DNA与蛋白质技术课件

高 频 考 点 1.蛋白质的提取和分离。2.PCR技术的基本操作和应用。实 验 要 求 1.蛋白质提取的原理和方法。2.PCR技术的操作及原理。第六章蛋白质和DNA技术 1方法及原理(1)方法：电泳法。(2)原理：各种蛋白质分子带电性质的差异；分子本身大小、形状的不同。2实验操作程序(1)点样：用微量加样器取新制血清，小心加到电泳样品槽的胶面上。(2)电泳：打开并调节稳压稳流电泳仪进行电泳。(3)染色：用质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液对凝胶进行染色。(4)脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液脱色。(5)制干胶板：保存液浸泡凝胶板后，放在两层透气玻璃纸中间自然干燥。特别提醒：相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，移动速度快，因此蛋白质分子彼此分离。1.下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图)和洗脱(图)示意图，请据图回答下列问题。(1)在加样示意图中，正确的加样顺序是_。(2)用吸管加样时，应注意正确操作，分别是_、_、_。(3)等样品_时，才加入缓冲液。(4)待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液每_mL收集一管，连续收集。解析：进行凝胶色谱操作加样时，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使核内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不可破坏凝胶面。吸管应贴着管壁加样，待样品完全进入凝胶层后才可关闭下端出口，加入缓冲液，待红色蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每次5 mL收集一管，连续收集。答案：(1)(2)不要触及破坏凝胶面贴着管壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动(3)完全进入凝胶层(4)红色的蛋白质5 1细胞内DNA复制与PCR技术的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制95高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶引物RNA人工合成的DNA单链温度体内温和条件高温 2.PCR技术反应过程中控制不同温度的意义(1)95变性，双链DNA解旋为单链；(2)55复性，引物与两条单链DNA结合；(3)72延伸，耐高温的DNA聚合酶有最大活性，使DNA新链由5端向3端延伸。2.多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历30多次下述循环：95条件下使模板DNA变性、解链55条件下复性(引物与DNA模板链结合)72条件下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述，不正确的是()A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也 可利用解旋酶实现B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对 原则完成的C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、4种核糖核苷酸DPCR与细胞内DNA复制相比，其所需要酶的最适温度较 高解析：PCR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。DNA变性(9095)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。复性(5560)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。延伸(7075)：在Taq酶(在72左右活性最高)的作用下，以dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷酸的缩写)为原料，从引物的5端向3端延伸，合成与模板链互补的DNA链。答案：C【例1】(2009广东高考)(1)商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生_，可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间的_表示。(2)利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：中的主要成分为_；中包含植酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植 酸 酶 的 方 法 及 其 依 据。_。(3)为构建基因工程菌，可用PCR等技术从上述菌株中克隆植酸酶基因。PCR反应包括多 次 循 环。每 次 循 环 包 括 三 步：_。反应过程中打开模板DNA双链的方法是_。(4)除植酸酶外，微生物还能应用在哪些酶的生产中？(至少写两种)_错答案例：（1）透明圈 植酸钠的生成量（2）杂质 电游法 根据蛋白质之间的电荷分子大小差异进行（3）变异恢复延长加热(4)纤维素酶 蛋白酶误点诊断：本题综合考查酶的应用及PCR技术等相关的基础知识，题目背景较新，但答案很基础，由于学生答题不够仔细，基本技术的名称掌握不牢固，基本技术的流程把握不准确导致出错，对于选修内容应重点落实基础知识，规范用语，正确思路为：(1)当植酸钙被植酸酶分解以后，会在平板上出现透明圈。植酸酶活性高低可以单位时间内底物减少量来表示。(2)透析的目的是将酶与发酵液分开。分离不同种类的蛋白质可以用凝胶色谱法，原理是根据相对分子质量大小。(3)PCR技术包括三步：变性复性延伸，变性反应的原理是采用加热处理。(4)微生物产生酶的种类很多。例如蛋白酶、脂肪酶等。正答示范：(1)透明圈植酸钠的消耗量(减少量)或磷酸(肌醇)的生成量(产量)(2)小分子杂质凝胶色谱法：根据蛋白质之间的分子大小、吸附性质等差异进行纯化(或电泳法：根据蛋白质之间的电荷、分子大小等差异进行纯化)(3)变性、复性和延伸(长)加热(或高温处理)(4)蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶【例2】近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开_键，称为_，细胞中是在_的作用下使此键断裂的。(2)当温度降低时，引物与模板_端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是_，遵循的原则是_。(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的_和_。(4)如图为某一次循环的产物，请据图回答问题。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为_、_、_三个步骤。DNA的羟基(OH)末端称为_，图中所示的羟基端为_(填字母)。PCR技术与细胞内DNA复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用_酶使双链间氢键断裂，而PCR技术利用_原理使双链间氢键断裂。以引物为标记，可判断出此产物最早为第_次循环的产物。思路点拨：本题考查体内DNA复制与PCR技术的原理以及基本条件。(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为解旋，而细胞中是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的3端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。(3)PCR技术与体内DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲液环境)、每一步骤需要适宜的温度及酸碱度。(4)PCR的每一轮循环包括高温变性、低温复性和中温延伸三步，从第二轮循环开始，每次循环的产物也作为模板参与反应。DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(OH)末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3端延伸DNA链。因此DNA复制需要引物，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。由另一条新合成的DNA可知，A端为3端，B端为5端，D端为3端。DNA分子在细胞内复制或转录时，在解旋酶的作用下使氢键断裂，而在体外，DNA分子是在80100的温度范围内变性，即双螺旋解开，成为单链；当温度慢慢降低后，两条彼此分离的单链又会重新结合形成双链。在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会出现DNA分子两端均含引物的情况，如图所示：因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。答案：(1)氢解旋解旋酶(2)3四种脱氧核苷酸碱基互补配对原则(3)温度酸碱度(4)高温变性低温复性中温延伸3端A、D解旋热变性一【互动探究】(1)用于PCR的引物一般长度为2030个核苷酸，它的化学本质是什么？(2)PCR反应中，如果以引物为标记，共有几种DNA分子产生？提示：(1)引物的作用是与模板链结合，提供3末端，使DNA聚合酶能够催化子链的延伸，在生物体内DNA复制时，引物一般为一小段RNA，但在PCR反应中，可以是一小段DNA或RNA。(2)共有3种。点击此处进入点击此处进入 随堂双基演练随堂双基演练