基因组学知识点整理讲解

AC/DS转座Ac/Ds系统是玉米转座子系统之一。Ac是自主控制因子(autonomous element),或称 激活因子，长4563bp，含有一个转座酶基因和一段与转座酶的近末端重复区域邻接的、短 的不完整的反向重复序列。Ac缺失后能形成不同形式的Ds。Ds-a和Ac相似，只缺失了部分 转座酶基因。这点可解释Ds自身不能发生转座的原因。Ds-b的缺失片段较长，仅保留了转 座酶基因的一个小片段。Ds-c仅剩有Ac因子中反向重复序列和与转座酶结合的近末端重复 区域。这些区域和片段都是Ds-c在Ac指导下转座所必须的靶位点。Ac能自主转座，并形成 不稳定的基因突变，但不使染色体断裂，它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds控制结构基 因的表达，有剂量效应，当Ac剂量增加时，相关的遗传效应延迟发生。Ds是非自主因子(nonautonomous element)，又称解离因子，是与Ac属于同一家族的 控制因子，Ds是由Ac因子中间序列的缺失而形成的，从而失去转座酶功能。当Ac因子存 在时，能活化Ds，使其在基因组内转座或插入结构基因之内，导致基因失活或改变结构基 因的表达水平，也可使染色体特定部位断裂，引起缺失或重组。玉米Ds的存在能抑制邻近 基因的表达。Ac-Ds的转座通过非复制型机制发生，且总是转移到邻近的位置，当插入新靶 位点后，原来位置上即失去Ds因子，结果可造成染色体断裂或重排，由此可引起显性基因 丢失，隐性基因表达。(小结)Ac是自主控制因子，Ds是非自主因子，Ac因子能自主转座并形成不稳定的基 因突变，但不使染色体断裂，它能使Ds因子活化、转座，并通过Ds因子控制结构基因表达。 Ac因子中间缺失后能形成不同形式的Ds因子，无转座酶功能。Ac因子能活化Ds因子，使 其在基因组内转座或插入结构基因内导致基因失活或改变基因的表达水平，也可使染色体特 定部位断裂，引起缺失或重组。Ds因子必须由Ac提供转座酶才能转座，Ds因子或多或少缺 失Ac因子中的部分片段。所有的Ds因子要实现转座，必须由一对IR和与其比邻的一段短 的可被Ac转座酶识别的序列。Ac-Ds的转座通过非复制型机制发生，且总是转移到邻近的位 置当插入新靶位点后，原来位置上即失去Ds因子，结果可造成染色体断裂或重排，由此可 引起显性基因丢失，隐性基因表达。非编码RNA(siRNA和miRNA的产生过程、相同点、不同点)小的干涉 RNA (small interfering RNA; siRNA) 和微小 RNA (microRNA； miRNA)是两种 序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分,它们的相关性密切, 既具有相似性，又具有差异性。对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。本 文主要介绍这两种小RNA分子及其作用机理。siRNA介绍RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的 双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。小的干涉RNA(siRNA) 是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA,由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2 个核苷和3个悬臂。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA (mRNA)进行降 解的指导要素。1999年，Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现2125nt的dsRNA 的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。随后，Hammond等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi中的作用，这些小 分子RNA就是由dsRNA形成的siRNAo siRNA的3-末端2-nt的突出对靶点识别的特异性起 一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。两个研究小组以数以千 计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展，科学进展已清晰地表明：在哺乳动物中利 用小的干涉RNA和短发夹RNA (short hairpin RNAs, shRNA)来进行RNA干涉以使基因沉 默已经成为强大而有力的生物工具。例如，在基因操作较困难的神经元中，也有成功进行 RNAi的报道。Krichevsky等将化学合成的21nt siRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培 养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。抑制神经元NO合成酶表达能有 效降低疼痛，在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表 达，获得RNA干扰的成功。RNAi能在极低浓度(nmoL范围)siRNA存在下显示出特殊有效 性。miRNA介绍miRNA的研究起始于时序调控小RNA (stRNAs)。1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫 (Caenorhabditis elegan)中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4, 2002 年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7, 2001年10月science报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的 小RNA基因，称为microRNA。随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种 中鉴别出数百个miRNAso对一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs参与生命过程中一系列 的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)omiRNAs是一种21 25nt长的单链小分子RNA,其结构特征如下：广泛存在于真核生物中， 是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它本身不具有开放阅读框(0RF)；成熟的miRNA，5z 端有一个磷酸基团，3端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体 经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA (双链)但是和siRNA密切相关。成熟的miRNA 5 端的磷酸基团和3端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA独有的 特征是其5端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺 乏U, 一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏Co MiRNAs具有高度的保守性、 时序性和组织特异性。miRNAs的表达方式各不相同。线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个 发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达 模式(a more res tricted spa tial and t emporal expression pattern)只有在特定的时间、组织才会表达。细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，又如拟南芥 中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任 何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6,在成年 果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达,这同时体现了miRNA的又一特点基因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和 细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。在科研上，一个小RNA分子要成为miRNA,需要符合以下条件：a）表达需要用Northern-blot 来证实；b）小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端 才行；c）小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。d）前体RNA分子会在Dicer 功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。这些标准单独一条不足以证明 一个未知小RNA分子是否就是是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a （表达）和 b （结构）两条标准；或者a （表达）和c （保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果 可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c （保守性）；小RNA分子如果不是通过cDNA 克隆的方法得到的，那么就必须符合a （表达）和前体RNA分子结构和保守性的标准才行； 如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c （系统发育保守性）和d （累积性）标准也行； 这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。寻找miRNA的方法：这里我们简单看一下分子信息学的方法：应用计算机的方法如MirScan 来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。2004年6月，吳政道在前 述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。用这种方法筛 选miRNA的原理：该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。miRNA 基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的 基因间区域。一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起Uwe Ohler, Chris Burge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：1）上游和下游 保守序列的数量;2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在oMIT的Bar tel and Chris Burge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法 TatgetScan。他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库DNA转译为蛋白的 生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个 或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。相同点系点siRNAmiRNA长度及特征都约在左右，5端是磷酸基，3T端是羟基合成的底物miRNMn虽RNA合咸都是由双链的RNA或RN应刖体形成的Diceril依Dicer酶的加工，是Die巴i的产物，所以具WDicer 产物的特点Ar g onaut巴家族蛋白都需要Ar吕onaut巴家族蚩白参与RIX组分者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如 二者社介导冗默机用止肴重叠；产生了on targetftof f target的冋题作用方式都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致罰A降解， 即在转录水平后和翻译水平起作用进化关糸可能的两种推论：siRNAgmiRNA的补充，miRNA在进化 过程中替代了“取A不同点/分歧点siENAmiENA机制性质往往是外源引起的，如病毒感染和 人工插A-lsENA之后诱导而产生，属 于异常情况是生物体自身的一套正常的调控机制直接来源长岌夹状pre-m iRNA分子结枸SiENAj?SRNA, 3 端有2个非酉？ 对碱基，通常芮uumi ENA是单槌ENA对靶朗九特异性较高，一个突变容易引起朗転沉默 敷应的改变相对较低，一个突变不尉响m i珂啲敷应作用方式RNAi途径m i RBA途径生物合成，咸熟过程由dsDNADicer酶切割下产生;发生 在细胞质中pn-miENA在核内由一种称为血。訪醸处理后咸为 EOnt的带有茎坏结构的Precursor miENAs (pre-m iENAz)；这些pre-miRNAs在转运到细胞樓外之后 再由DicEi酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNA 即岌生在细胞核和细胞质中Argonaute (AGO)蛋白质各有不同的舫0蛋白质各有不同的舫0蛋白质互补性 complements-ity)一般要求完全互补不完全互补，存在错鄭现象RISC 的分子里不同(M art i ne z an 1 TuEchil,. 2004; M：=Lftinez mt a 1.2002; Nyk：=LTLen mt ：=lL. gl 2001 ； Fh：dJTi Et ：=l1.2004)EiRISCsmiRISCi/miRBT各自的生物学功能不同1抵抗病毒的防御机制(Pfeffer et al., 2004; Ding et al., 2004)5ii沉默那些过分表达的冏幅iii保 护基因组免受转座子的破坏Oello ：=ltli1 Conte Jr. , 2004; H：=ltltloii, 2002; Tab：=q-： et ：al. , 1999)-9；对有机体的生长岌肓有重要作用(Khoades et a1., 2002)重要特性高度特异性高度的保守性、时序性和组组特异性作用机制单槌的mi朗疇合到RISC复合物中， 引导复舍物与mEl殖完全互补，通过 其自身的解施酶话性，解开21E1殖 “通过反义班殖槌识别目的mRNA 片段，通过内切酶曲性切割目的片 段，接着再通过细胞外切酶进一步 眸解目的片段。同时，小屎也可以 阻逼3, UTKM有短片断互补的mRNA 的翻译(off target) o成熟的m 1EN壮则是通过与m i EBP核蛋白体复舍物结 合,识别靶mENA,莽与之发生部分互补，从而阻 谒靶皿曲堆翻译。在动物中，成熟的单miENAs 与蛋白质复合物粗换结合，引导这种复合物通过 部分互补结合到皿朗熾)卯UTR (非编码区域)， 从而阻谒翻译。除此之外，粗Ri殖也可以切割完全 互补的mRNAo加工讨程=i站丸对称地来源于液槌站嘲前体 的两側臂miRNA是不对称加工，miRl殖仅是剪切pre-mxENA 个侧臂，其他部分眸解。对朗尉响眸解目标mRN剋影响皿朗啲稳定性在朗A代谢的各个层面进行调控；与“朗熾)稳定性 无关作用位置siRNApJ作用于mRNA任何部f立miRBA主要作用于靶标基因3 -UTR区生物学意义说A不勒生物生长，是站虹的产 物，原始作用是抑制辑座子旺性和 病毒感染mim要在岌育过程中起作用，调节內源基因表 达RISC介绍RNA 诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex; RISC)的组装是在RNAi 和 miRNA 通路中最为复杂的过程。它涉及到小RNA的生产器(Dicer)；小RNA螺旋结构及相应的RLC 组装；解螺旋后对称/不对称的RNA螺旋结构及对应的特异性的AGO蛋白质的招募活动。刚 产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构，这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发 挥作用。组装后的复合物分别称为siRISC和miRISCo通过对链两端的热力学稳定性分析， 可以将siRNA分为两大类：对称性siRNAs和非对称性siRNAs。对称性siRNAs有着相同稳 定性的末端；从而两条链有着同等结合到RISC中的机会(Schwarz et al., 2003)。与之不 同的是，非对称性siRNAs的一端稳定性会比另外一端差些。因为稳定性较差的一端容易解 螺旋，因此，偏向性地产生一条链结合到RISC复合物上，这个过程我们称之为“RISCs的 非对称性组装(Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003)”。不同的 AGO 蛋白质使 得RISCs有着不同的功能，这可能是由AGO蛋白质上PIWI结构域决定的。根据AGO蛋白质 的不同，我们将RISCs分成两种：切割型RISC和非切割型RISC。但具体到一个RISC是否 切割一个目标mRNA分子，情况就更为复杂些，一般的以下五个方面决定(Tang, 2005): a) 必须是切割型RISC； b)小RNA分子和目标的mRNA的配对情况要达到一定的水平；c)特定 生物/组织/细胞中的RISC的切割速率情况(就是说在不同的细胞中是那种形式占据主导地 位，是切割还是抑制)；d)小RNA分子的来源背景；e) 目标mRNA的特性(数量，更新速 率，结构，翻译能力)。siRNA的生成及作用机制dsRNA引起的RNAi大致可分为3个阶段即启动、剪切、倍增：1、启动阶段研究发现体内dsRNA除外源性导入外，可能来源于病毒激活、转座子活化及特异重复序列 或其他未知途径。研究证实dsRNA在体内通过2123个核苷酸(nt)片段即小干扰RNA (siRNA)发挥其抑制作用RNase III是为数不多的对长dsRNA显示特异性的核酸酶，依据 区域结构可将其分为3个类型，其中第3类以果蝇的CG4792和线虫的K12H4. 8为代表，iniRMAprecursortranslational repression睜m虫H RMA duplexincomptei： paiiringpairing-AAAi iFi lhTi id ITi n11 m ；i i m i 畀i讦门donble-Btrandedrrm! m 1111111 iTnnnmilTri i nnnrnTTnrnninpTTnnnnTpnrp irrmnumnii；FtNAi SilencingComplexmfRNA or eiRIMAmi RN A function二者在RNA干扰过程中可以将dsRNA加工成siRNA,现在称此酶为Dicer酶。人类Dicer酶 是一个接近普通RNase III的蛋白，能够结合并剪切不同的dsRNA。其结构主要包括:N端螺 旋酶区、PAZ区、C端RNase III区(由dsRNA结合区和串联核酸酶III区组成)以及ATP结合 区和DECH盒。另外，在其他诸如小鼠等生物中也发现类似的Dicer酶。Dicer酶在剪切长 dsRNA为siRNA过程中起了关键性作用。在线虫及其他生物中发现了 lin24和let27,这 是2个单链RNA分子，其突变失活可影响发育，被称为stRNA (small temporal RNA)。二 者是特异性蛋白编码基因的负性调节因子，可在翻译水平上调节基因表达。成熟stRNA可与 mRNA的3端非编码区结合而阻遏其翻译，并不引起mRNA降解。2、效应阶段Elbashir等在果蝇体外系统中加入合成2123nt的siRNA，使之能有效降解同源mRNA， 而当siRNA浓度增加到一定阈值时，mRNA降解程度不再继续增加，提示在果蝇裂解液中含 有一定数量RNAi所需蛋白因子。进一步研究得知RNAi所需蛋白因子是一种复合物，被称 为RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex RISC)。RISC是一种核糖核 蛋白，包含有RNA和蛋白成分。其中的RNA就是siRNA，其蛋白成分包括AG022、VIG和 dFXR以及Dmp68等，实验证实这些成分是RISC的一部分且为RNAi所必需。在剪切过程 中siRNA的结构起了重要作用，具有典型结构的siRNA较平末端siRNA更能有效引起RNAi 作用，尤其是3端外悬的第2个核苷酸影响siRNA对靶mRNA的剪切作用。另外，siRNA对靶mRNA剪切具有精确的序列特异性。3、倍增阶段以往实验发现仅需少量siRNA即可引起强烈同源基因表达抑制，因此众多学者推测在RNAi 过程中存在倍增放大机制。有人认为在前述的mRNA剪切过程中产生的2123nt片段可能会 作为新的siRNA而继续参与RNAi过程，从而使干扰作用放大。这种扩增机制只是一种推 测，是否存在尚需进一步的实验研究确定。RNAi的系统性作用也是其引起人们关注的重要 原因，但机制不明。Spankuch Schmitt等在乳腺癌细胞系、子宫颈癌细胞系、结肠癌细胞 系等细胞中成功进行了 RNAi实验，并观察到癌细胞增殖明显减少、凋亡显著增加。 Krichevsky等用合成的siRNA导入有丝分裂后期的原代神经元中，有效抑制了其内源性基 因表达，使应用RNAi技术研究神经发育及功能调控成为可能;不久前Song等在小鼠体内进 行RNAi实验，有效抑制了 Fas21基因表达，从而延长了患自身免疫性肝炎小鼠的生命，为 进行RNAi的动物实验奠定了实验基础。随着RNAi作用机制的进一步明确、应用技术的完 善成熟，RNAi技术必将为人类研究基因功能，以及对癌症等疾病进行基因治疗提供强大武 方器。RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC 中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序 列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一 种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，但这并不是说反义链上所有的 碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置 发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应， 相对而言，3末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。miRNA的生成及作用机制与小分子siRNAs相比，尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的，但也存在不少的 差异。siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生，而成熟miRNAs的产生要复杂一些，首先 pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)(Denli et al., 2004; Gregory et al., 2004; Han et al., 2004； 这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理，酶 切后成为成熟的miRNAs(Lund et al., 2004; Yi et al., 2003)。两者的作用机制上也存 在差别，成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生 部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP 结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3UTR(非编码区域)，从而阻遏翻译。 而在siRNA通路中，单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通 过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶 活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。除此之外，miRNA也可以 切割完全互补的mRNA，而siRNA也可以阻遏3UTR具有短片断互补的mRNA的翻译。一般来说，一种miRNA它在mRNA上的识别位点有多个，而这种多个识别位点对于miRNA发 挥其转录后抑制作用是必要的。3非编码区也是调控翻译的一个重要组成部分。一个转录 本的总体结构由5非编码区(5Untranslated Region，5UTR)，编码区(Open Reading Frame， ORF)和3非编码区(3 Untranslated Region 3UTR)组成。现已了解3UTR具转录本特 异性，它在mRNA转录后修饰、细胞内定位及转运、维持mRNA稳定性及保证翻译的效率方面 都具重要的调控功能。3UTR是发生3末端加工的区域，包含各种顺式(cis-)作用元件，能 够和特定的加工复合物互作以调控mRNA的3末端加工。对哺乳动物的研究表明，真核生物 中3末端加工涉及3UTR内某个位点的剪切和末端添加多聚腺苷酸尾Poly(A+)两个关键 过程。应用缺失实验和序列分析已确认了哺乳动物mRNA的3UTR包含了核心顺式作用元件。 这类元件与加工复合物的相互作用是3末端形成的核心机制，包括三部分：Poly(A+)位点， 也可称为剪切位点(cleavage site, CS)，保守序列为YA (Y代表T或C)的二聚核苷酸， 这种保守序列的单碱基比例为A T C G； Poly(A+)位点上游(5端)10-30 nt处 存在着保守的Poly(A+)定位信号序列(以AATAAA为主)。Poly(A+)位点下游(3端)存在 着稳定3末端加工复合物作用的保守性稍差的T/GT丰富序列，称为下游作用元件。miRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种:第一种以线虫lin-4 为代表，作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种 miRNA是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互 补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA，这说明某些miRNA和siRNA 一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上两种 作用模式，当与靶标基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，如果蝇和Hela细胞中let-7 直接介导RISC分裂切割靶mRNA；当与靶标基因不完全互补结合时，起调节基因基因表达的 作用，如线虫中的let-7与靶mRNA3端非翻译区不完全配对结合后，阻遏调节基因的翻译。对于miRNAs的研究已经成为目前的一大热点，而种种迹象表明miRNAs可能是一类与肿瘤发 生有关的新的基因。像miRNA-15a和miRNA-16a与CLL有关，miRNA-142则与侵袭性的B细 胞性白血病有关。研究发现，一些miRNAs能够在肿瘤形成中发挥作用，可以作为肿瘤抑制 基因；另外一些miRNAs则是作为癌基因存在。植物miRNA从2002年起才有报道，编码植物 miRNAs的基因明显不同于其他生物:植物编码miRNA基因的转录产物可能更大,植物的miRNA 与互补结构的错配一般也少于动物，在进化上表现地更为保守。但和动物miRNA 一样，miRNA 的转录产物也是发夹状结构，在RNaselll酶切割后以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA 成熟。科学家们已发现miRNA在动植物早期发育中起的关键调节作用，包括植物叶、花的发 生，动物胚胎及组织发育等。例如，在carpel factory (car)突变株中3个miRNAs的表达 水平显著下降。CARPEL FACTORY是一个类似Dicer的酶，参与植物的发育，其缺失突变株 表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。 多数的植物miRNAs在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育过 程。Brennecke等人利用电脑寻找靶标基因，证实了 miRNA不完全结合3UTR中存在细胞死 亡诱导基因，这提示说明miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。尽管现在研究者们对于miRNAs的认识越来越深刻，仍然有很多的猜想需要证实，比如对miRNAs的潜在的生物学 效应的猜测；miRNAs在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要; miRNAs可能代表一个新层次上的基因表达调控模式，等等。所以说，大多数miRNAs的功能 仍然是个谜，有待于研究者们更深入的研究。siRNA和miRNA的相同点和不同点相同点：1、二者的长度都约在22nt左右；2、二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点；3、二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在；4、二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；5、miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前提形成。不同点：1、根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA是人工体外合成的，通过 转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2、结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3、Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的 一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。4、在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3 -UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任 何部位。5、在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水 平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。6、miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi 的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。基因陷阱(Gene Trap)1 .基因陷阱的原理目前已发展了三种不同的陷阱系统增强子陷阱，启动子陷阱和基因陷阱。它们之间最大的不同体现在报道基因重组体的组成和插入位置上。基因陷阱是这三种方法的统称。1.1增强子陷阱(enhancer t rap)将某报道基因与一个精巧的启动子相连，组成一增强子陷阱重组体(见图1B)，它不会自主起始转录，而需由被插入的细胞基因组中的增强子帮助才 可转录。若报道基因最终表达，则可推知插入位点附近有增强子，或有基因，即实现了以该增强 子陷阱重组体发现增强子的目的。1 . 2启动子陷阱(p ro moter t rap)通过将报道基因插入到细胞基因组的外显子上(见图C)，一旦发现它与细胞基因组基因被共同转录或表达则可知该报道基因附近有启动子, 从而起到了以之为诱饵,发现启动子的目的,这就是启动子陷阱。1 . 3基因陷阱(gene t rap)基因陷阱重组体由报道基因和接受体剪接部位(splice acceptor , SA)组成(接受体剪接部位在报道基因上游)，该重组体需要插入到细胞基因组的内 含子中随着基因转录和表达(见图1D)，故如能检测到融合转录物或融合蛋白,则证明插入位 置附近有基因存在2 。启动子陷阱和基因陷阱都有位置限制，前者需插入到外显子，后者则需插入到内含子，增 强子陷阱却没有此位置限制;由于增强子与基因的位置可近可远，故增强子陷阱不易定位基因; 此外，对启动子陷阱和基因陷阱而言，插入可能导致基因失活。下面以带SA的基因陷阱(即第 三种基因陷阱)的一个成功例子具体阐明这一系统的工作原理。1998年Tate等以0 2半乳糖 苷酶2新霉素磷酸转移酶为报道基因，和上游的接受体剪接部位SA构成重组体，只有以正确 的方向整合到内含子的表达基因才有可能被剪接成基因转录物或表达为融合蛋白，利用此基 因陷阱“钓”出了一小批新的染色体蛋白和核蛋白3 。2. 基因陷阱的特点基因陷阱的优势在于它只在表达水平上定位基因，细胞基因本身的转录和表达不受影响，所以 可检测功能上多余的基因,也可检测在基因表达多个水平上都有作用的基因，或低水平表达的 重要基因，而以前的功能基因组学的方法对这些基因都是无法确定的。基因陷阱的不足主要表现在以下几个方面：(1)表达基因的确定较困难且耗时长如何克隆和筛选融合转录物或融合蛋白是一件 很费时费力的事。通常根据所插入的报道基因的DNA序列为引物，用PCR技术获取两侧序列, 再与ES T数据库比较和确定基因功能。最近出现一些很好的解决方法，如在RACE的微透析和 固相测序中采用自动化和荧光测序，可缩短时间;或只测一小段DNA序列即与ES T数据库已有 序列进行比较，若已有人研究过,则不用继续,若从没研究过，则应得到目的基因全长并分析其 功能。突变的细胞的表型不明显主要原因是被捕获的基因不一定有很明显的表达方式, 以及突变的ES细胞克隆不一定有明显的表型。目前的解决方法是进行体外预先筛选我们需 要的融合基因株系。(3) 报道基因表型可能会丧失若报道基因没按预期加以整合，或报道基因被剪接时整 个被切除,都可能使报道基因表型丧失而无从着手。(4) 目前使用的基因陷阱系统对细胞的伤害大 毕竟基因陷阱是插入了一段外源DNA , 所以是一种剧烈的方法,会有致死效应(美国加州大学Berkeley分校的实验室的细胞或胚胎致 死频率是1/ 3) 4 o在一些情况下应采用柔和一些的方法，如进行重组体的置换而不是插入 用点突变,选择性地采用表型突变5 o3. 基因陷阱的应用基因陷阱的应用主要集中在医疗和制药上，而目前小鼠是探讨人类生理过程最好的模型, 因此许多应用性的工作都以小鼠作为研究对象。一般在小鼠中不使用增强子陷阱，其基因组 很大但基因频率很低，故很难定位增强子;报道基因一般是lac2Z，它的上游有一个或多个受体 剪接部位,由逆转录病毒引入全能胚胎干细胞再移入小鼠种系中。1988年就已有人在小鼠细 胞中使用基因陷阱6 。最近美国国立卫生院(N IH)的科研人员报道以小鼠为材料，利用H IV21 慢病毒来研究哺乳动物的细胞分化和发现新的基因,而慢病毒作为基因陷阱载体，是因为他们 可随机插入动物细胞的基因组并可长期表达7 。法国和日本的科学家利用乙肝病毒(HBV) 的DNA帮助基因陷阱的插入整合,来确定未知的肝癌相关基因。这说明可通过研究病毒基因 的整合位点来确定人类疾病相关基因，同时证明这些由HBV构成的基因陷阱附近的基因对细 胞增殖和生长有重要调控作用8。近些年来许多著名的大学和研究所已建立自己的基因陷 阱实验室，如英国牛津大学，美国冷泉港实验室等。此外，许多生物制药公司和研究团体都看好 基因陷阱在生物医疗和制药方面的DNA分子标记可对特定淋巴细胞的发生及迁移进行跟踪, 从而为人们进一步探索淋巴细胞的成熟、归巢等提供了良好的研究平台。4 .展望尽管目前斑马鱼作为免疫学模式生物还只是刚刚起步，但由于其具有发育生物学研究方 法成熟、进化地位特殊、遗传突变筛选简便等特点，在未来的研究，特别是免疫系统的发生、 发育及特异性免疫系统进化起源等研究领域中必将发挥日趋重要的作用。平衡化cDNA文库平衡化CDNA文库三种平衡化理论（PDF里的英文翻译） 饱和杂交到基因组DNA基因频率在DNA水平上是相等的基于关联动力学罕见的物种二次动力学cDNA的再次退火将退火较慢寡核苷酸指纹基于一系列短的寡聚核苷酸探针对于高密度序列的单个的cDNA克隆经特定杂交缠身特 征型的cDNA序列即为指纹2.5-2 标准lEcDNA文痒构建擁准比cDNA文库那构建一个在某“粹定组织或细胞申製达的备个越因均含有 等璽H）NA的文库.故又称为尊星化flONA文库舛罰缈I rDNA libnuy）邃交摩主要有 弓个优点：增佣克隆按低丰度巾耿止的可能，尤苴甚那些经过减数杂交和邈擇杂交仍 难以克隆的转录本等竄牝的屈隔可作探针来岌现基因组序列中的轶录区尤其是 普vDNA探什难以发现的稀有转录区“与原始丰度閉mRWA拷頭数牺对应的cDNA 攧彗与标准楚血附文暉做杀交、町悄计出丸爭数基因的丧迭水平喪发现一些组织特异 性基因。赫來化文库的构建方法通常足根据eDA退火的_级动力学特紙，即桶荷猾贝的 ci?報比丰竄挎风的冋刑A复性或杂奁更饅的権性建立起来的口目前已痢涝种片法，T 面简单介紹绅方迭乜1用給片段、取链cDNAfife的方法以带接头的曲蹲腭人沟引物*（1胁A沟頼板舍成忒刑九cf）NA产物用超声剪切馬 分离20G400bp的冷段在背段的另-搗抑上引W. PCR扩曙出相应的小片段。将这琏 取链曲M作短肘间变臥 复性.分离出耒复性的单離片段，再用孔靈萨堪成取糙用段. 经过儿轮上述等化循环，等化的双链产物用相应的接头克隆由于于端非載译区的特异 性.这种主要包括3端短片段的cDNA等量化丈厚莊曲计堆因的表迖水平和发现组织特 畀性基因庁面优于抵片段艄帑化cDNA文库，同吋避免了同線基囲迄间的减数杂査。盒裙环状单糠进賢猱交的方谖先拘建一卜定向兗龜于噬菌体的dWA.文障.用超感架怯使之评敢单链环挨质戦， 单植郭化辰在过ft 3端引物和嗣NI?菲用下迸行广址且限牆性的延种，使之舍成药0呦 左右的互补片穀。分离这甦片段、使之在较低畑殖卜逬冇变性和复性。未霾性的堪链 部芬可直馥转化细窗使文席樹建过探中省去了亚克隆的歩髒，風时世保证子文库中 （:制“的鮭度。分子标记显性和共显性问题有关分子标记共显性分子标记中，显性和共显性，指allele而言，即指所扩增的PCR产物（DNA片断）。象RAPD、ISSR等显性标记，PCR产物无法确切确定，因而无法区分杂合体（heterozygosity）， 只能按有带无带进行分析，记录为0/1;而SSR等共显性标记，则能区分杂合体，即二倍体 及多倍体染色体DNA上的不同变异都能显现出来，而且不仅可采用0/1记录也可按扩增产 物的长度（bp）进行记录和分析，是一种能区分杂合体的共显性标记，即如果同源染色体上 相同的locus上，存在插入、缺失等变异，即便是单个碱基对上的差异也能同时显示并加以 分辨。所以，共显性标记，在揭示遗传多样性方面要比显性标记具有更大的优势。更为重要 的是,SSR引物是以外显子保守序列为引物结合点，即以已知DNA序列为基础所开发的引物， 在基因组上具有特定的位置，所以在QTL等分析上，应用极为广泛。共显性：说白了就是可以分辨出纯和的跟杂合的这 个 有 图 示 比 较 好 理 解首先,RAPD是随机引物，（可以理解只有正向引物，没有反向引物。）因此，它扩增出来的为 引物结合位点到终点的长度。当然一条练上会有很多该引物结合位点，也就出现了很多片段。 对于一个特定位点，我们可以理解只有一条正练可被扩增。因此，在该练上只有两种情况, 有和没有。对于SSR，有一对（正向引物和反向引物）。对于一个特定位点，两条练都可被扩增，因此.T - D N导入植物基因组的分子机理农杆菌介导的T - DNA的转移和整合是细菌与植物细胞相互作用发生生物学效应的过程兼 具原核生物中的细菌接合转移及真核细胞加工修饰的特点。其整个过程大致包括：（1）农杆菌 对受体的识别与附着；农杆菌对特异的植物信号分子的感应;vi rG介导的信号传导及 毒性基因的活化;毒性蛋白作用产生T - DNA单链;毒性蛋白转移复合体的形成及T - DNA 和毒性蛋白进入宿主胞质;成熟T - DNA复合体的形成;T -DNA复合体在植物及细菌作 用下被摄入细胞核；(8) T - DNA整合进入植物基因组。2 . 1农杆菌对受体的识别与附着单个农杆菌以极性方式通过细胞表面的乙酰化酸性荚膜多糖介导附着在植物细胞表面(此过 程称为接触)9 ,受伤的植物组织分泌一系列的酚类、糖类、氨基酸类等趋化性物质10 吸 引农杆菌向受伤组织集中。据研究，植物细胞表面的农杆菌附着位点是有限的,根癌农杆菌和 发根农杆菌的附着位点不同，每个植物细胞可以同时附着多种不同的农杆菌菌株但只能被1 个或少数几个菌株所转化。且只有在创伤部位生存了 816 h之后的菌株才能诱发肿瘤11 , 这段时间称为细胞调节期。在调节期内，农杆菌会产生大量纤维素和一些糖类化合物将自身 束缚在植物细胞壁表面并将细胞包裹形成一个囊状结构(此过程称为成囊12 )。在农杆菌 识别及附着过程中,有许多基因和蛋白质的参与。在农杆菌体内有一些染色体基因是农杆菌 植物互作所必需的,称为染色体毒性基因(Chro moso mal virulence ,chv)。已发现10个这样 的基因，它们是 chvA,chvB, pscA (ex oC) , chvD, chv E, chv G, chv I,acv以及 at t R 和 cel。在农杆 菌附着过程中，其染色体上的at t R, ch rA, chvB, pscA和cel等基因所编码的蛋白质可能参与 此过程13,14。其中att R基因与大肠杆菌的一些膜蛋白或A TP结合蛋白基因具有同源性, 但其产物尚不清楚。at t R只与细菌的附着有关，并不参与T - DNA的转移。chvA和chvB缺 失时，细菌将不能合成1.2 -环葡聚糖，表明其编码是与1.2 -环葡聚糖合成有关的蛋白质，并 推测1.2 -环葡聚糖可能是农杆菌附着到植物细胞所必需的o chvB定位在细胞质膜上。chvA 和chvB与at t R不同，其缺失会影响细胞遗传物质的转移chvA和chvB缺失突变体无论用 共培养还是真空渗入法都不能转化拟南芥15。pscA基因可能编码磷酸葡糖异构酶,与胞外 多糖合成有关。ChvD蛋白含有保守A TP/ GTP结合的区域，其功能尚不清楚。Chv G、chv I蛋 白可能对农杆菌在植物伤口组织酸性环境下的存活有关。ceL是与纤维素合成有关的基因, 可能参与附着过程中细菌表面的成囊过程。2.2农杆菌对特异的植物信号分子的感应 最近的研究资料证实，额外的植物细胞表面分子可能对农杆菌的结合起重要作用。例如，对2 种拟南芥生态型B1 - 1和Petergof，以及2个WS生态型的T - DNA插入突变型rat1和 rat3(Resistant to Agrobacterium t ransformatio n 的研究表明:农杆菌不能结合到它的根外植体上16 ,17 。虽然在B1 -1和Petergof中影响农杆菌结合的基因 还不得而知，但rat1和rat3突变已经知道是它们分别影响了一种为arabinogalactan的蛋白(A GP)和一种细胞壁蛋白。然而，虽然rat1和rat2、B1 - T和Petergof对农杆菌感染属难以转化 物种(recalcit rantspecies),但它们的雌配子仍然保持可转化性18 。这一结果表明，农杆菌不 同植物组织的附着与植物细胞表面不同蛋白有关。植物渗出物对农杆菌毒性基因的转录激活 及农杆菌的附着是必需的。特别是从植物伤口渗出的单糖及小的酚类化合物可被农杆菌的“双组分”(two2co mpo nent)信号传导系统所识别。象乙酰丁香酮Acetosyringo ne ,As)、a -羟基乙酰丁香酮等酚类化合物与植物中合成次生代谢产物(如木质素、黄酮类物质等)的苯 丙烷途径的产物非常类似。这些酚类小分子化合物被称为信号分子，能够诱导Ti质粒上的毒 性基因(v i r)的表达。2.3 v i r G介导的信号传导及v i r区基因的表达(v i r基因活化)v i r区基因在接受植物细胞产生的创伤信号分子后,首先是virA编码一种结合在膜上的化学 受体蛋白(virA)。按照细胞感受刺激并对此作出反应的“双组分系统”学说,virA可能是一 种整合在膜上的传感蛋白。virA直接与植物渗出物相互作用19 o当酚类物质(如AS)与感应 位点结合后，会使整个virA蛋白构想发生变化，其C端活化。C端有激酶的功能,使蛋白质上的 组氨酸残基发生自磷酸化作用，从而激活virA蛋白。被激活的virA蛋白可以转移其磷酸基因 至vir G蛋白。作为一种转录调控因子活化v i r启动子启动v i r基因表达。因此,vir G在此 过程中起反应调节器的作用。chv E可大大增强v i r基因被AS诱导的效果,其产物chv E可结 合一些单糖，也可直接与v i rA的周质区相互作用,以加强AS对vir基因的诱导。除此之外,v i r G蛋白也可能参与此过程。一种诱导v i r基因表达的酚类化合物阿魏酸（Ferulic acid）对vir H2 突变体的作用比野生型更有效，利用质谱等方法发现野生型菌株的上清液中含有大量阿魏酸 的去甲基化合物咖啡酸（Caffeic acid）。因而vir H2蛋白可能起到负调控作用20 。2.4 毒性蛋白作用产生T - DNA单链（T - DNA加工）v i rC、v i rD和v i rD2参与T - DNA单链的形成。v i rD1和v i rD2是v i rD基因编码的2个 产物,它们相互作用并具有单链或特异位点核酸内切酶功能。virD1蛋白是一种拓扑异构酶, 可将超螺旋DNA转变成松驰型DNA，并起到辅助virD2作用。virD1识别并结合到Ti质粒- 25bp正向重复序列（T - DNA边界）上促进virD2的酶解作用。体外纯化的重组virD2可单独 起作用切割单链的T -DNA，但无论在体内还是体外切割双链的T -DNA必须virD1和virD2共 同作用。virD2直接参与T - DNA的形成和加工，起内切酶作用，在T -DNA右边界处切开，随后 virD2通过Tyr29与切断的T - DNA 5末端共价连接，避免核酸外切酶降解T -链。此过程需 DNA解旋酸参与，virD2- T -DNA释放需复制酶作用，以未切断的顶链为模板，从右向左复制合 成新的T - DNA。当复制到左边时,T - DNA释放21 。在Ti质粒的T - DNA区留下的底链空 缺随后被细菌的DNA合成酶及其相关机制进行修复Ti质粒复原。释放的T - DNA在virD2 连接下形成单链的DNA/蛋白质复合体未成熟的T -复合体（Immat ure T - co mplex）。virD2C -末端保证切割反应的准确性和有效性，而virD2整体可能作为引导子引导T - DNA链从 细菌转移到植物细胞。virC（章鱼碱Ti质粒含virC1和virC2）蛋白结合到T- DNA右边界的驱 动子序列上，促进virD2的酶解剪切作用，提高转移效率。2.5毒性蛋白转移复合体的形成及T - DNA和毒性蛋白进入宿主细胞质（T- DNA转移） vir E作为一种DNA结合蛋白,与单链T -DNA有很高的亲合力,能与任何单链DNA序列结合。 vir E2突变体的致病性显著降低，由乙酰丁香酮诱导的农杆菌细胞中vir E2蛋白大量积累 22 ,因而vir E2在T - DNA转移过程中可能起着重要作用。有观点认为T - DNA链形成后使 全身被vir E2蛋白包裹形成一种半刚性中空圆柱形的丝状螺旋结构的T-复合体23 。T -复 合体这种结构有利于保护T- DNA链免受细胞中核酸酶的降解24 ，并促进其进入宿主细胞核中。vir E能够防止核酸外切酶降解T -链，而且vir E2的C -末端含有 2个核定位信号（Nuclear - localizatio n Signal ,NL S）可以协助T -复合物到植物细胞核的运输。但T链形成后的转运形式目前还不清楚,vir E2的结合及作用位点也还存在争议。T - DNA的 转移及vir E2的结合可能发生在细菌细胞中25 ,也可能发生在宿主细胞质中，即T - DNA转 移与vir E2的转移，是2个相对独立的过程,vir E2可能是在T - DNA转化过程中由细菌产生后 不与T - DNA链结合形成复合体，而是单独地转运至植物细胞内发生作用25 ,26 。vir E2还 可能与另外一种毒性蛋白vir E1结合成复合体形式转移到宿主细胞中。vir E1是一种特异的 陪伴蛋白（分子伴侣）,它可以帮助vir E2以合适的形态运输到植物细胞。vir E1能防止vir E2 与T - DNA链结合27 ,当复合体转移到细胞质后,vir E2和vir E1才分离开。2.6成熟T -复 合物的形成及其核输入当T - DNA进入植物细胞质成为成熟的T -复合物后,细菌致病蛋白vir E2和virD2与植物蛋白相互作用，将T - DNA复合物转运至细胞核virD2和vir E2在T-复合 物和输入中的作用可以通过以下的实验得到证实。随带缺少核定位信号（NL S）的virD2突变体 的农杆菌株,其肿瘤发生和T - DNA的表达受到抑制。此外，也可被体外组装的vir E2-SSDNA复 合物（而不仅仅是ssDNA）注入到活的植物细胞28 的这种核输出所证实29 ,30 。在