 能 。 3.4.2 反 式 剪 接 (transsplicing) 前 面 讨 论 的 剪 接 过 程 都 是 发 生 在 一 个 RNA分 子 内 部 ，即 通 过 剪 接 将 一 个 RNA分 子 内 的 内 含 子 剪 掉 ， 使 外 显 子连 接 在 一 起 顺 式 剪 接 (cis-splicing) 。 但 也 有 另 外 一 种 情 况 ， 即 不 同 基 因 的 外 显 子 剪 接 后 相互 连 接 ， 此 称 为 反 式 剪 接 （ trans-splicing） 已 发 现 ， 在 锥 虫 、 线 虫 以 及 植 物 的 叶 绿 体 中 发 生 两 个RNA分 子 之 间 的 剪 接 ， 即 反 式 剪 接 。 反 式 剪 接 是 以 两 种 不 同 来 源 的 RNA前 体 分 子 作 为 底物 。 反 式 剪 接 的 5 端 外 显 子 称 为 剪 接 前 导 RNA(spliced leader RNA， SL RNA)。 经 过 剪 接 在 成 熟 的 mRNA非 翻译 部 分 5 端 剪 接 上 一 小 段 称 为 “ 剪 接 前 导 序 列 (spliced leader， SL)”或 “ 小 外 显 子 (mini-exon)”的 RNA片 段 。 这 些 片 段 本 来 并 不 存 在 于 相 应 的 编 码 基 因 前 面 ， 而是 由 其 他 DNA链 转 录 而 来 。 已 发 现 的 各 种 SL RNA有 一些 共 同 的 特 点 ： 都 折 叠 成 一 种 相 同 的 二 级 结 构 ， 此 结 构有 3个 茎 环 (stem-loop)和 一 个 单 链 区 ， 此 单 链 区 类 似于 U1的 Sm结 合 位 点 。 因 此 ， SL RNAs存 在 和 snRNPs相 似 的 形 式 。 4 RNA的 编 辑 和 修 饰4.1 RNA编 辑 （ RNA editing） 某 些 RNA， 特 别 是 mRNA的 一 种 加 工 方 式 ， 它 导 致了 DNA所 编 码 的 遗 传 信 息 的 改 变 ， 因 为 经 过 编 辑 的mRNA序 列 发 生 了 不 同 于 模 板 DNA的 变 化 。 单 碱 基 突 变 尿 苷 酸 的 缺 失 和 添 加 载 脂 蛋 白 B基 因 有 29个 外 显 子第 2153位 密 码 子 CAA 编 码 谷 氨 酰 胺CAA UAA肝 中 剪 切 的 mRNA编 码 4563个氨 基 酸 残 基 的 蛋 白 质 肠 mRNA因 UAA密 码 子 在 2153位密 码 子 终 止 合 成 4.2 RNA修 饰 某 些 RNA， 特 别 是 前 体 rRNA和 tRNA还 可 能 有 异 性化 学 修 饰 。 1. 半 衰 期 短 。 原 核 生 物 中 ， mRNA的 转 录 和 翻 译 是 在同 一 个 细 胞 空 间 里 同 步 进 行 的 ， 蛋 白 质合 成 往 往 在 mRNA刚 开 始 转 录 时 就 被 引发 了 。 也 即 转 录 和 翻 译 相 偶 联 。3.1 原 核 生 物 mRNA的 特 征 2.原 核 细 胞 的 mRNA（ 包 括 病 毒 ） 有 时 可 以编 码 几 个 多 肽 ， 而 真 核 细 胞 的 mRNA最 多只 能 编 码 一 个 多 肽 。 我 们 把 只 编 码 一 个 蛋 白 质 的 mRNA称 为 单 顺反 子 mRNA（ monocistronic mRNA） ，把 编 码 多 个 蛋 白 质 的 mRNA称 为 多 顺 反 子mRNA（ polycistronic mRNA） 。 几 乎 所 有 mRNA都 可 以 被 分 成 3部 分 ：编 码 区 和 位 于 AUG之 前 的 5 端 上 游非 编 码 区 以 及 位 于 终 止 密 码 子 之 后不 翻 译 的 3 端 下 游 非 编 码 区 。5 3AUG UAA mRNA的 次 级 结 构 可 能 控 制 翻 译 的 起 始 一 个 顺 反 子 的 翻 译有 时 完 全 取 决 于 它前 面 顺 反 子 的 翻 译， 因 为 只 有 第 一 个翻 译 起 始 位 点 是 暴露 的 ， 在 这 个 顺 反子 翻 译 产 生 多 肽 的过 程 中 ， 核 糖 体 的运 动 破 坏 了 后 续 顺反 子 的 二 级 结 构 ，使 起 始 位 点 较 容 易与 核 糖 体 相 结 合 形成 起 复 合 物 3. 原 核 生 物 mRNA的 5 端 无 帽 子 结 构 ， 3 端没 有 或 只 有 较 短 的 多 聚 （ A） 结 构 。 原 核 生 物 起 始 密 码 子 AUG上 游 7-12个 核 苷 酸处 有 一 被 称 为 SD序 列 （ Shine Dalgarno sequence） 的 保 守 区 ， 因 为 该 序 列 与 16S-rRNA 3 端 反 向 互 补 ， 所 以 被 认 为 在 核 糖体 -mRNA的 结 合 过 程 中 起 作 用 。 4. 原 核 生 物 常 以 AUG（ 有 时 GUG， 甚 至UUG） 作 为 起 始 密 码 子 ， 而 真 核 生 物 几 乎永 远 以 AUG作 为 起 始 密 码 子 。 3.2 真 核 生 物 mRNA的 特 征 编 码 功 能 蛋 白 的 真 核 基 因 都 通 过 RNA聚 合 酶 II进 行 转 录 ， 几 乎 都 是 单 顺 反 子 ， 其 长 度 在 几 百 到几 千 个 核 苷 酸 之 间 。 一 个 完 整 的 基 因 ， 不 但 包 括 编 码 区 （ coding region） ， 还 包 括 5 和 3 端 长 度 不 等 的 特 异 性序 列 ， 它 们 虽 然 不 编 码 氨 基 酸 ， 却 在 基 因 表 达 的过 程 中 起 着 重 要 作 用 。 “ 基 因 ” 的 分 子 生 物 学 定 义 是 ： 产 生 一条 多 肽 链 或 功 能 RNA所 必 需 的 全 部 核 苷酸 序 列 ！A gene can be defined as following: The entire nucleic acid sequence that is necessary for the synthesis of a functional polypeptide or RNA molecule. 1. 真 核 生 物 mRNA的 5 端 存 在 “ 帽子 ” 结 构 。 真 核 生 物 基 因 转 录 一 般 从嘌 呤 （ 主 要 是 A， 也 可 能 是 G） 起 始 ，其 5 端 大 都 经 过 修 饰 ， 第 一 个 核 苷 酸保 留 了 5 端 的 三 磷 酸 基 团 。 2. 绝 大 多 数 真 核 生 物 mRNA具 有 多 聚(A)尾 巴 。 除 组 蛋 白 基 因 外 ， 真 核