革兰氏染色与荚膜染色

革兰氏染色与荚膜染色 1、掌握革兰氏染色法和细菌荚膜染色法。 2、观察菌体的一些简单结构。 二、实验原理 一、目的与要求： （一）革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是 1884年由丹麦病理学家 C.Gram创立的。作 为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将 所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（ G+）和革兰氏阴性菌（ G） 两大类。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽 聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂 质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物 易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经 脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因 此细菌仍保留初染时的颜色。 （二）荚膜染色法原理 荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状 物质。 由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且 可溶于水，易在用水冲洗时被除去。 所以通常用衬托染色法 (负染色法 )染色，使菌体 和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形 成一透明圈。 由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以 加热固定，避免加热蒸发，影响观察。 三、实验器材 1、菌种：枯草杆菌（ Bacillus subtilis）， 大肠杆菌（ Escherichia coli）， 未知菌（环境中分离）（斜面培养物） 褐球固氮菌（ Azotobacter chroococcus）装片。 2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、 卢戈氏 碘液、 95% 乙醇、番红、二甲苯、香柏油 3、器材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、 擦镜纸、废液缸 四、革兰氏染色法实验步骤 流程路线： 涂片 干燥 固定 草酸铵结晶 紫染色 1min水洗干燥 碘液媒染 1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 1520秒 水洗干燥 番红复染 1min 水洗干燥 镜检 (1)涂片 干燥 固定 : 2 1 （ 2）草酸铵结晶紫染色 1min 水洗干燥 （ 3） 碘液媒染 1min 水洗 干燥 （ 4） 95%乙醇脱色 1520秒 水洗 干燥 （ 5）番红复染 1min 水洗 干燥 镜检 五、注意事项： （ 1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不 易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 （ 2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。 如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间 不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。 （ 3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应 为准。 （ 4）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后， 应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响 染色效果。 （ 5）选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体 死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 荚膜示意图： 荚膜染色步骤： 1、 总路线：涂片 用 1%结晶紫染色 3分 钟 用 20%CuSO4冲洗 镜检 2、涂片： 3、结晶紫染色： 4、 CuSO4冲洗： 注意事项： （ 1）不能加热固定，否则荚膜受热失水收缩，失 去原形。 （ 2）涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏 其荚膜原形 . (3)要用 CuSO4冲洗，不要用水。 第 4组值日 荚膜示意图： 革兰氏染色步骤 涂片 干燥 固定 草酸铵结晶紫染色 1min水洗干燥 碘液媒染 1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 1520秒 水洗干燥 番红复染 1min 水洗干燥 镜检 荚膜染色步骤：涂片 用 1%结晶紫染色 3分钟 用 20%CuSO4冲洗 镜检 1、细胞壁 实验报告 给出 枯草杆菌，大肠杆菌，未知菌 形态图，并 注明其革兰氏染色反应。 绘图示褐球固氮菌的形态特征 思考题 1.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最 关键的环节是什么？ 2.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老， 用老龄细菌染色会出现什么问题 ? 3.革兰氏染色时，初染前能加碘液吗 ?乙醇脱色后复 染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是 什么颜色 ? 4.不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰 氏阴性菌？