上海市临床科研基本实验技能培训

上海市临床科研基本实验技能培训 哺乳动物细胞培养：基础交流 Meeting date: 2009/12/18 Speechmaker Youzhi Huang（ Ph D） E-mail: serviceresearch- : 上海锐赛生物技术有限公司 Shanghai R&S Biotechnology Co., Ltd. High technology and service Eyeing for Integrated Solution R&S, your reliable cooperator! 目录 一 细胞培养基本概念 二 细胞培养基本要求 三 细胞培养基本技术 四 锐赛细胞相关技术服务 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 一、细胞培养基本概念 细胞培养定义 细胞培养 简史 生长类型 细胞形态 传代次数 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养定义 定义： 模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。 优点： 1活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、 免疫组织化学、原位杂交、同位素标记； 4应用广： 不同物种、不同年龄、不同组织、正常或异常（肿瘤）； 缺点： 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同； 当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了， 必然发生变化。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养简史 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞类型 按生长方式 : 贴壁型细胞 （ Monolayer cells） 悬浮型细胞 （ Suspension cells） 绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞 ， 只有少数细胞类型 如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长 。 按细胞形态 (贴壁细胞 ） ： 成纤维型细胞 （ Fibroblast-liked cells） 上皮型细胞 （ Epithelium-liked cells） 其它 ， 不定型 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 成纤维型细胞 梭形或不规则三 角形 中央有卵圆形核 胞质向外伸出长 短不同的突起 中胚层间质起源 上皮型细胞 扁平不规则多角形 细胞中央有圆形核 紧密相连单层膜样 生长 内、外胚层细胞如 皮肤、表皮衍生物、 消化管上皮等 游走型细胞 散在生长，一般 不连成片 细胞质经常伸出 伪足或突起 活跃的游走或变 形运动 羊水细胞培养的 早期 多形细胞型 难以确定规 律和稳定的 形态 如神经组织 的细胞等 细胞形态 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 接触抑制 （ Contact inhibition） 细胞相互接触时，将停 止增长； 细胞停留在细胞周期的 G0期； 转化的细胞却可以继续 生长导致细胞重叠堆积 生长。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一 定的界限， 称为“ Hayflick极限”。 传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命 3年，传代 12次； 龟寿命 200年，传代 140次。 传代次数与个体年龄成反比：人胚胎， 40-60代； 幼 年， 20-40代；成年， 10-30代；早老病儿童， 2-10代。 细胞传代次数 （ Passage Number） High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 原代培养 （ primary culture） 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般 10代以 内）停止生长。 克隆 （ clone） 亦称无 性繁殖系或无性 系。对细胞来说， 克隆是指由同一 个祖先细胞通过 有丝分裂产生的 遗传性状一致的 细胞群。 细胞系 （ cell line） 从肿瘤组织 培养建立的 细胞群或培 养过程中发 生突变或转 化的细胞， 在培养条件 下可无限繁 殖 细胞株 （ cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖 50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。 原代培养与细胞系 The American Type Culture Collection (ATCC) The European Collection of Animal Cell Culture (ECACC) National Institute of Health (NIH), USA National Cancer Institute (NCI), USA 细胞系资源 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 二、细胞培养基本要求 常用仪器设备 培养器皿 培养基 血清 其他细胞培养试剂 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 常用仪器设备 超净台或生物安全柜： 细胞操作 CO2 培养箱： 细胞培养 液氮罐： 细胞长期冻存 37 水浴： 培养溶液预热，细胞复苏 倒置显微镜： 观察细胞 离心机： 收集细胞，细胞常用 300g转速 5min 冰箱： 细胞培养溶液分装储存 负压吸引器： 细胞培养废液吸取 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 超净台或生物安全柜 垂直风超净台 水平风超净台 生物安全柜 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! Culture flask Culture Plate 培养器皿 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞培养基 干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭 菌，其优点是价格便宜。缺点是配 制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规 模化生产，不仅质量得到保证，而 且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、 DMEM-高糖 （标准型）、 DMEM-低糖（标准型）、 McCoys 5A、 M199、 F12等 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 培养基的选择 没有一定的标准，有几点建议可供参考 ： 1. 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的 培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2. 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合 多种细胞。 3. 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生 长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳 培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 血清使用注意事项 1. 血清必须贮存于 20 -70 ，若存放于 4 ，请勿超过一个月。如果一次无法用 完一瓶，可将 40 45 ml 分装于无菌 50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加 约 10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 血清解冻步骤 (逐步解冻法 ): -20 或 70 至 4 冰箱溶解一天，至室温下全溶后 再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀 (小心勿造成气泡 )，使温度与成分均一，减 少沉淀的发生。勿直接由 20 直接至 37 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白 质凝结而发生沉淀。 3. 热灭活（ heat-inactivation）是指 56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。此热处 理之目的是使血清中之补体成份 (complement) 去活化。除非必须，一般不建议作 此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。 4. 勿将血清置于 37 太久，若在 37 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较 不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 凝絮物： 发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白 (lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白 (fibrin) 造成， 这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀 物，可用离心 3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养 基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻 塞过滤膜。 显微镜下观察之“小黑点”： 通常经过热处理之血清，沉淀物的形 成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常 会误认为血清遭受污染，而将血清放在 37 中欲培养此“微生物“， 但在 37 环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖， 但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应 不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换 另一批号的血清。 血清沉淀物 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 谷氨酰胺 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添 加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解， 4 下放置 7天 即可分解约 50%，所以都是在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在 4 放置 2周以上时，要重新 加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加 入培养液内 使用终浓度为 1-4mM 一般配制为 100倍浓缩液，即浓度为 200mM（ 29.22g/L） 配制方法为 ： 谷氨酰胺 2.922g溶于三蒸水加至 100ml即配成 200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温 30 ），过滤除菌，分 装小瓶， -20 保存，使用时可向 100ml培养液中加入 0.5-2ml谷 氨酰胺浓缩液，终浓度为 1-4mM High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 酚红 大多数培养液中使用酚红作为 pH 指示 红色表示中性 pH 黄色代表酸性 pH 紫色表示碱性 pH 在一些特殊培养液中不含酚红 因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激 素（尤其是雌激素）样作用 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞消化液 分离组织和分散细胞 常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠 (EDTA)两种溶液，单独或混 合使用 胰蛋白酶溶液 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用 EDTA 4Na 溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低 廉，使用方便 常用工作液浓度为 0.02%。 注意： 使用 EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的 EDTA 会影响细胞生长 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 三、细胞培养基本技术 细胞原代培养 细胞换液与传代 细胞冻存与复苏 细胞计数与活力 细胞污染与控制 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 鼠胎组织细胞原代培养 取材： 用 颈椎脱位法 使 孕鼠 迅速死亡。把 整个孕鼠 浸入盛有 75乙 醇 的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入 超净台 。用消过 毒的剪刀 在躯干中部环行剪开 皮肤，剖腹取出 子宫 置于无菌平皿中。 用消过毒的剪刀 剪开子宫， 取出 鼠胎， 剪去 头、爪， 以 平衡盐溶液 洗去血污 切割： 用 平衡盐溶液 将取出的 组织块 清洗三次，然后用眼科手术剪 刀仔细将 组织反复剪碎 ，直到成 1mm3左右的小块 ，再用 平衡盐溶液 清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管 底，弃去上清 消化、接种培养： 加入 0.25胰蛋白酶消化液 （ 5-10倍量 ），与组 织块混匀。置 37 水浴，观察消化情况 （每隔几分钟摇动一下试 管），静止，吸去上清，加入 5 10ml细胞培养液 ，用吸管吹打混 匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 换液： 全量换液和半量换液 换液时机的选择 ： 培养液 pH值：细胞生长旺盛，代谢产 生酸性物质积累增多， pH值下降，营 养液酸化变黄，。 细胞状态 细胞换液 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞传代 原代细胞传代以便获得稳定的细胞株 细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续 接触抑制 营养枯竭 将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以 1:2或 l:3以上的 比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与 细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增 3 6次 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞冻存 冷冻保存要点 冷冻过程要缓慢： 4 30 60 分钟 -20 30 分钟 -80 16 18 小时（或过夜） 液氮长期保存 或使用程序降温盒，每秒下降 1 冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于 90，无微 生物污染。 细胞浓度控制在： 5x106 2x107/ml。 常用细胞冷冻保存液 5%或 10 DMSO完全培养液 10甘油完全培养液 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞复苏 快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入 37 水浴中，轻轻摇 动冷冻管，使其在 1 分钟内全部融化（不要超过 3 分钟） 解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中 直接进行培养， 24 小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液， 以去除 DMSO 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种 到含完全生长培养液的培养瓶中 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞计数及活力 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞污染 细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细菌污染 细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌 等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊， pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落 死亡。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 真菌污染 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及 毒性作用而使细胞脱落死亡。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细菌和真菌的清除 使用抗生素 抗生素对杀灭细菌较有效。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量 5 10倍药物冲洗 法，于加药后作用 24 48小时，再换常规培养液。此 法在污染早期有效。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 95 以上是以下四种支原体： 口腔支原体 （ M.orale） 精氨酸支原体 （ M.arginini） 猪鼻支原体 （ M.hyorhinis） 牛莱氏无胆甾原体 （ A.laidlawii） 危害： 世界性问题 ， 平均发生率达到 11% 能改变细胞的 DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小 ， 不易引起注意污染 来源： 操作环境不良 操作人员的疏失 实验器具不洁等 已受污染的细胞 已受污染的培养基 、 血清 支原体污染 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 荧光染色法 电镜检查 ： 扫描电镜 、 透射电镜 支原体培养 聚合酶链反 应 (PCR)法 支原体污染检测 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞营养液常常 仍清亮但 变黄 ,细胞生长变缓 ， 部分细胞发 生脱落等等 ，细胞间隙可见铺满细沙样小点 。 支原体污染表现 荧光染料 Hoechst33258染色法检测支原体 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 支原体的清除 支原体清除剂 MRA （ Mycoplasma Removal Agent）处理法 每 4天换一次液，连续处理 15天 清洗纯化法 细胞营养驯化 优质细胞群的筛选 细胞清洗 反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通 过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限 . 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 药物辅助高温处理法 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在 41 培养 18小时，可杀 死支原体，但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法 用 5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原 体生长，故经抗血清处理后 11天即转为阴性，并且 5个月后仍为阴性。 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 四、锐赛细胞相关技术服务 上海锐赛生物公司简介 锐赛细胞相关技术服务 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 上海锐赛生物简介 上海锐赛专注于向国内生命科学研究、医学临床科研应用 及生物医学产业研发提供最新技术咨询、全方位现代实验 技术服务。 锐赛公司前身是一个生命科学研究交流团队，团队组建于 2003年，是非盈利的学术交流平台，技术团队建有基因操 作、基因组分析、细胞、病毒包装、 RNAi等多个成熟的实 验平台，团队人员操作经验丰富，硕士学历以上占 85%。 公司愿景：立足于深厚的分子、细胞生物学背景和扎实的 科研实验技术服务基础，立命于终身为祖国的科研工作者 提供一流的研究产品和全方位实验技术服务，并孜孜不倦 地打造出我们自己研发生产的、比国际一流品牌产品还过 硬的科研产品民族品牌！ High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 锐赛细胞相关技术服务 细胞转染 瞬时转染 稳定转染细胞株的构建 流式细胞检测 细胞周期 细胞凋亡 细胞表面抗原（ CD系列） 肿瘤细胞生物学检测 细胞活力测定 肿瘤细胞基质黏附实验 肿瘤细胞侵袭实验 病毒包装 腺病毒包装 慢病毒包装 逆转录病毒包装 RNA干扰 siRNA干扰评价 慢病毒 RNAi干扰 腺病毒 RNAi干扰 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 细胞转染 瞬时转染 特点： 技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（ FuGene）、电穿孔仪等 根据客户的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化 应用： 观察目的基因表达蛋白在细胞中的功能（短期效应） 稳定转染细胞株构建 特点 ： 技术平台：阳离子脂质体、阳离子聚合物（ FuGene）、电穿孔仪、腺病毒、 慢病毒、逆转录病毒等 根据客户选择的靶细胞系选择最高效的转染方法并进行转染条件的优化 可选用高效的病毒转导方法建立稳定表达的细胞株 应用抗生素筛选出稳定表达细胞株 应用： 观察目的基因表达蛋白在某种细胞中的功能（稳定，可长期研究） High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 流式细胞检测 特点： 技术平台： FACSCalibur7500 单细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析 特定细胞群体的分选 精度和灵敏度高，重复性好 应用： 细胞周期 细胞凋亡 细胞表面抗原： CD 系列 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 肿瘤细胞生物学检测 细胞活性测定 特点 ： 技术平台： CCK-8法 CCK-8法具有操作快速、准确度高、灵敏度高、经济实用和对细胞无毒性等优点。 应用： 生物活性因子的活性检测、大规模药物筛选、细胞增殖、细胞毒性、药敏实验等。 肿瘤细胞基质黏附实验 特点： 技术平台： Transwell法结合 CCK-8法 应用 ： 检测肿瘤细胞的基质黏附能力 肿瘤细胞侵袭实验 特点： 技术平台： Transwell法 应用： 检测肿瘤细胞的侵袭能力 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 病毒包装系统 腺病毒系统 为复制缺陷型，生物安全性高 感染宿主细胞范围广，可应用于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞转导效 率高 不整合到宿主细胞基因组，无插入致突变性 可有效进行增殖，病毒滴度高 慢病毒系统 为第 4代自身灭活复制缺陷型，生物安全性高 可整合到受感染细胞的基因组，从而长期稳定表达外源目的蛋白 感染宿主细胞范围广，可应用于难转染的细胞，如原代或非分裂细胞，转导 效率高 逆转录病毒系统 可以整合从而长期稳定表达 感染宿主细胞范围较广，可应用于难转染的细胞，如原代细胞，转导效率高 免疫原性低 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! RNA干扰 特点： 为靶基因设计，构建一组 miRNA干扰载体 采用 Pol II 强启动子 CMV，表达水平更高，干扰效果更强 可表达出与目的基因 100%同源的人工化的 miRNAs，对靶基因进行 切割； 70%的 knockdown效率 绿色荧光蛋白（ GFP）和感兴趣的 miRNA可协同表达，方便追踪 miRNA的表达 针对客户靶细胞系，进行转染条件优化，确保转染效率 对难于转染的细胞系，可选用腺病毒或慢病毒转导的方法，确保 干扰效果 针对某靶基因的 4条 miRNA序列，在转染效率 80%的前提下，我们 保证至少有 2个克隆可以达到至少 70%转录水平的 knockdown 可制备稳定沉默特定基因的细胞株 High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! High technology and service, Eyeing for Integrated Solution, R&S, your reliable cooperator! 谢 谢！ TlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r %v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZ q$u*x+A2D5H8KbN fQiUlX o#s%v(y0B3F6I9LdO gRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8K cNfRiU lXp#s%v)y0B3F6IaL dOgSjVmYq!t*w- z1D4G7JbMeQhT kWoZr $u(x+ B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A 1D4G8JbMeQ hTlWoZr%u( x+B2E6H9Kc OfRiUmXp!s&v) z0C3F7IaMdPgSkV nYq$t*x- A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7I aMdPhSkVnZ q$t*x- A2D5G 8KbNe QiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D 5H8KbNfQiTlXo#s% v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7Ja MePhTkWnZr$u*x+A 2E5H8KcNfQ iUlXp#s%v)y0B3F6I aLdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhT kWoZr$u(x+A2E5H9KcN fRiUlX p#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w- A1D4G 8JbMe QhTlW oZr%u( x+B2E 6H9Kc OfRiUmXp#s&v) z0C3F7IaL dPgSkV nYq$t*w- A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOf RjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZ q$t*x- A1D5G 8KbNe QiTlW o#r%v(y+B3E 6H9Lc OgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5H8K bNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZ r$u*x+ A2D5H 8KcNf QiUlX o#s%v)y0B3F6I9LdO gSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhT kWoZr$u( x+A2E 5H8Kc NfRiUlXp#s% v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w- z1D4G8JbMeQhT kWoZr %u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7I aLdPgSjVnYq$t*w- A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOf RjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZ q$t*x- A1D5G 8KbNe QiTlW o#r%v(y+B3E 6H9Lc OfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8K bNfQiT lXo#r %v(y0B3E6I9L cOgRjVmYp!t&w)z1C4G7Ja MePhSkWnZq$u*x+ A2D5H 8KfRjUmYp!s&w)z0C4F7Ja MdPhSkVnZq$u*x-A 2D5G8KbNfQiTlXo#r %v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZ q$u*x+ A2D5H8KbN fQiUlX o#s%v(y0B3F6I9LdO gRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8K cNfQiU lXp#s%v)y0B3F6IaL dOgSjVmYq!t*w- z1D4G7JbMeQhTkWoZ r$u(x+ B2E5H 9KcNf RiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A 1D4G8JbMeQ hTlWoZr%u( x+B2E6H9Kc OfRiUmXp!s&v) z0C3F7IaMdPgSkV nYq$t*x-A1D 5G8JbN eQiTlWo#r% u(y+B3E6H9L cOfRjUmXp!s&w)z0C4F7Ia MdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8K bNeQiTlXo#r %v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMeP hSkWnZ q$u*x- A2D5H 8KbNf QiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdO gRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhT kW nZr$u*x+A2E 5H8Kc NfQiU lXp#s%v)y0B3F6IaL dOgSjVmYq!t&w- z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+ A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZ r%u(x+B2E5H9KcOf RiUmXp#s&v) z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w -A1D5G8JbNe QhTlWo#r%u(y+B2E6H9Lc OfRjUmXp!s&w)z0C4F7Ia MdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8K bNeQiTlWo#r %v(y+B3E6H 9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdP hSkWnZq$u*x -A2D5H8KbN fQiTlX o#s%v(y0B3E6I9Lc OgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePho#r%v(y+B3E6H 9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x - A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZ r$u*x+ A2D5H 8KcNf QiUlX o#s%v)y0B3F6I9LdO gSjVmYq!t&w-z1C4G 7JbMePhT kW nZr$u( x+A2E 5H8Kc NfRiUlXp#s% v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w- z1D4G8JbMeQhT kWoZr% u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A 1D4G8JbNeQhTlWoZ r%u(y+B2E6H9KcO fRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x -A1D5G8JbNe QiTlW o#r%u(y+B3E 6H9Lc OfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x- A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7Ja MePhSkWnZq$u*x+ A2D5H 8KbNf QiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G 7JbMePhT kW nZr$u*x+A2E 5H8Kc NfQiUlXp#s% v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w- z1D 4G7JbMeQhT kWoZr $u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq!t*w-A 1D4G8JbMeQ hTlWoZr%u(x+B2E6H9KcO fRiUmXp!s&v) z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*x -A1D5G8JbN eQiTlW o#r%u(y+B2E6H9Lc OfRjUmXp!s&w)z0C4F7Ia MdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8K bNeQiT lXs&v) z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w - A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9LcOf RjUmXp!s&w)z0C4F7IaMdPhSkVnZ q$t*x- A2D5G 8KbNe QiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcO gRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkW nZq$u*x-A2D 5H8KbNfQiTlXo#s% v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7Ja MePhT kWnZr $u*x+A 2D5H8KcNf QiUlXo#s%v)y0B3F6I 9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G 7JbMePhT kW oZr$u(x+A2E5H9Kc NfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w- z1D4G 8JbMe QhT kW oZr%u(x+B2E5H9K cOfRiUmXp#s&v) z0C3F7IaL dPgSkVnYq$t*w- A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOf RjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZ q$t*x- A1D5G 8KbNe QiTlW o#r%v(y+B3E 6H9Lc OgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8K bNfQiT lXo#r %v(y0B3E6I9L cOgRjVmYp!t&w)z1C4G7Ja MePhSkWnZr $u*x+ A2D5H 8KcNf QiUlXo#s%v)y0B3F6I 9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G 7JbMePhT kW nZr$u( x+A2E 5H8Kc NfRiUlXp#s% 1C4G7JaMePhSkWnZ r$u*x+ A2D5H8KbNf QiUlX o#s%v(y0B3F6I9LdO gRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhT kWnZr$u( x+A2E 5H8Kc NfRiUlXp#s% v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w- z1D4G7JbMeQhTkWoZ r$u(x+ B2E5H 9KcNf RiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w- A1D4G 8JbNeQ hTlWoZr%u(y+B2E6H9Kc OfRiUmXp!s&v) z0C3F7IaMdPgSkV nYq$t*x-A1D 5G8JbN eQiTlWo#r% u(y+B3E6H9L cOfRjUmYp!s&w)z0C4F7Ja MdPhSkVnZq$t*x-A2D5G8K bNeQiTlXo#r %v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMeP hSkWnZ q$u*x+ A2D5H8KbN fQiUlX o#s%v(y0B3F6I9LdO gRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8K cNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaL dOgSjVmYq!t*w- z1D4G7JbMeQhTkWoZ r$u(x+ A2E5H 9KcNf RiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A 1D4G8JbMeQ hTlWoZr%u(x+B2E6H9KcO fRiUmXp!s&v) z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8NfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZ r%u(x+B2E6H9KcOf RiUmXp#s&v) z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w -A1D5G8JbN eQhTlWo#r%u(y+B2E6H9L cOfRjUmXp!s&w)z0C4F7Ia MdPhSkVnZq$t*x-A1D5G8K bNeQiTlWo#r %v(y+B3E6H 9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x - A2D5H8KbNfQiTlXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZ r$u*x+ A2D5H 8KcNf QiUlX o#s%v)y0B3F6I9LdO gSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhT kW oZr$u( x+A2E 5H8Kc NfRiUlXp#s% v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w- z1D4G8JbMeQhT kWoZr %u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7I aLdPgSkVnYq$t*w-A 1D4G8JbNeQ hTlWoZr%u(y+B2E6H9Kc OfRjUmXp!s&v)z08JbMeQhT kWoZ r%u(x+ B2E5H 9KcOf RiUmXp#s&v)y0C3F7IaLdPgSj