胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量

胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量胶原蛋白的提取、结构以及分子量测量综述一、前言胶原蛋白（collagen）是与各组织、器官机能有关的功能性蛋白，约占人体总蛋 白的三分1 之一,存在于细胞外间质，是具有三股螺旋结构的蛋白质家族。胶原是人体 重要的细胞外基质成分,在细胞生物学中有重要应用价值。胶原是一个大的蛋白家 族，至少有15个型别，各2 型胶原都具有一定的分子构型和组织分布特点，其中以?型胶原分布最广，胶原蛋白（或称胶原）是按是否形成有周期性横纹的胶原原纤维（collagenous fibril）可将其分为原纤维胶原蛋白（fibrillar or fibril-forming collagen）和 非原纤维收原蛋白（no nfibrillar or non,fibril,forming collagen）两大类。目 前己发现的胶原蛋白类型己不下19种，原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、XI 型胶原，在体内以胶原纤维的形式存在。胶原纤维是骨骼、肌腱、骨间膜、皮肤、 软骨、韧带等器官的基本结构物质，使这些器官具有很高的抗张强度。胶原纤维与 组织器官的生物力学特性密切相夫原纤维胶原蛋白包括I、II、III、V、和XI型 胶原，其余均属于非原纤维胶原蛋白。非原纤维胶原蛋白具有胶原蛋白的基本特 征，即三股螺旋结构，但其结构、分布和功能更具有多样性、非原纤维胶原蛋白按 其,27超分了结构可进一步分类。（l）结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白（fibril associatedcollagens with interrupted triple helice FACIT）包括 IX XII XIV XVI X XI型胶原。（2）形成网状结构的胶原蛋白包括IV VIII X型胶原。（3）形成串珠 状纤维（beaded filament）的胶原蛋白有VI型胶原。（4）形成固着原纤维 （anchoring fibril）的胶原蛋白，有VII型胶原。（5）有跨膜区的胶原蛋白，有 XIII和XVII型胶原。（6）结构尚未明确的胶原蛋白包括XV和XVIII型胶原等。胶原不仅作为组织的支持物，而且对细胞、组织乃至器官行使正常功能及伤口 愈合都有重大影响。胶原作为医用生物材料比以往应用的金属、陶瓷或化学材料具 有更大的优越性，因此近20年来已被广泛用于临床（近年来，世界各国已将胶原制 品广泛应用于临床修复软组织缺损，覆盖烧伤创面、整形、牙周引导组织再生、口 腔种植体、牙槽嵴再建及颌骨空腔修复。二、胶原蛋白的提取胶原多从牛皮、肌腱、鼠尾等部位提取，由于胶原是一个大的蛋白家族，是细 胞外间质的四大组分之一，几乎分布于所有的组织中。到目前为止已发现脊椎动物 的胶原类型达十多种之多，各型作用不一。胶原的异常改变涉及许多纤维化疾病， 在肿瘤的发生与转移中，胶原的分布和类型也发生改受。因此在提取时常将各型分 别提取。目前从组织提取胶原多采用分级盐析的方法，在酸性条件下，I型和Ill 型胶原沉淀的盐浓度临界点相近;在中性条件下，III型和IV型胶原沉淀的盐浓度 临界点又很接近。因此提取时难度较大，程序复杂，需过柱纯化，而且花费时间 长，易发生胶原变性。主要的提取方法分述如下:I型和II型胶原主要分布于细胞，组织之间及结缔组织间质中，属于间质胶 原，在脏器纤维化病理过程中，I型和II型胶原起着重要作用。I型胶原是结缔 组织间质中最主要的成分，一般制品多以I型胶原为材料（文献上I型胶原的提取 一般采用多次超速高心的办法。3 李成章、樊明文从人胚骨中提取了 I型胶原，用于胶原制品的制作。采用 胚胎骨组织来提取胶原（一般认为骨组织仅含有I型胶原，选用骨组织作为提取原 料可省去分型、过柱纯化等烦杂工序，简便经济，易获得纯度较高的I型胶原（他们的方法为将脱钙骨粉浸入0.5mol/LHAc24,48h,取上清缓慢加入研磨精细的NaCl（终浓度为4mol/L），搅拌过夜离1心35 OOOXg, 20min（下同），去上清，其沉淀物加入0.5 mol/L HAc透析溶解，离心，取上清依次加入0.lmol/LTris,HCI （终浓度为0.01mol/L）, 5mol/LNaOH（调pH至7.4），NaCl（终浓度为4mol/L），搅拌过夜，离心，去上清（沉 淀以 4 mol/L NaCI（0.05 mol,L Tris,HCI 洗一次，再加 0.5mol/LHAC 透析溶解， 离心去沉淀，上清装入透析袋内，对NaCl溶府透析（平衡后NaCl浓度为10,）离心 去上清，沉淀物用0.5mol,LHAC透析去盐溶解，离心去沉淀，上清浓缩冻干以上所 有液体及操作温度均为4?。为提高抽提纯度，骨粉应越细越好，脱钙必须完全（采 用EDTA脱钙，可使一些非胶原蛋白，如骨连接蛋白4 （osteonectin）随之溶去，有利于提高胶原的纯度（抽提的次数不应太少， 否则纯度不够，抽提次数太多则易发生胶原变性（他们所用抽提次数为3,4次，结 果表明，所提胶原具有较高纯度，可用于胶原制品的制作。5 首都医科大学宣武医院普外实验室 的孙海晨、李铎、刘爽、孙家邦对以往 的I型胶原蛋白的提取作了一些改进，只进行了2次超速离心减少了步骤。一般文 献中在I型胶原的-1提取过程中要不断使用不同浓度的NaCI,0.05mol?LTris-HCI缓冲液反复进 行离心、抽提。他们实验将其改为在3,醋酸的酸性条件下，直接加入40mL30,浓 盐水，不仅减少了步骤还节省了试剂和时间。他们的方法为:取鼠尾浸入75,酒精 消毒30min移入PBS液中洗2次，去皮、抽取鼠尾腱，放入PBS液中洗2次，高 速组织粉碎机粉碎后放入3,醋酸（每尾200 mL），48h，1.2万克离心2h。吸取上 清加入30,浓盐水40 mL盐析。离心4 000g，30min。将沉淀溶入50mL0.1,醋酸 内，置透析袋内与500 mL1mol,L的HCI透析48h，其间换水5次。这样可得到透 明清亮的胶原溶液。加入0.15mL氯仿，敞开瓶口，用无菌纱布包住，置无菌工作 台48h使氯仿挥发。取5 mL溶液经SEXTRYTM冷冻干燥机冷冻干燥，6 定量胶原浓度为3.5g/L。王凯慧、李雅杰等从猪囊尾蚴中提取胶原蛋白，用紫外分光仪、SDS,PAGE、透射电镜和ELISA等方法对猪囊尾蚴胶原蛋白作了初步 分析。表明：(D猪囊尾拗中含有一定量的胶原蛋白；(2)胶原蛋白主要以I型为主， 分子量在80kDa,130kDa之间；(3)通过酶联免疫吸附实验，检测其抗原性，证明其 对人具有很强的免疫性。7 刘德莉、徐蓉等从鸡趾肌腱中提取了 I型和II型胶原。方法为:在9mL细 胞培养液中，加入ImL蛋白酶抑制剂(0.1mol/LTris,HCI、pH7.4、0.4mol/L NaCl、0.25mol/LEDTA、20mmol/L PMSF 及 10mmoL/LNEM)0.33mL 乙酸溶液 (0.5mol/L)及胃蛋白酶溶液(10g/L),混匀后，于4?温和搅拌6h在4?离心(16 000 r/min)30min。留上清液，缓慢加入410mg氯化钠粉末，边搅拌边混匀溶解，于4? 冰箱盐析过夜。第2天取出，高速低温离心(l6 000 r/min)30min，取沉淀物，冷 冻干燥2h，即为培养液中的胶原提取物。将组织标本称重后，以PBS洗净，剪碎 至lmm大小，置10mL0.5mol/L乙酸溶液膨胀过夜。4?匀浆(l0 000r/min)5 min， 加入胃蛋白酶(酶量与湿组织之mg比为1:100)，于4,冷室搅拌消化6h,加TriS 至pH7.4中止酶解，再4?离心(16000 r/min)45min。取上清液，精确称取氯化钠 (0.7mol/L，于10mL上情液中加入410mg氯化钠)，在冰浴中，于上清液中边缓慢 搅拌边加入氯化钠至彻底溶解，置4?冰箱盐析过夜，再4?离心(16 000r,min)45min。取沉淀物，冷冻干燥2h，即为组织中的胶原。8 王新禾、张月娥等以限制性胃蛋白酶消化和分步盐析法从人胎盘中提取高 纯I、III型胶原分别免疫家兔，经兔疫吸咐制备单一特异的抗人I、III型胶原抗 血清。他们的方法为取胎盘去除脐带和羊膜、捣碎、匀浆；限制性胃蛋白酶消化， 4?20h(每20g湿重组织加入0.05%胃蛋白酶、0.5 mol/L醋酸100ml);消化上清液（酸性）中加NaCl至l.Omol/L，沉淀为胶原混合物:随后在中性条件下分别以 1.5mol/L、2.5mol/LNaCl盐析，反复数次分别得到I、III型胶原的初纯品；用 DE,52 柱层析去除酸性大分予，得到纯化的 I、III 型胶原。II 型胶原是关节软骨中主要细胞外间质之一，多种风湿性疾病的发生与 II 型 胶原异常有关。现己知类风湿关节炎发病与II型胶原自身免疫反应有关，用II型 胶原免疫某些动物2可诱导出多关节炎，然而口服II型胶原可通过诱导免疫耐受来治疗类风湿关 节炎。梅焕平、9 张源潮、李华研究了 II型胶原的微量提取和纯化方法。O.OQ1M醋赧透析2天”毎天更换透析液，蒸 懈水透析1天r$聚乙二阳6000侬耶克窣干燥3X .ttWllffi胶员 平均箫2 .5克艾节软骨可疚11型胶原】0叫）兔关节透明软骨洗 Sifi.lOXTB#毎克软骨加 lOrnl 4M 盐KM/Q.OSMTrts pEU.5.TC下搅拌24小时,12000牛3分钟用工沉淀加均倍体积讯酣酸胃蛋白薦pH2,5 “ 3 （盒胃蛊厂I 朝 lOmp/lOOnjJ 海 JS 钠 20n/ IflOml）,搅It 24小时同Y 100005分钟卫工上清液（況淀部分重复傅蛋白稠酶解抽捉 次）0.2M氯比钠/D.OSM7為HO |上透析透折内液按誓克软骨比I克已处理的DEAE 纤维素比例混合1小时!200%30分神山乜上清液加氨基已酸*便其锻度达0_ 1址 工4氮化钠粗析24小时上弋I 5000030分钟4贮 上淸液加氮化衲使浓度达44M愉器24小时*4覽 l20（X抽分邯,4*沉淀物用蒸谱水溶斛方法见上表。研究采用限制性胃蛋白酶降解法，去除部分伸直端尾肽，螺旋结 构不受影响，故仍保持II型胶原分了完整性，抗原性基本不受影响。微量提取法 主要有如下技术改进：(1)使用合适浓度的氨基己酸可有效地抑制胶原酶活性，减少 胶原蛋白破坏，提高II型胶原收率；(2)在中性条件下只用2.4M氯化钠盐析去除I 型胶原蛋白，再用4.0M氯化钠沉淀II型胶原，沉淀物经透析后使需干燥溶液体积 减少80,，使低温真空干燥容旯完成，又减少了 II型胶原丢失。10 秦定一、单英等参照Byers等方法并略作改良分别从家兔和胎儿2种不同 皮肤中提纯11 2 了 III型前胶原肽。方法为:所有操作均在4?进行，将皮肤切成约lmm大小碎片，置于 pH7.4，150 mmol,L Tris,HCI20mmol/LEDTA、10mmol,L PHCH2S02F、10mmol/L PMB 溶液中匀浆，在 4?下提取 48h。2 000 r,min 离心 lOmin，上清中加入。W (硫酸铵)=20%。离心15 000r/min 20min，用上述提取液 重溶沉淀，加 W(NaCl)=10,， 30000r/min 离心 20min。用 pH7.6，200mmol/LNaCl、 50mmol/L Tris-HCI 溶液溶解沉淀即为 III 型胶原(Collagen Type III， C III) 和III型前胶原(Procollagen Type III，PC III)粗提物。将上粗提物充分透析后 上 DEAE-32 纤维素柱层析，用 pH7.5, 2mol/L 脲、20mmol/LNaCl、30mmol/LTris- HCI溶液平衡。洗脱，以去除酸性糖蛋白。为分离CIII与PCIII,再次经DEAE-32纤 维素柱层析，用 pH7.0, 2mol/L 脲，0.02mol/L NaCl、0.05mol/LTris,HCI 溶液平 衡、洗脱，待穿过峰结束，用0.02,0.2mol/L NaCl梯度洗脱，分别收集CIII与 PCIII。将 PCIII 溶于 pH7.4，0.2mol/LNaCl、0.05mol/L Tris-HCl、 0.005mol/LCaC12、2.5mmol/L PMB溶液加入细菌胶原酶，37作用4h,置冰水终止 酶反应。酶消化产物在PH8.5, 0.2mol/L碳酸氢胺溶液中透析平衡。再经 SephadexG,50凝胶过滤，分批加上酶消化产物进行洗脱，收集第一峰，超滤浓缩，置pH8.6, 2 mol/L脲、0.05mol/LTris-HCl缓冲液中透析。过DEAE-52纤维素柱 层析用0,0.35mmol/LNaCl梯度洗脱，收集主峰即为PIIIP。12 柴明胜、陈金国、叶仲贤、朱炳钗用人胎盘经胃蛋白酶消化,氯化钠分级 盐析沉淀后，进一步经过DEAE-52和CM-52柱层析纯化提取IV型胶原。他们的方 法为取人胎盘2只,剥离泡膜和结缔组织后剪碎,分别用蒸馏水和含蛋白酶抑制剂 0.05mol/L,pH7.2Tris-HCI缓冲液漂洗使胎盘组织由红变白后制成匀浆。再用该缓冲液在4?洗提4h，离 心后沉淀加入0（5mol,L醋酸溶解，边搅拌边加入胃蛋白酶，在6?提取24h。离心 收集上清液，逐渐加入氯化钠，使其浓度为1. 2mol , L ，然后搅拌过夜。沉淀用 0.lmol,L 醋酸溶解后，用 0.05mol,L Tris-HCI，PH7.4，0.2mol,L 氯化钠透析过 夜（去除沉淀后逐渐加入氯化钠使其浓度为2mol,L（所获沉淀即为IV.C粗品。将粗 品溶于 0.05mol,LTris-HCI, PH8.6,2mol,L 脲素，0.2mol/L 氯化钠缓冲液中，并 用相同的缓冲液在4?透析24h后，用DEAE-52层析。收集穿过峰再用0.04mol,L 醋酸钠，PH4.8, 2mol,L脲素透析后用CM-52柱层析，经0,0.3mol,L氯化钠梯度 洗提，第一峰即为IV.C纯品，透析除盐、冻干于20保存。氨基酸分析表明甘氨酸 含量占30, ，羟脯氨醚占13, ，两个链的分予量分别在 95 000和 70 000，与 Timpl报道相似，符合IV（C特征。13 姚敏捷、寇丽筠等人从胎盘中提取IV型胶原蛋白。方法为取正常分娩的 胎盘，冰水冲去血液，置-20?冰箱冰冻2,3h后剪成小块，制备匀浆。相继用中性 盐提取液、0.5 mol/L HAc 分别抽提数次去除杂蛋白和血红蛋白，至组织呈乳白色; 胃蛋白酶消化，沉淀出I、III型胶原后的上清中含有IV型胶原;加NaCl至 4.5mol/L，再以1000Xg离心lh弃上清，沉淀溶于0.lmol/LHAc中，再加NaCl至 1.2mol/L，离心弃上清;沉淀加于0.5mol/L HAc，并进行透析，1000Xg离心lh， 上清含IV型胶原粗提物。将此粗提物在起始缓冲液（0.04mol/L醋酸钠pH4.82mol/L Urea）中充分透析，加至平衡好的CM,52纤维素层析柱上，线性梯度洗脱 （NaCl浓度从0.04,0.4mol/L），于230nm监测至吸光值回到基线。收集的蛋白分别 是IV型胶原。用0.001 mol/L醋酸分别透析（48h）（以上操作均在4进行）。冷凉 干4燥后-50?冰箱保存。14 V型胶原（ColV）与其他型胶原一样，由3条多肽链构成，在分子构成上有 多种形式许祖德、张月娥等采用改良的Niyibizi方法从人的胎盘中提取a（V）、 a（V）和a（V） 123ColV的提取 胎盘去脐带、绒毛膜和羊膜;匀浆，胃蛋白酶消化 4、20h（300mg酶,300g湿重置于0.5mol,L甲酸中）；加NaCl到6%，离心，沉淀置 于缓冲液A中，加NaOI到2mol/L，离心，上清液加NaCI到4.5 mol/L，离心，沉 淀置于含0.7 mol/LNaCI的0.lmol/L醋酸中，离心，上清液加NaCl到1.2mol/L 离心，留沉淀（Col V粗制品）。ColV的纯化ColV粗制品溶于0.5mol/L醋酸，加固 体硫酸胺（144.7g/L），离心，上清液浓缩后，DEAE 52柱层析（柱床3.5cmx12cm），用含0.02 0.34mol/LNaCI的缓冲液B梯度洗脱，留梯度洗脱第一 峰前半部分（纯ColV）。15 姚敏杰、王天成、寇丽筠等同时从人胎盘中提取出III、IV、V型胶原并 进行纯化、氨基酸组分分析和SDS,PAGE分析。其方法为用正常分娩胎盘，冰中冲 去血液置-20 2,3h后剪成小块，在蒸馏水中浸泡，换水3,4次以迸一步去除组织 中血液;沉淀组织制备匀浆，然后再相继用pH为7.5、0.5mol/LTris-HCl1.0mol/L NaCl、0.5mol/L醋酸液抽提6d以去除杂蛋白和血红蛋白，至组织呈乳白色为止； 胃蛋白酶消化按20g湿重组织加入含有50mg胃蛋白酶的100ml0.5mol/L的醋酸中 消化约4h，边消化边搅拌，1000r/min离心lh，在上清中加入研磨好的NaCl至 0.7mol/L，边加边搅拌使III型胶原析出。根据III型胶原在中性条件下沉淀于1.8mol/L的NaCl、II型胶原在酸性条件下沉淀于0.7mol/L的NaCI的特点经多次 反复进行中酸性沉淀后获得了 III型胶原的粗制品。瞄袅聖题圖氮墓碟労析1旳V型mtBt原鱼廂lispro126nsAa-PSIuThr阳34鶴Ser173427Glu01K6GO刚nsGlyJ33：H3Ah19Vtil2227S3Met号1flc17341申Leu11S3狐Tyr253W18291251?12HitfiIDSL/it?a715ArB6029畑舍计1财阿0为该卫邕口励I即。千社站曲听咎刖各种羸基酢敘5沉淀出III型胶原的上清中含有IV、V型胶原，将其对1.2mol/LNaCl、O.5mol/L 醋酸透祈;沉淀溶于 pH 为 7.4、l.Omol/LNaCl、0.05mol/L 的 Tris,HCl 缓冲液中，离心弃沉淀；NaCl加至4.5mol/L 1000r,min离心lh弃上清，沉淀溶于O.lmol/L醋酸中，NaCI加至1.2mol/L离心弃上清，沉淀于pH=7.4、O.lmol/LNaCl、0.05mol/L的Tris,HCI缓冲液中，并用同一缓冲液透析, 1000r/min离心lh，上清含IV型胶原粗提物;沉淀则为V型胶原的粗提物。16,17合III、IV、V型胶原的纯化III型胶原的粗提物在对pH为7.5、0.5mol/L Tris,HCl、0.2mol/L NaCl,0.2mol/L尿素的起始缓冲液进行充分透析 后，加人已平衡好的DEAE,32纤维素层析柱上，用同一缓冲液洗脱，紫外(230nm) 监测至洗脱峰回到基线;收集的蛋白峰对0.001mol/L醋酸透析48h，冷冻干燥后- 50?冰箱保存。IV、V型胶原在起始缓冲液pH为4.8的0.04mol/L醋酸钠、 2.0mol/L尿素中充分透析，加至平衡好的CM,52纤维索层析柱上，线性梯度洗脱 (NaCl浓度从0,0.4mol/L)，230nm监测至吸光值回到基线将收集的蛋白峰对 0.001mol/L醋酸充分透析(,48h)，冷冻干燥后-50?冰箱保存。各型胶原的SDS聚 丙烯酰胺凝胶电泳分析结果为III型胶原呈现出4条区带;IV型胶原有4条区带;V 型胶原为3条区带。各型胶原氨基酸分析结果:III型胶原的Hypro/Pro之比值为 1:2;IV型胶原中以HyPrO、Hyl含量最多，Arg、Ala则较III型胶原为低，IV胶 原的芳香族氨基酸含量较其它类型的胶原为高；v型胶原为细胞外胶原，它的氨基 酸组成见附表;以上各型胶原的氨基酸分析结果与国内外的报道相符 超滤法用于胶原蛋白的分离超滤法就是应用孔径为1 0,2 0,(或更大)的超滤膜来过滤含有大分子或微细 粒子的溶液,使大分子或微细粒子从溶液中分离的过程。超滤的推动力是压差,在溶 液侧加压,使溶剂透过膜得到分离。超滤所用的膜为非对称性膜,其表面活性层有孔 径10-9,2X10-8,的微孔，能够截留相对分子质量为500以上的大分子和胶体微粒， 所用压差为0 1,0 5,。超滤膜对大分子的截留机理主要是筛分作用,即符合所谓 的毛细管流动模型。决定截留效果的主要是膜的表面活性层上孔的大小和形状。除 了筛分作用外,粒子在膜表面微孔内的吸附和膜孔中的阻塞也使大分子被截留。由 于理想的分离是“筛分”,因此要尽量避免吸附和阻塞的发生。超滤也存在浓差极 化的问题,即在溶质透过膜时,溶质在高压侧溶液与膜的界面上发生溶质的聚集,使 膜面上溶质浓度高于主体溶液的浓度。超滤技术有不发生相变、能耗低、常温下进 行等特点,在食品工业中已得到广泛的应用,在蛋白质浓缩与分离方面具有重要意 义。超滤法分离大豆蛋白在国外已有报道,国内研究也证明超滤技术用于蛋白分离 具有切实18可行性。崔岸、朱峰等对超滤法生产大豆分离蛋白进行研究，在小试规模 基础上，探讨物料浓度、温度、操作压力、PH值、循环速度对超滤过程的影响。 选取适宜大豆分离蛋白生产的超滤膜，超滤浓缩后，蛋白质的截留率高于 95,，蛋 白质的回收率达 93(9,。以上的方法多用于生物领域的研究。提取过程多采用化学或者生物酶法并用盐 析法进行提纯，提取产物纯度较高，但是工程比较复杂在工业领域应用较少，一般 只用于科学研究。秘鲁海洋渔业研究所已研究成功一种利用加工过程中的鱼体废弃物提取胶原蛋 白的方法。这种方法是利用加工鱼类后的废弃物如鱼皮、鱼骨、鱼鳞、鱼刺等杂 物，用碱性溶液处理将其软化，然后再经过提取浓缩、脱色脱臭的工序，最终生产 出无色、无味的胶凝状胶原蛋白。这种胶原蛋白可广泛应用于副食品、区药、化妆 品等工业中，一般每十吨鱼废弃物可提取三吨成品胶原蛋白。提取胶原蛋白后的废 渣仍可用作动物饲料。现在也有许多很多方法从皮革固体废料中提取胶原蛋白。如 氧化法、酸法、碱法、酸碱交替法、酶法等。酸的脱铬能力很弱，且对胶原水解程度很大，明胶的产率低，胶原水解损失 大，铬也除不尽，只能得到低级皮胶与小分子多肽。碱法比酸法处理的效果好，胶 原产物的产率和铬6的脱除率都比较高在工业上已有应用。当酸处理与碱处理交替使用时，不仅脱 铬效率要比酸处理法的高，而且所得到的胶原产物的稳定性和质量都要比酸处理法 的高。值得注意得是，酸碱交替处理时要注意酸碱使用的顺序，一般认为先使用碱 处理为好。缺点是处理的过程中会产生有毒六价铬且存放过久的铬革屑中铬脱不 尽。酶的脱铬能力强弱与酶的品种控制条件有很大关系。酶处理法对胶原的降解程 度较大，得到的产物分子小产率较低，铬的脱除率较低。单纯用酶处理含铬的革屑 效果并不好。现在研究的热点是二步处理法，即先脱铬而后用酶水解。美国东部农 业所M M.Taylor、E M Brown等用碱酶处理法提取用于化妆品、粘合剂、打印和 照相工业等用的凝胶性蛋白产物，首先在温和的碱性条件下生成高分子量的凝胶性 蛋白，然后用酶处理剩下的沉淀回收铬与小肽明胶和胶原蛋白产物的收率较高，但 酶只能使用一次成本较高。用碱一一酶处理也有一些不足之处：）酶的稳定性较差，在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响锡，容易变性 失活。 12）一般都是在水溶液中与底物反应，这样就使酶在反应系统中与底物和产物 混和一起，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用，不仅增加生产成 本，也不利于连续化生产。3）反应后，酶与产物混在一起，成为杂质，给进一步的分离纯化带来困难。 解决这些问题的方法之一就是酶固定化技术的应用。将酶与水不溶性载体结合制成固定化酶，固定化酶可在一定空间进行催化反应又克服了游离酶的不足之处， 可反复连续使用，易与产物分离。目前国内研究蛋白酶固定化技术的人很多，黄雅 钦、冷延国、黄明智用壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂制成固定化ASI.398中性蛋 白酶制备水解明胶，固定化酶在使用12次后其活性仍为降低，所得水解产物分子 量分步也较窄，证明固定化酶用于提取胶原蛋白也是可行的，但目前还未见有人把 固定化酶用于皮革废弃物的处理。J/l JI II i Hf&和朋% iF学饗眠巧尸弔1=snVSfiS FHH11r * ihPril1.麼怎战F、卞ii1J1 i1 i 1 171 ?卄X V懒州卜1站1i肓H Affinl vIIIT1M1 i Hi?II Ji建上IR * L. 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W PKHKK7.ITKl药遞駅、l I- 18ThII?r.1 -.眾站：Il KII幼1ii吒尹WL.Flr21 1?八圧抽號IB HY FRI1i i富M-fK!匸恫山liiii入乂嬰酶斫屯丄呵*賀奧用三、胶原蛋白的结构胶原蛋白分子是一个长3000A直径为15A的杆状物，是已知的最长蛋白质之 一。胶原8 蛋白分子量是由3条大小相似的多肽链组成，3条多肽链都有螺旋构象。3条 螺旋互相缠绕，形成一个超螺旋在这个超螺旋中，每个残基上升2.9A，每一圆周 有3.3个残某。这三股多肽19互相以氢键形式结合起来。关静等用SDS,PAGE法对胶原海绵进行了较全 面的结构分析。结果表明酶解法制备的胶原海绵除含有a、B、丫组份以外，还 含有分子量高于Y及分子量低于a的组份;其中Y组份是a组份的三聚体，B 组份是a组份的二聚体，符合胶原蛋白的结构特征;胶原海绵的Y组份及分子量 高于Y的组份含量约是明胶标准品的两倍;分子量低于a的组份含量较少，与胶 原蛋白的组成特征相符。胶原蛋白具有四级结构:氨基酸组成、肽链形成的三股螺旋结构、由原胶原分 子形成的胶原纤维结构以及胶原纤维的编织结构。如下图阳十00丄甘一一护-)1-麗前”甘、丁 1 kA104 A单个的I型胶原分子量约285kD,宽14埃，长约3000埃。有三条多肽链组成。胶原是细胞外基质，由纤维细胞、神经上皮细胞、角膜上皮细胞、软骨细胞等合成，并分泌到细胞外的生物大分子，为纤维性蛋白多聚体，由它的前体胶原分子按照一定的形式排列聚合而成。原胶原分子是由3股a肽链链组成的超螺旋体，哺 乳动物个体中有30种不同的多肽链构成约16种不同的胶原。20,21胶原的氨基酸组成有其特点，甘氨酸约占氨基酸总量的1/3，羟脯氨酸 约占氨基酸总量的10,(羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白，而不存在于一般蛋白质中 (各型胶原的氨基酸组成也各有特点，如I型胶原中羟脯氨酸与脯氨酸之比约为 0(7,0.8(胶原蛋白的氨基酸组成有如下特征:1)甘氨酸几乎占总氨基酸残基的三分之 一，即每9隔两个其他氨基酸残基(X,Y)即有一个甘氨酸，故其肽链可用(甘-X-Y)n来表 示。2)含有较多在其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基，也有较多脯氨酸 (pro)和赖氨酸。如脯氨酸(pro)和4-羟脯氨酸(4-hydroxyproline,Hyp)含量高达 15-30%。同时还含有少量3-羟脯氨酸(3-hydroxyproline)和5-羟赖氨酸(5- hydroxylysine,hyl )。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定教员蛋白分子。例 如，正常胶原在39 变性，而在缺乏脯氨酸的羟化酶条件下合成的胶原在24 变性 成为白明胶(gelatin)。而羟赖氨酸上可结合半乳糖-葡萄糖苷，与特定组织功能相 关。如在基底膜胶原(IV型)中含hyl较多，含糖也较多，可能与基底膜的虑过功 能有关。3)胶原中缺乏色氨酸，所以它在营养上为不完全蛋白质。在胶原纤维中，胶原蛋白分子单位称为原胶原(tropo collagen)。每个原胶原 分子由三条a-肽链组成，a-肽链自身为a螺旋结构，三条a-肽链则以平行、右手 螺旋形式绕成“草绳状”三股螺旋结构见图。肽链中每三个氨基酸残基中就有一个 要经过此三股螺旋中央区，而在此处空间十分狭窄，只有甘氨酸适合此位置，由此 可以解释其氨基酸组成中每隔两个氨基酸残基出现一个甘氨酸的特点。而且三条 a-肽链是交错排列的，因而使三条a-肽链中的Gly、x、y残基位于同一水平上， 借Gly中的N-H基与相邻 链X残基上羟基形成牢固的氢键见下图，以稳定其分子 结构。原纤维胶原蛋白原纤维胶原蛋白的三股螺旋结构己为X,线衍射图像所证实， 是三条a链相互缠绕形成的右手超螺旋结构。螺距9.6nm，每圈每股含36个氨基 酸残基即12个Gly,X,Y三联体。三股螺旋中，沿a链每第三个氨基酸残基位于螺 旋中心，其空间大小仅能容纳分子量最小的氨基酸即甘氨酸。形成三股螺旋结构还 需:？有足够的羟脯氨酸；？C，前肽链间二硫键的形成。每条a链至少要有100个Y位 羟脯氨酸残基才能形成稳定的三股螺旋。脯氨酸和羟脯氨酸的五环结构使胶原蛋白 具有刚性。加强三股螺旋稳定性的还有分子内交联等化学键。a链的端肽形成胶原 蛋白的球状结构区。 下图胶原的右手超螺旋结构为胶原的右手超螺旋结构原纤维胶原蛋白分子直径15nm，长度300nm，分子量约为300kDa。II、III型 胶原蛋白由三条相同的a链构成，为同三聚体(homotrimer),其余为异三聚体 (heterotrimer)，a 链的组成方式分别为；，a1(I),2a2(I)、a1(V)a2(V)a3(V)、 a1(XI)a2(XI)a3(XI)。a1(I)3、，a1(V),3、，a1(V),2a2(V)也少量地存在于细胞 培养液和胚胎组织。a链Gly,X,Y重复序列的连续性是原纤维胶原蛋白区别于非原纤维胶原蛋白的 重要10特怔，也是形成高度有序的胶原原纤维的基础。Gly代表甘氨酸，X常为脯氨 酸，Y常为羟脯氨酸或羟赖氨酸。因此，原纤维胶原蛋白的氨基酸中，甘氨酸约占 1,3，脯氨酸和羟脯氨酸占1,5以上，还有大量的羟赖氨酸和丙氨酸。除III型胶 原外，Gly,X,Y序列中均不含半胱氨酸。原纤维胶原蛋白的a链约有330个 Gly,X,Y重复序列。a链的极性氨基酸和非极性氨基酸相间排列成极性区和非极性 区，总之，原纤维胶原蛋白的一级结构十分规则。编码a链螺旋区的DNA高度保 守，外显子的碱基对数目都是54的整倍数或是这种外显子的重组，生物进化过程 中，从海胆起，编码胶原的基因就非常相似，提示各型原纤维胶原蛋白有共同的基 因起源。a链呈左手螺旋，每圈有33个氨基酸残基，螺距为0.87nm。各型原纤维 胶原蛋白的a链基本相似，a(V)、a(V)、a(XI)、a(XI)之间具有高度1312的同源性，a(XI)和a(lI)是同一基因的产物，a(XI)的糖化程度更高。编码 a(II)1313的外显子有两种拼接方式，分别合成IIA和IIB胶原蛋白a(IIA)的氨基端 比a(lIB)11多69个氨基酸残基，分布于软骨膜、椎间盘髓核等非软骨组织。胶原原纤维原纤维胶原蛋白首尾相接，平行排列，聚合成胶原原纤维。由于a 链的氨基酸交替出现极性区和非极性区，以头尾极性较大，相互平行的胶原蛋白纵 向错开1/4分子长度(约70nm)，以相邻分子的极性区和非极性区的静电引力彼此 聚合，首尾相接的胶原蛋白又保持一定距高，这样形成了胶原原纤维的疏区和密 区，用醋酸铀或磷钨酸染色时，重金属沉积于疏区，透射电镜观察可见胶原原纤维 呈现64,70nm的周期性横纹。由于极性区和非极性区的规律性分布，每周期内又出 现几条明暗相同的横纹。原纤维胶原蛋白再以分子间交联形成稳定的胶原原纤维，交联形式以醛胺缩合为主。胶原原纤维是原纤维胶原蛋白自我装配形成的超分子结构。 原纤维胶原蛋白聚合的程度及快慢，亦即胶原原纤维的粗细因胶原类型而异，也因组织器官、年龄等不同而异，差别很大，直径在20,200nm之间。最细的只有 几个nm，由5个原纤维胶原蛋白分子构成。原纤维胶原蛋白的聚合受C-前胶原，N, 前胶原等中间产物的调控。C,前胶原和N,前胶原即切去了 N,前肽或C,前肽的前胶 原。原胶原分子平行排列成束，通过共价交联，可形成稳定的胶原微纤维(microfibril),进一步聚集成束，形成胶原纤维。胶原分子内通过分子内或分子间 的交联成为不溶性的纤维。因胶原分子氨基酸形成中缺乏半胱氨酸，不可能像角蛋 白那样以二硫键相连，而是通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联，一般发生在胶原分 子的C-或者N-末端之间。胶原样多聚体三螺旋轴的 c 端投影图胶原纤维在不同组织中的排列方式与其功能相关。如在肌腱、皮肤及软骨，要分别在一维、二维和三维方向承受张力，因而其胶原纤维排列分别为平行束状，多角 的纤维片层及不规则排列等方式。若干胶原原纤维借蛋白多糖、糖蛋白等粘合质联结成小束，继而由小束集合成直径l,2um的胶原纤维。胶原原纤维也可以直接聚合成胶原纤维。由于胶原蛋白和 a-链的螺旋方向刚好相反，胶原蛋白又是首尾相接，平行聚合，胶原纤维在偏振光 显微镜下呈双折射现象(birefringence)。各型胶原蛋白形成的胶原纤维粗细不 等，在偏振光显微镜下还显示不同的颜色，由此可对胶原蛋白的类型作粗略的估 计，如I型胶原纤维呈黄色或红色,111型胶原纤维呈绿色。I、III、V型胶原分布广泛而且往往共存于同一组织，III型胶原在弹性较大 的组织如血管和皮肤分布较多，而肌键和骨则以I型胶原为主II型和XI型胶原 特异性地分布于软骨和玻璃体。IV型胶原(COL IV)是基膜的主要成分。基膜不但可维持组织构型，而且可调节 上皮22 细胞和细胞基质间的相互作用。目前发现许多疾病与基膜的结构和代谢缺 陷相关，COL IV属三股螺旋蛋白家族，含大量的羟脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸，几 乎不含芳香簇氨基酸，所以其抗原性较弱。其中许多涉及COLIV，如肾脏病，肝、 肺纤维化及糖尿病等。尤其是纤维23 化疾病，COLIV的含量与结缔组织的增生程度呈正相关。IV.C是基底膜的 主要组成部分(与体内其它纤维性胶原不同，它至少由二个不同的链组成，即 a(IV)和 a(IV)。21其主三螺旋约330nm长，氨基端三螺旋约30nm长，而羧基端为球状的非胶原 结构区(分24 于呈丝状，头、尾分别相连形成网状结构其中四个氨基末端以二硫键相连构成四聚体(PIVNP)称为7S,而二个羧基末端的球体互相吸引形成二聚体(PIVCP) 称为NCI。根据原胶原分子a肽链的构成、氨基酸组成和立体结构的不同，可将 胶原分子分为约15种类型25。在超微结构上I,III型胶原有周期性横纹，横纹 间距在5 2,62nm，而其它型胶原则为细丝状，无明显周期性横纹。在电镜观察中，常在一些病变组织中和某些肿瘤间质中及瘤细胞胞质内见到一 种明暗横纹间隔大于62nm的胶原纤维，由于其横纹间隔大于正常胶原的横纹间隔 （52,62nm）,因此称它为长间距胶原（LSC）。有关LSC的超微结构特征国外己有报 道，1960年Luse在雪旺细胞瘤间质电见到一种间距在100nm,150nm且聚集成梭形 的胶原小体。称为Luse小体。Dingemans把长间距胶原分为两种类型，致密型和 疏散型。致密型含蛋白多糖，疏散型则不含蛋白多糖。但他们仅报道2型，乐美兆 等经电镜观察和免疫组化染色，对17例恶性肿瘤，11例良性雪旺细胞瘤和2例椎 间盘脱出症的髓核进行研究，根据它们的超微结构特征，将LSC分为3型，即小体 型、疏散型和单股型。小体型和疏散型可见于神经鞘瘤的间质中，也可见于腹壁侵 袭性纤维瘤病，恶性横纹肌样瘤和滑膜肉瘤的间质中和瘤细胞胞质中，而单股型仅 见于1例椎间盘脱出的髓核中。小体型LSC是由长间距胶原纤维聚集而成的梭形小 体，纤维排列致密，周期性明暗横纹间隔在90,160nm，暗带明显，排列有序，平 直。小体周缘界清，此型LSC可见于神经鞘瘤的间质中，也见于腹壁侵袭性纤维瘤 病，恶性横纹肌样瘤和滑膜肉瘤的间质中和瘤细胞胞质中（图l,3）。疏散型LSC不 形成特定的梭形小体，胶原细丝排列疏松，暗带电子密度低，常呈波浪状，不规 则，横纹间隔距离与小体型基本相同，周界不清，此型可与小体型LSC同时存在于 间质中和瘤细胞胞质内，也可单独存在（图4）。2 3单股型LSC不同于上述两型， 既不形成梭形小体，也不汇集在一起，而是呈单股状随意分布于无定形的或纤维性 基质中，它的形态类似于I,III型胶原纤维，但它的周期性间隔超过I,III型胶 原，它的平均间距为70,100nm.（图5）。目前仅见于椎间盘脱出症的髓核中，并不 存在细胞质内。有关长间距胶原的性质主要有两种观点：(1)大部分LSC为VI型胶原(2)LSC是 胶原纤维裂解时的中间阶段。Dingemens等为明确长间距胶原的性质，应用抗 1,111型胶原抗12体，经免疫电镜标记，未发现这些抗体与LSC反应。因此，他认为LSC是胶原 纤维裂解时的中间阶段。我们对瘤细胞内见到小体型和疏散型LSC的1例横纹肌样 瘤和1例侵袭性纤维瘤病进行免疫组化染色，发现这些瘤细胞Vimentin阳性， Myoglobin阴性，说明这些瘤26细胞并非肌源性，而可能是间叶性。(一) 结合于胶原原纤维表面的胶原蛋白.(FACIT)FACIT子结构可分为三个区:一区与胶原原纤维结合;二区刚性较好，是支撑一 区的功能臂;三区借二区伸出胶原原纤维与细胞或细胞外间质的其他成分结合。其 中一区，特别是COL1的氨基酸序列相对比较保守，在NO1与COL1交接处都有 Cys,(Xaa)4,Cys序列(Cys代表半胱氨酸)，形成链内或链间二硫键。三区变异最 大，与各型胶原的特殊功能有关。FACIT胶原的另一特点是。链两端的非胶原区在 细胞外不被蛋白酶水解、FACIT不形成胶原原纤维，而是位于其表面，作为胶原原 纤维与其他结构相互作用的中介，IX型胶原和XII、XIV型胶原分别与II型和I 型胶原形成的胶原原纤维结合，XVI、XIX型胶原的倩况尚不明确，其中IX型胶原 发现较早，研究较多。(1) IX型胶原NC4)和胶原区IX型胶原有三条不同的a链，属异三聚体、a链的非胶原区 (NC1,(C0L1,C0L3)依次沿羧基端向氨基端方向交替排列。由于存在可变启动子 (al terna tive promo ter)，软骨的a(IX)NC4有243个氨基酸残基，呈碱性，可与 富含阴离了的糖胺1而在角膜初级基质和玻璃体只有2个氨基酸残基、此外，a(IX)NC3比a(IX) 多糖结合,21NC3多出5个氨基酸残基，序列为缬氨酸，谷氨酸,甘氨酸，络氨酸,丙 氨酸，能与硫酸软骨素或硫酸皮肤素结合。因此，IX型胶原也是一种蛋白多糖， 其侧链在软骨内较短，在鸟类的玻璃体则很长。IX型胶原的三条a链均以COL2的氨基端与a(II)的N,端肽形成共价交联， 交联形式为吡啶或羟基吡啶(hydroxypyridinium)，a(IX)C0L2还与a(II)C,端肽 结合。31COL3和NC4伸出胶原原纤维，与细胞外间质中的糖胺多糖结合，使细胞外间质 具有整体性和稳定性，使软骨能较好地承受外部挤压和内部膨胀所产生的应力。(2) XII和XIV型胶原XII型胶原为同三聚体，有XIIA和XIIB两亚型。a链包括COL1,COL2和 NC1,NC3，NC3很长。XII型胶原蛋白的分子构型包括三部分：中NC1,COL2形成长 75nm卷曲的尾，由NC3形成的球形中心及三个末端有小型球状结构，长度为 80nm(XIIA)或 60nm(XIIB)的指状结构a(XII)COLl 与 a(XII)与 a(IX)COL 1 氨 基酸残基数目相111近，氨基酸和核苷酸序列都有50,相同，羧基末端都有一个半胱氨酸残基，两 个非Gly,X,Y序列的位置相似，二者具有部分同源性a(XII)NC3中的213个氨 基酸残基也有134,相同，都有4个半胱氨酸残基处于相似的位置，因此也有一定的同源性。XIV型胶原的结构与XIIA型胶原极为相似。两种胶原的分布有组织特异性，在 皮肤，XII型胶原以XIIB为主，分布于网状层和血管周围;XIV型胶原分布于乳头 层、软骨内，XII型胶原以XIIA为主，局限分布于关节面、软骨管周围、关节 面、软骨膜及软骨膜下层；XIV型胶原的分布则较为广泛。两种胶原的分布在胚胎 发育时期都存在动态变化。与IX型胶原不同，XII型和XIV型胶原与 胶原纤雉的 结合缺乏共价交联，主要由氢键和二硫键完成、软骨内的XIIA型和XIV型胶原还 结合有硫酸软骨素，结合部位在XII型胶原为NC3,14在XIV型胶原可能是NC1或NC2。(3) XIV和XIX型胶原XIV和XIX型胶原发现较晚，和原纤维胶原蛋白的关系还不清楚，结构上与IX、13XII、X、IV型胶原都有不同程度的相似性。NC1和COL1的邻接区含有 Cys,(Xaa)4,Cys序列而归入FACIT类、a(XIV)有10个胶原区，a(XIX)有5个胶 原区a(XIX)111NC11和a(XIX)NC6较长，成为胶原纤维与细胞外间质其他成分 相互作用的桥梁。 1(二) IV、VIII和X型胶原IV型胶原是基膜所特有的结构蛋白，VIII型胶原仅存在于分隔角膜内皮和基 质的角膜后界层即Descemens膜，X型胶原特异性地由软骨内成骨时期的肥大性 软骨细胞(hypertrophic chondrocyte)合成，分子结构与VIII型胶原极其相似， 因此划为一类。(1)IV型胶原迄今己发现IV型胶原有6种a链，a(IV),a(IV)是主要的结构形式。a122链由NC1、C0L1、NC2三部分组成，COL1很长，有1400多个氨基酸残基，包括 20余个含2,24个氨基酸残基的非Gly,X,Y序列IV型胶原蛋白全长400nm，NC2 和部分COL1组成长度为30nm的7S区，含有半胱氨酸和赖氨酸，NC1也富含半胱 氨酸。通过二硫键和共价交联作用，胶原蛋白单体经NC1聚合成为二聚体，再经 7S聚合形成四聚体，四聚体最后形成立体网络结构，容纳层粘连蛋白，巢蛋白复合 物(laminin,nidogen complex)和硫酸肝素蛋白多糖等基膜成分，使基膜具有机械 和化学的屏障功能。IV型胶原广泛分布于细胞外间质，是由三条a链构成的异三聚体、a链中 NCI, COL1, NC2组成。COL 1很短，含2个非Gly,X,Y序列。NC1和NC2较长，以 a(IV)NC23最长，有18O4个氨基酸残基IV型胶原单体反向聚合成为二聚体，单 体间重叠75nm为内区(inner region)，有NC1形成的大型球状结构，两侧30nm 为外区(outer region)，包括部分COL1和NC2形成的小型球状结构。两个二聚体 再度平行聚合形成四聚体。最后，四聚体首尾相接外区之间部分重叠，形成周期为 100nm的微原纤维(microfibril)，内区的大型球状结构使微原纤维呈串珠状、微 原纤维进一步聚合形成胶原纤维。IV型胶原结构特点为:？COL1有识别整合素的 RGD序列。？COL1形成N,糖苷键必需的天冬酰胺,X,丝氨酸，苏氨酸序列。？NC1、 NC2含有von Willebrand因子(vWF)A型序列。？a(VI)NC13含有与纤连蛋白和腱 生蛋白(tenascin)、Kunitz型蛋白酶抑制剂、涎蛋白相似的氨基酸序列。？能结合 核心蛋白聚糖(decorin)和hyaluronan。(2)VIII和X型胶原本组胶原蛋白的a链最短，分子量只有60kDa左右，包括NC1、COL1和NC2。X型胶原为同三聚体，VIII型胶原的分了结构可能是a(VIII)a(VIII)。 三条a链，尤其是122NC1和COL1的基因结构、氨基酸序列都极其相似。两种胶原蛋白单体梭基端 (NC1)聚合成多聚体，多聚体在氨基端(COL1，NC2)结合，形成六角形网格结构。 VIII型胶原分布于角膜后界层，X型胶原与钙的亲和力较高，短期地存在于软骨内 成骨过程的肥大区(hypertrophic zone)，随骨化而消失，说明它参与了软骨的钙 化作用。(三) VII型胶原首先发现它是固着原纤维的主要成分，对表皮起连接和支持作用井与大疱性表 皮松解症的发生有关。VII型胶原为同三聚体，a链中氨基端向羧基端包括NCl(150kDa)、C0Ll(170kDa)和 NC2(32 或 34kDa)三部分。COL1 有 1530 个氨基酸残 基，长达424nm，其次是NC1,有1245个氨基酸残基，包括1个软骨基质蛋白 (cartilage matrix protein CMP)序列，9个连续的纤连蛋白III型序列和1个 vWFA型序列。胶原蛋白单体中NC1形成顶端有球状结构的三条臂、单体间经NC2 相互聚合形成二聚体，许多二聚体聚合就形成了固着原纤维。固着原纤维呈袢状缠 绕I、III型胶原纤维，两端分别附着于真皮，表皮连接(dermo14epidermal junc tion)的致密板和位于真皮乳头层，主要中IV型胶原组成的 固着张斑(anchoring plaque)并与半桥粒发生联系。除皮肤外，VII型胶原及固着 原纤维还存在于消化道等其他器官的上皮组织，参与细胞的分化、粘附和基底膜的 滤过等功能。(四) XIII和XVII型胶原 二者并不同源性，但两者有相同的结构特征:?氨基端有跨膜区而无信号肽。?外显子发生可变拼接(alternative splicing)使其a链包括胶原区在内呈现结构的 多样化。a1(XIII)肽链很短，包括3个胶原区和4个非胶原区，COL1、COL2、NC2和 NC4的氨基酸残基数目因可变拼接变化较大。胶原的产生以间充质来源的细胞为 主，分布广泛，从胚胎到成人的多种组织都有mRNA表达。XVII型胶原最初发现于 表皮的个桥粒，是大疱性类天疱疮等疾病的自身抗原，a链有13个胶原区和14个 非胶原区，氨基酸总数为1433。两种胶原的结构和功能还须进一步研究。(五) XV和XVIII型胶原XV和XVIII型胶原的发现较晚，同源性较高。二者还有下列共同点:？胶原区 很多，分别为9个和10个、?分了两端都是大型球状结构、?糖胺多糖和寡糖结合 位点多。？分布广泛，以内脏器官较多。XVIII型胶原的基因有两个可变启动子， 其中一个启动子的转录产物中编码NCl的外显子发生可变拼接，因此XVIII型胶原 还有不同的亚类。组织中还存在由不同类型胶原聚合而成的异型原