基因敲除小鼠的实验流程

基本实验流程基本实验流程 扩增扩增 一、动物基因组一、动物基因组DNA的提取的提取实验原理实验原理 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备制备基因组基因组 DNA。真核生物的。真核生物的DNA是以染色体的形式是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分分子的完整。提取子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞的一般过程是将分散好的组织细胞在含在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得异戊醇抽提分离蛋白质，得到的到的DNA溶液经乙醇沉淀使溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。从溶液中析出。每只小鼠鼠尾加入每只小鼠鼠尾加入500ul裂解液和裂解液和10ul 蛋白酶蛋白酶K(20mg/ml)，55度水浴过夜，至鼠尾溶解。度水浴过夜，至鼠尾溶解。提提DNA步骤：步骤：1.每管鼠尾加入每管鼠尾加入300ul饱和饱和NaCl，充分混匀，充分混匀，12500rpm 离心离心20min2.取上清取上清700ul至新的离心管中，加入预冷的异丙至新的离心管中，加入预冷的异丙醇醇700ul，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到絮状絮状DNA析出为止析出为止,12500rpm 离心离心20min，弃上清弃上清3.加入加入800ul 75%乙醇于离心管中，洗沉淀，乙醇于离心管中，洗沉淀，12500rpm离心离心10min4.晾干沉淀，加入晾干沉淀，加入100ul的的PCR级的水。级的水。二、二、PCR扩增扩增 cycle2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量可以的含量可以放大放大100万倍万倍以上。以上。动画动画PCR:（20ul体系）o2x Mix 10ulo无菌水 2ulo2pmol引物1 2ulo2pmol引物2 2ulo2pmol引物3 2ulo模板DNA 2ulPCR扩增仪扩增仪95 3min95 30sec60 30sec72 30sec72 5min35 cycles三、琼脂糖凝胶电泳三、琼脂糖凝胶电泳原理：原理：在在pH8.08.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（成及电泳温度（430之间）无明显关系。一般说，之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于与电场强度（小于5V/cm）成正比。）成正比。琼脂糖凝胶电泳