小分子人工抗原的制备方法

小分子人工抗原的制备常用方法一、碳二亚胺（EDC）法（制备KAN-BSA ）1. A液的制备：准确称取BSA 20mg, EDC 55mg,使之充分溶解于2mL 0.01M PBS中，4C避光搅拌反应6h,得到反应液为A液；2. B液的制备:准确称取卡那霉素标准品50 mgA 1.5 mL 0.01 M PBS中， 边加边搅拌，使之充分溶解后所得溶液称为B液；3. 将上述B液逐滴加入A液中（边加入边搅拌），密封，避光，在4C下 搅拌过夜；4. 待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，4C用0.01M PBS透 析3d，透析第一天每3h换液一次，以后每8-10h换液一次；5. 透析完成后，将偶联产物分装于1.5ml ep管中，于-20C保存备用。本实验 将其作为免疫原。二、戊二醛（6人）法（制备KAN-GA-OVA ）1. A液的制备：准确称取卡那霉素标准品50mg，量取0.5%戊二醛溶液1mL，2. 先后将二者充分溶于2 mL 0.01M的PBS中，于4C，避光搅拌反应30 min，所得反应溶液称为A液；3. B液的制备：准确称取OVA 150 mg，将其充分溶于5mL 0.01M PBS中， 得到的溶液称为B液；4. 将上述B反应液逐滴加入到A反应液中，边加入边搅拌，再向反应溶液中 加入约5.5mg硼氢化钠，调节溶液pH至8.0，于4C避光搅拌反应2h；5. 用0.01M PBS透析，4C透析5d，每8h换液一次，透析完成后，将反应液 分装于1.5mL离心管中，放于-20C冻存备用。三、混合酸酐法（制备克百威人工抗原）1. 取半抗原克百威（BFNH或BFNB）溶解在DMF （二甲基甲酰胺）中，然后在 该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，在室温下反应1h；2, 取反应液500ul加入到5ml 15mg/ml的BSA碳酸缓冲液中，在磁力搅拌下 反应2h；3, 反应完成后，蒸馏水透析2次；0.8%生理盐水透析；4. 紫外扫描测定结合比，于-20C保存备用。四、活泼酯法（制备克百威人工抗原）1. 克百威半抗原BFNB的合成及纯化1）取一四口烧瓶置于恒温磁力搅拌器上,配置温度计。2）称取1.64 g呋喃酚溶解于50 mL二氯甲烷（DCM）中，冰浴下加入1.11 g三乙胺 （Et3N），搅拌 10 min；3）将3.04 g二（对硝基苯）碳酸酯溶于15 mL二氯甲烷中，缓慢滴加到上述反应体 系中，缓慢升温至室温,继续搅拌反应1 h,TLC板监控反应完成，展开剂为V（石 油醚）：V（乙酸乙酯）=10 : 1,此为溶液A;4）称取1. 697 g经三乙胺碱化的4-氨基丁酸甲酯盐酸盐溶于10 mL二氯甲烷中, 在冰浴下滴加到A液中,将温度升到室温并继续搅拌过夜；5）用水、饱和食盐水依次洗涤并用无水硫酸钠干燥,滤液真空旋干后用硅胶柱层 析纯化，得到半抗原中间体B;6）将B溶于15 mL 1,4-二氧六环溶液中，加人18 mL三氟醋酸和15 mL 水,60 C反 应4 h后冷却至室温；7）反应液用乙酸乙酯萃取后，依次用水、饱和碳酸氢钠、水、饱和食盐水进行 洗涤，用无水硫酸钠干燥，滤液真空旋干后用硅胶柱层析纯化后即可得到克百 威半抗原BFNB，洗脱剂为V （石油醚）:V （乙酸乙酯）=5:1；2. 半抗原BFNB鉴定将纯化后的克百威半抗原BFNB采用核磁共振仪和LC-GC进行分子结构鉴定，已 确定半抗原是否合成成功；3. 完全抗原的合成1）免疫原（BFNB-BSA采用活性酯法进行合成，控制半抗原BFNB与载体蛋白BSA 的反应摩尔比为80:1；2）称取29.3 mg半抗原BFNB，13.8 mg NHS溶于1ml无水DMF中，充分溶解完 全；3）加入24.3 mg DCC（n,n-二环己基碳酰亚胺）室温搅拌反应过夜；4）离心去沉淀，收集上清，此为A液；5）称取BSA 83 mg溶解在5 ml 0.01 mol/L PBS溶液中，为B液；6）在冰水浴中，将A液逐滴滴加到B液中，4C搅拌过夜；7）反应混合液用PBS缓冲液透析3 d，6-8 h换液1次，离心取上清，分装于0.5 ml离心管中，-20C保存备用。8）包被原（BFNB-OVA）在合成中，载体蛋白为OVA，半抗原BFNB与OVA的反 应摩尔比为40:1，其余步骤与免疫原的合成相同。