分子生物学论文：探析沙门氏菌的检测对预防和控制沙门氏菌感染的重要性

分子生物学论文：探析沙门氏菌的检测对预防和控制沙门氏菌感染的重要性摘要：沙门氏菌病是一种在自然界广泛存在的人畜共患病，可以引起人类败血症、胃肠炎等疾病，还能导致动物伤寒、副伤寒，严重者会危及人、畜的生命。因此，建立沙门氏菌的快速检测方法对预防和控制沙门氏菌感染至关重要。目前沙门氏菌的检测技术有传统培养法、免疫学检测技术、分子生物学检测技术和近年来发展起来的如生物传感器检测技术、纳米技术、基于适配体检测技术等新型技术。该文总结了沙门氏菌各种检测方法的原理、优点和缺点及研究情况，并对沙门氏菌的检测方法及应用前景进行了展望。关键词：食品; 沙门氏菌; 检测方法; 研究进展;Abstract：Salmonellosis is a zoonotic disease that is widespread in nature, it can cause diseases such as human sepsis and gastroenteritis, and also cause typhoid and paratyphoid in animals. In severe cases, it can even endanger life of human and animals. Therefore, the establishment of a rapid detection method for Salmonella is essential to prevent and control Salmonella infection. At present, the detection technologies of Salmonella including traditional culture methods, immunological detection technologies, molecular biological detection technologies, and some new technologies such as the biosensor detection technology, nanotechnology and detection technology based on aptamer developed in recent years. The principles, advantages and disadvantages and researches of various detection methods for Salmonella were summarized, and the detection method and application prospect of Salmonella were also prospected.Keyword：food; Salmonella; detection method; research progress;1885年，在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，定名为沙门氏菌属（Salmonella sp.）。沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌，种类繁多，目前已检测出2 500多种沙门氏菌血清型2。沙门氏菌是一种革兰氏阴性的肠道杆菌，不但能显性或隐性感染动物，而且能通过污染的动物源性食品造成人的食物中毒，严重危害公共健康安全。根据欧洲食品安全局（European Food Safety Agency,EFSA）统计，欧洲每年有超过10万例的人类沙门氏菌病3。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）统计显示，在美国每年的沙门氏菌感染已经增加到1 200万人，引起大约1.9万人住院甚至450人死亡3。我国内陆地区由沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。目前沙门氏菌的检测方法主要包括传统生理生化检测方法、免疫学检测方法、分子生物学方法以及近年来多学科联合应用的新型检测方法，如生物传感器技术、纳米技术、基于适配体检测技术等，这些方法为进行沙门氏菌的准确、快速、灵敏的检测提供了方向。本文对沙门氏菌的检测方法研究进展进行了概述，为沙门氏菌病的检测和防控提供参考。1、 传统生理生化检测方法传统生理生化方法的检测过程包括样品预增菌、增菌、分离培养、生化试验和血清学鉴定，具有较高的准确性，是国际和国内食品中沙门氏菌检测的标准方法4。国际标准ISO 6579食品和动物饲料的微生物学沙门氏菌检测的基准方法5、GB4789.42016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验6分别是目前用于食品中沙门氏菌检测方法，但是在沙门氏菌病的应急处理中经常需要尽快得到检测结果，传统生理生化方法的检测周期约47 d，操作繁琐，更多依靠于主观判定，并且肠杆菌科的生化鉴定具有交叉性，在检测速度、特异性、敏感性等方面有一定的局限性。显色培养基法和添加物质法均可以加快病原菌的分离和鉴定，其中利用显色培养基法进行检测后结果准确，并易于判定，该方法已经被收录于GB/T 4789.42008食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验及以后版本的标准中7，但是具有较高的实验成本；添加物质法可以缩短检测时间至2 d8。疏水网膜法可以提高病原菌的富集效率，该方法操作更为简便，检测时间缩短至3 d9。以上改进方法明显缩短了沙门氏菌的检测时间，降低了检测限，但是无法彻底解决传统方法检测周期长、操作繁琐的问题。因此需要研究准确、方便的沙门氏菌快速检测方法。2 、免疫学检测方法免疫学技术是以免疫学为理论基础利用抗原抗体的特异性反应对细菌进行放大检测的一种方法，具有灵敏性较高、检测时间短、高通量的优点，因此在食品微生物检测中得到普遍应用。2.1、 酶联免疫分析法酶联免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）最早是于1977年首次应用以检测食品中沙门氏菌，目前已经成为沙门氏菌检测中的常用免疫分析技术，它是将抗原、抗体的特异性反应与酶的催化作用相结合来检测特异性抗原10。ELISA主要包括直接ELISA、间接ELISA、双抗体夹心ELISA及竞争ELISA等7。ELISA法的检测效率高于传统检测法，但也需要长时间增菌，操作中会出现假阳性和假阴性，并且ELISA难以检测多种病原。该技术目前需要研究具有高特异性的重组抗原，并能进行多种标记的全自动酶联免疫分析技术。伍燕华等11用抗沙门氏菌多克隆抗体和抗沙门氏菌单克隆抗体C1359建立了沙门氏菌的双抗夹心ELISA检测方法，可以快速检测A、B、C、D、E等五种典型沙门氏菌，最低可以检测的沙门氏菌纯培养液浓度为1104CFU/m L。WILANEE C等12将具有大表面积和良好生物相容性的SWCNT作为鼠伤寒沙门氏菌抗体和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）的载体，建立成一个Ab/SWCNTs/HRP结构的信号放大探针，以此探针对鼠伤寒沙门氏菌进行检测，结果发现该方法的灵敏度是传统ELISA法的1 000倍。方一臻13将外膜蛋白Pag C进行重组纯化，经过各条件优化建立了检测沙门氏菌抗原的间接ELISA方法，该方法重复性好、特异性强、可以应用于沙门氏菌的主要血清型中。何一欣14经过筛选得到了肠炎沙门氏菌的纳米抗体，并建立了检测牛奶样品中肠炎沙门氏菌的双抗体夹心ELISA方法，灵敏度为110 CFU/m L，为快速检测沙门氏菌提供了技术支持。2.2、 免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique,IFT）的基本原理是将荧光色素标记在抗体（抗原）上，与对应的抗原（抗体）结合后，在荧光显微镜下发出可见荧光，从而定性检测抗原（抗体）。荧光物种类一般有异硫氰酸荧光素、罗丹明荧光素、二氯三嗪基氨基荧光素等。该检测方法操作简便，结果直观，特异性好，但缺点是会产生非特异性染色8，敏感性较低7。WANG B B等15建立了一种检测蛋壳上沙门氏菌的高特异性免疫荧光法，该方法将荧光强度高、水溶性好的Cd Te量子点作为标记物与沙门氏菌抗体结合，量子点标记抗体与沙门氏菌发生特异性反应，最低检出限为1102CFU/m L。PANDEY S K等16建立了一个检测伤寒沙门氏菌的新型夹心荧光免疫分析方法，以抗Vi荚膜多糖抗体为捕获剂，以阳离子受体分子多黏菌素B为粘结剂，检出限为10 CFU/m L。夏圣等17以纳米荧光碳点（carbon dots,CDs）这一新型纳米材料作为免疫示踪材料来检测样品中乙型副伤寒沙门氏菌。该方法将抗沙门氏菌Ha因子抗体与CDs耦联制备出免疫纳米荧光碳点，并将抗沙门氏菌O4因子抗体与磁珠粒耦联进行样品中乙型副伤寒沙门氏菌的富集后，再与免疫荧光碳点产生抗原抗体反应，形成抗O4-磁珠-细菌-抗Ha-CD免疫复合物。使用免疫亲和分离液从复合物中除去磁珠粒，通过检测分离液中CDs的荧光强度来推算样品中病原菌的量。此方法的检测下限为103CFU/m L，检测时间约2 h。2.3、 免疫磁性分离技术由于食品样品经常为固液多相混合态，采用传统方法难以分离出少量致病菌。免疫磁性分离技术（immunomagnetic separation technique,IST）是将磁性颗粒与抗体特异性偶联，偶合物与样品中致病微生物进行特异性结合，结合了致病微生物的磁珠在磁场的作用下向磁极方向移动，与样品处理液分开，得到浓集的致病菌。此技术提高了病原的浓缩效率，经常与免疫学、生物学等技术联合应用，具有更高的灵敏度和特异性，并且不需要前增菌步骤，检测时间缩短至仅为几小时18。申静等19将结合了沙门氏菌单抗的羧基磁珠作为免疫磁珠，利用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）纳米探针，建立一种快速方法来进行样品中沙门氏菌的特异性检测。李亚茹等20用纳米磁珠结合抗沙门氏菌多克隆抗体，经过反应条件优化建立了免疫磁珠分离方法。并根据沙门氏菌ttr基因合成引物和探针，建立实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR）方法。将这两种技术联合应用，实现了高效、灵敏地检测虾中沙门氏菌。免疫磁性技术具有选择性分离、快速浓缩的优点，是综合磁载体技术和免疫学的一项重要检测技术。2.4、 免疫层析法免疫层析法（immunochromatography assay,ICA）的原理是将抗体固定在硝酸纤维素膜的某区域，再将样品浸入干燥的硝酸纤维素膜一端，样品在毛细管的作用下沿该膜移动，当到达有抗体的区域时，样品中的抗原会特异性地结合抗体，采用酶染色或胶体金使发生免疫反应的区域显色，来进行病原体的特异性检测。该技术以免疫渗透为基础，具有简单快速、成本低廉、稳定性好的优点7，但也存在灵敏度较低、无法定量的问题。刘志科等21建立了一种鸡白痢沙门氏菌抗体检测的胶体金免疫层析法，该方法将inv A基因进行原核表达并纯化，将山羊抗体Ig Y用30 nm胶体金溶液标记，分别包被于NC膜上作为检测线和质控线。该方法准确度高、方便快速。李倩茹等22建立了以荧光微球为标记物的荧光微球免疫层析检测法，将抗体与羧基化的磁性微球偶联，再将荧光微球免疫层析法与抗鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠相结合以浓缩和检测食品中的鼠伤寒沙门氏菌。该法具有快速、特异、灵敏的优点。2.5、 免疫组织化学法免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）也称为免疫细胞化学法，是指特异性抗体经过显色剂标记后与组织细胞内抗原进行特异性结合并产生呈色反应，以对组织细胞内抗原进行定位、定性、定量检测的一种方法。此方法通过利用荧光显微镜、电子显微镜对细胞、亚细胞水平的抗原物质（病原体、多肽、蛋白质、激素、酶等）进行显像和放大来检测各种抗原，具有敏感性高、特异性强、适用广泛的优点。免疫组织化学技术主要包括免疫荧光技术、免疫酶技术。黄策等23利用红细胞吸附免疫荧光技术解决了荧光免疫快速检测沙门氏菌中杂菌的干扰，但是该技术中的红细胞使用前必须先用抗体致敏，并且红细胞上由于抗体少，针对病原菌含量少的样品可能会出现假阴性。他们后来建立了玻片固相抗体吸附免疫荧光技术，此技术是在显微镜载玻片上固定抗菌抗体和未致敏红细胞，其中抗体吸附病原菌，红细胞仅作为荧光显微镜镜检的指示物。该技术与红细胞吸附免疫荧光法相比敏感性更高，并且配制试剂更简便，易于在基层单位推广。2.6、 免疫扩散法免疫扩散法（immunodiffusion,ID）是在抗原抗体的免疫沉淀反应基础上将琼脂作为惰性载体，通过比较沉淀与抗原浓度的关系，可以定量检测样品中抗原（蛋白质）含量。免疫扩散法包括环状免疫单扩散法和双向扩散法。FELDSINE P T等24将改良免疫扩散法与细菌分析手册中方法进行比较来检测生肉和高污染食品中的沙门氏菌，此改良免疫扩散法是加拿大农业部建立的方法，目的是在保持检测时间为2 d的同时，在42四硫磺酸钠煌绿肉汤中添加高温选择性富集步骤。在所检测的320个样品中，使用改良免疫扩散法和细菌分析手册培养方法的假阴性率分别为5.2%和3.5%，总体一致性达96.9%。GAST R K等25分别用荧光偏振和侧向流免疫扩散法来检测孵化的鸡蛋内容物中肠炎沙门氏菌，结果显示两种方法在鸡蛋内容物中检出限均为108CFU/m L（大多数为107CFU/m L），虽然快速检测的灵敏度明显低于培养法，但是用10 CFU肠炎沙门氏菌感染10个鸡蛋并在25孵育72 h时，快速检测法和培养法都可以检测到病原菌。2.7、 免疫传感器法免疫传感器法（immunosensor assay,IA）是根据抗原抗体的特异性反应，将抗原（抗体）作为感应元件与信号传导器相结合，通过反应待测抗体（抗原）的浓度来检测目标物质的一种方法。该方法特异性强、灵敏度高。陈晨等26在纳米金和石墨烯共沉积的丝网印刷碳电极表面用双抗体夹心法建立了一个电化学免疫传感器来进行沙门氏菌的快速检测，该传感器具有特异、稳定的优点，检出限为1.18102CFU/m L。胡雨欣27采用免疫磁纳米粒子进行肠炎沙门氏菌的高效富集，并和双通道等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）传感器偶合起来，建立了一种以SPR传感器进行肠炎沙门氏菌检测的新方法，该方法特异性强、准确度高，检测限为1.4 CFU/m L。马骏爽等28将纳米金、氧化石墨烯、氧化石墨烯/纳米金复合材料、氧化石墨烯/离子液体以电沉积方法分别修饰到丝网印刷电极上，并与酶标抗体结合制备成四种免疫传感器，综合比对后结果显示在免疫传感器的各项指标尤其是准确性和重现性方面离子液体和纳米金材料明显优于其他材料。2.8、 免疫色谱技术免疫色谱技术（immunochromatographic technique,ICT）是以抗原抗体的特异性结合反应为基础。该方法首先在柱填料中偶联抗原（抗体）来制备亲和层析柱，当样品通过层析柱后，就可以从混合样品中将与抗原（抗体）特异性结合的免疫成分分离纯化出来。免疫色谱法在近30年来发展迅速，具有高效、快速、安全的优点，该方法选择性最高并且分离纯化最有效。YEUNG C Y等29建立了一种脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）探针-金纳米颗粒免疫色谱法来检测样品中沙门氏菌的16S核糖体DNA，并将该方法与VITEK 2系统进行确认比较，结果显示该方法检测159份样品的敏感性为100%，特异性为94.93%,DNA纯化后的检测时间仅为30 min，是一种方便、快速、成本低的检测方法。BAUTISTA D A等30评估了基于免疫色谱的试纸条检测家禽中沙门氏菌的敏感性和特异性，当使用不同沙门氏菌菌种的纯菌落时分析灵敏度为11041105CFU/m L；当直接检测鼠伤寒沙门氏菌感染的鸡粪便时敏感性为12.3%，特异性为100%；与XLT4选择性培养基相比当样品在2%BPW中预增菌后敏感性和特异性分别增加至93.8%和89%；随后用TT肉汤增菌后敏感性和特异性分别提高至94.7%和96.8%。与在XLT4选择性培养基分离病原菌相比，该试纸条检测法在预增菌和增菌步骤会缩短1848 h。3 、分子生物学方法随着分子生物学技术的逐渐发展，人们对生物体的认识已经到达微观水平，通过检测病原微生物的核酸序列和蛋白结构，来进行不同致病微生物、同一微生物不同抗原类型的分离鉴定31。许多沙门氏菌分子生物学检测方法以其快速、灵敏、特异的优点也逐渐被广泛应用。3.1、 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是一项体外基因扩增技术，是由美国的MULLIS K等在1985年首次建立的9，具有检测快速、特异性强、敏感性高10的优点，是一种目前广泛应用的检测方法，但是操作比较复杂，检测结果不太稳定。常用的PCR检测方法包括多重PCR法、荧光定量PCR法、免疫PCR法等。赵新等32以沙门氏菌inv A基因作为目的基因，建立了检测沙门氏菌微滴数字PCR定量检测法，此方法不需要构建质粒和标准曲线，可以快速、灵敏、准确地检测沙门氏菌含量。王青龙等33建立了实时荧光PCR来检测食品中的亚利桑那沙门氏菌，特异性很好，检测灵敏度为110 CFU/m L。PRASHANT S等34建立了双重实时荧光PCR来检测牛肉制品中大肠杆菌（Escherichia coli）、stx1、stx2基因和沙门氏菌（Salmonella），此方法利用内标形成具有高分辨率的两个溶解曲线，检测结果重复性好、准确性高、成本低廉。程玲玲等35设计并筛选出三对特异性引物来进行鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum）检测，并且经条件优化得到一种含两种DNA聚合酶的三重PCR反应体系，该体系可以实现免核酸提取的直接PCR，检测灵敏性高，检出限3.2、 环介导等温扩增技术环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术是2000年NOTOMI T等36开发的一种新型恒温核酸扩增方法，其原理是针对靶基因的六个区域设计四种特异性引物，利用一种链置换脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）聚合酶在等温条件（63左右）保温3060 min，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，LAMP具有简单、灵敏、成本低的特点，不需要模板的热变性、温度循环、电泳等过程10，适用于高通量检测，但是对引物设计要求比较严格37,38。LI J等39建立了食品中沙门氏菌特异性基因62181533的LAMP法，检出限为4.1 CFU/m L，具有高度特异性和灵敏性，检测时间3.3、 核酸探针技术核酸探针技术的原理是碱基配对，核酸探针是指带有标记物的能识别特定核酸序列的脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）片段42，它能与其互补的核酸序列杂交形成双链，可以用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。此技术具有快速、特异、敏感的特点43，已经应用于一些病原微生物的检测和研究。目前已经用于病原检测的核酸探针有基因组DNA探针、互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,c DNA）分子探针和近些年来开发出来的如Taq Man探针、分子信标等寡核苷酸探针。ALMEIDA C等44利用新型肽核酸探针结合荧光原位杂交来检测水、奶粉、粪便中的沙门氏菌，准确度达到100%。袁慕云等45建立了基于Taq Man探针的沙门氏菌双重实时荧光PCR检测方法，实现了对肠炎沙门氏菌和肠道沙门氏菌的同时检测，该方法具有高灵敏度和强特异性，肠炎沙门氏菌和肠道沙门氏菌的检测限分别为260 CFU/m L和280 CFU/m L。ISABEL M等43筛选出了Sal-3和Sal-5两个核酸序列作为检测沙门氏菌的探针，Sal-3探针在鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌培养液中的检测限（limit of detection,LOD）值分别为105CFU/m L和104CFU/m L,Sal-5探针的检测限稍高于Sal-3探针，分别为104CFU/m L和104CFU/m L，检测结果与PCR、ISO 6579标准方法一致。3.4、 基因芯片技术基因芯片的基本原理是杂交测序法，是指标记样品DNA与一组固定于支持物上的核酸探针杂交，通过分析杂交的信号强度获得样品DNA序列。基因芯片是1991年由美国学者FODOR S P46提出的。不同于PCR、免疫分析等只能检测一种或较少的几种微生物基因片段、操作过程复杂，基因芯片技术可以同时对大量基因片段进行分析8，具有特异性强、自动化以及高通量的优点，是目前可用于多种微生物检测的快速方法之一，但也存在实验成本（探针合成、核酸标记、数据分析）较高、测定结果不稳定等问题。许俊钢47应用基因芯片检测了大肠菌群（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella）和志贺氏菌（Shigella castellani）共30份样品，结果显示其准确率高，检测时间在8 h内，检测效率显着提高。LI Y48利用可视化DNA微矩阵技术结合多重PCR方法来检测常见的致病菌，包括大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌和单增李斯特菌，该实验通过检测包括沙门氏菌在内的14种致病菌阳性的食品及菌液，结果显示检出限为102CFU/m L，是一种快速、特异、高通量的检测方法。3.5、 扩增片段长度多态性技术扩增片段长度多态性技术（amplified fragment length polymorphism,AFLP）的基本原理是先用限制性内切酶进行基因组DNA的双酶切，产生不同分子质量大小的随机DNA片段，再进行PCR扩增，根据不同长度的扩增片段进行多态性分析。此技术具有快速简便、结果稳定的优点，在微生物研究方面的应用较为广泛1，但是对内切酶质量和DNA纯度要求很严格。目前AFLP技术在沙门氏菌研究方面报道较少。有学者1对含有62个血清型的78株沙门氏菌菌株进行了AFLP指纹图谱分析后，结果显示每一个血清型都有独特的AFLP指纹图，并且AFLP指纹的分辨率较高，可以因此区分不同菌株。4 、新型检测方法4.1、 生物传感器检测技术生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转化为电信号进行检测的仪器，是由固定化的生物分子识别元件（如微生物、细胞、组织、酶、抗原、抗体等生物活性物质）、适当的信号转换器（如光敏管、氧电极、压电晶体）及信号放大装置组成的分析系统。目前用于检测沙门氏菌的传感器有酶传感器、电化学传感器、免疫传感器、基因传感器、光敏传感器等7。生物传感器具有准确度高、检测速度快、操作简便的优点。严杏49建立了一种DNA适配体传感器来检测甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi)A，其基本原理是荧光叠加、荧光能量共振转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）和限制性内切酶酶解作用。其中限制性内切酶I介导的靶标循环可以将荧光信号放大，当靶标浓度为110211011cells/m L时，荧光强度的线性关系良好，检测下限为1102cells/m L，结果显示该方法具有高度灵敏性和特异性。CHEN I H等50利用噬菌体包被的ME传感器建立两种检测模式，以比较鸡肉中沙门氏菌的检测效果，结果表明在检测鸡肉表面时，添加了7.86105CFU/mm2沙门氏菌的噬菌体C4-22传感器与未添加的噬菌体对照传感器相比显示出12倍以上的沙门氏菌结合能力。王月等51利用生物素-脱氧核糖核苷三磷酸（biotin-deoxy-ribonucleoside triphosphate,B-d NTP）改良了沙门氏菌目的片段扩增产物，实现了以核酸横流生物传感器为检测依据的沙门氏菌可视化检测方法，该方法检测快速、结果直观，检出限为10 CFU/m L。4.2、 纳米技术纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围（1100 nm）的材料52，具有小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应和宏观量子隧道效应的基本特征。将纳米材料与电子材料、生物学结合起来，就可以利用如酶、抗体等特定识别分子来分析待测样品，并产生特定信号。纳米材料应用于食品中致病菌检测方面的技术包括纳米生物传感器技术、纳米金免疫标记技术、纳米磁分离技术等。纳米材料如氧化石墨烯、碳纳米管、等离子体金、磁珠等被用作生物传感器的传感部分，已经应用于致病菌的检测53。将纳米技术与常规检测技术相结合，具有大批量检测、方便快捷、灵敏度高8的优点，但是对检测成本和技术水平要求较高。徐连应等54建立了一种基于复合纳米材料和酶切信号的电化学传感器，已经成功检测出羊奶中的沙门氏菌，检测敏感性为200 CFU/m L，具有检测限低、特异性好、灵敏度高的优点，有望应用于食品中沙门氏菌的快速定量检测。LIU X等55利用夹心免疫分析法原理，将免疫传感器结合抗体修饰Fe3O4磁性纳米（immunosensor combining antibody-functionalized Fe3O4magnetic nanoparticles,immuno MNPs）构建了一个表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）传感器，用于肠炎沙门氏菌的快速检测。此方法的检测限为14 CFU/m L，与immuno MNPs结合的SPR免疫传感器与肠炎沙门氏菌常规SPR传感器相比，其灵敏度提高了4个数量级。该实验构建的SRP传感器具有成本低、简便、高度敏感的特点，有望成为食品中致病菌检测的新方法。肖稳等56研究了一种羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米合成材料，根据以分子信标共价功能化为基础的壳聚糖技术，利用金纳米比色方法来进行鼠伤寒沙门氏菌SSe C基因的检测，该方法的灵敏度和特异性较高，对目的基因的检测下限为50 nmol/L。4.3、 基于适配体的检测技术适配体是采用指数富集配体的系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）从人工合成的随机文库中筛选出的一段寡核苷酸序列，该序列对相应的配体具有高度亲和力和特异性。核酸适配体作为一种新型识别分子，具有制备方便、可体外化学合成、成本低、稳定性好等优点57，并且比抗体的制备周期短、特异性高，但是该技术目前检测的致病菌种类比较少，实现高通量检测还存在较大难度58。近年来已经筛选出多种致病菌的适配体并应用于食品检测，基于适配体检测食品中沙门氏菌的技术也在逐渐发展。段诺59首先将适配体、磁性纳米颗粒、双色上转换纳米颗粒分别作为识别元件、捕获探针和显示探针，与上转换激光诱导荧光技术结合起来，建立了一种同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄菌的方法，鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别为5 CFU/m L和8 CFU/m L；其次基于适配体识别和量子点荧光标记技术，并与流式细胞术相结合，建立了同时检测沙门氏菌和副溶血性弧菌的方法，结果显示该方法与平板计数法无显着差异；最后根据Accu Blue染料具有弱荧光强度，结合双链DNA后产生高荧光强度，结合单链DNA后荧光强度无明显变化，建立了无标记荧光适配体传感器，分别实现了沙门氏菌和副溶血性弧菌的检测，检测限为25 CFU/m L、35 CFU/m L。贾飞60首先基于适配体识别和还原氧化石墨烯-纳米金制备了新型电流型传感器，对食品中沙门氏菌进行检测，检测限为80 CFU/m L(S/N=3）；其次利用一步电沉积法还原氧化石墨烯-碳纳米管复合纳米材料，构建了基于适配体的新型无标记电化学传感器来检测沙门氏菌，检出限为25 CFU/m L(S/N=3）。蒋晓华等61根据合成的金属有机骨架材料（Uio-66-NH2）的荧光猝灭特性和适配体的识别作用，制备了荧光生物传感器来检测虾肉样品中的沙门氏菌，该传感器的灵敏度、特异性较好，检出限（S/N=3）为7 CFU/m L。5 、结论与展望食品中微生物检测对于保证人们的饮食健康有重要意义，尤其是近年来致病菌感染受到了人们的广泛关注。沙门氏菌作为常见的致病菌在畜禽类及其制品中的感染逐渐增多，沙门氏菌检测方法也在不断发展。最常用的沙门氏菌检测技术有传统生理生化检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。传统生理生化检测方法的准确度高，稳定性好，检测成本低，但是操作复杂，检测周期长，不能进行现场检测，目前该方法仍然是国际标准化组织认可的沙门氏菌检测金标准。免疫学检测方法的检测灵敏度高、检测批量多、检测速度快，能够广泛应用到沙门氏菌检测中，但是操作中多次洗涤容易引起交叉污染和假阳性，检测结果主要由一抗的质量决定，而一抗的制备需要大量时间去摸索，并且目前无法检测所有的沙门氏菌血清型。分子生物学检测方法的灵敏度高、特异性强、检测快速，但是所需的仪器费用高，对检测人员、检测条件和环境的要求比较严格，如PCR技术在引物设计、操作环境方面容易引起不稳定结果；基因芯片的标记技术、增强芯片检测灵敏性等技术问题需要进一步优化。生物传感器技术、纳米技术、基于适配体检测技术等新型检测技术为建立沙门氏菌快速检测方法提供了技术支撑，但是存在技术要求严格、实验成本高等问题，其中基于适配体的检测技术还需要提高适配体筛选效率、研究适配体与靶分子的结和作用机制。联合使用两种或两种以上方法能适当弥补单一检测技术产生的缺陷，将传统的生化检测技术、免疫学技术、分子生物学技术结合起来用于致病菌的检测，才能提高病原微生物的研究和检测水平。将一些新型技术与常规检测方法联合使用，促进了沙门氏菌检测技术的快速发展。目前由于高技术要求、成本费用高等原因，大多数新型检测技术仅在实验室研究阶段。一项快速检测技术能否得到广泛应用，除了检测快速、结果准确、特异性强等优点外，还与成本较低、接近实际应用有关。随着人们对食品安全的密切关注和食品卫生监管的快速检测要求，开发灵敏度高、快速准确、成本较低、操作简便的检测方法是今后检测食品中沙门氏菌的重要研究方向。