受体放射分析PPT课件

第七章第七章 受体放射分析（受体放射分析（RBA）第一节第一节 概概 论论 受体的概念最初是在药理学研究中提出的，受体的概念最初是在药理学研究中提出的，并且进行了大量的研究。自并且进行了大量的研究。自8080年代以来，受体年代以来，受体的研究取得了长足的进展，这种进展是与新技的研究取得了长足的进展，这种进展是与新技术、新方法的应用分不开的。例如，利用基因术、新方法的应用分不开的。例如，利用基因克隆技术测定受体的一级结构，使受体的氨基克隆技术测定受体的一级结构，使受体的氨基酸序列得以阐明，并为确定受体的亚型奠定了酸序列得以阐明，并为确定受体的亚型奠定了基础。但这些新技术、新方法不能测定受体的基础。但这些新技术、新方法不能测定受体的亲和力（亲和力（KDKD值）。值）。至今，研究受体亲和力和受体数量最基本，至今，研究受体亲和力和受体数量最基本，最主要的方法仍然是受体的放射性配基结合分最主要的方法仍然是受体的放射性配基结合分析（析（radioligand binding assay of radioligand binding assay of receptorsreceptors，RBARBA），简称受体放射分析。它是），简称受体放射分析。它是应用放射性核素标记配基与特异性的受体结合，应用放射性核素标记配基与特异性的受体结合，研究受体的亲和力和受体的数量，也是研究受研究受体的亲和力和受体的数量，也是研究受体亚型的常用方法。体亚型的常用方法。迄今为止，所有已发现的受体迄今为止，所有已发现的受体（receptorreceptor）都是具有特定氨基酸序列和特定）都是具有特定氨基酸序列和特定构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定的宏观分布（器官和组织特异性）和微观分布的宏观分布（器官和组织特异性）和微观分布（细胞或细胞核）。（细胞或细胞核）。虽然受体在总蛋白分子中所占的份额很虽然受体在总蛋白分子中所占的份额很小，约为十万到百万分之一，但受体的功能小，约为十万到百万分之一，但受体的功能却十分重要，它接受细胞外的特定信号（神却十分重要，它接受细胞外的特定信号（神经递质、激素、某些药物等），通过受体后经递质、激素、某些药物等），通过受体后特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应，特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应，因此，受体是高等动物适应环境、协调机体因此，受体是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键分子。可以认为，受体各种细胞功能的关键分子。可以认为，受体是细胞适应内外环境最重要的门户，在中枢是细胞适应内外环境最重要的门户，在中枢神经系统中更是信息传递和储存的枢纽。神经系统中更是信息传递和储存的枢纽。一、受体的分类和受体亚型一、受体的分类和受体亚型 按受体所在的部位不同分为细胞膜受按受体所在的部位不同分为细胞膜受体和细胞核受体。每种受体都有特异的内体和细胞核受体。每种受体都有特异的内源性和外源性配基，但是药理实验和放射源性和外源性配基，但是药理实验和放射配基结合实验发现，不少受体存在两种或配基结合实验发现，不少受体存在两种或两种以上的亚型。所谓受体的亚型是指受两种以上的亚型。所谓受体的亚型是指受体分子结构上既有部分相同之处，也存在体分子结构上既有部分相同之处，也存在部分差别，它们对一定的配基有不同的亲部分差别，它们对一定的配基有不同的亲和力，在生物学上具有各自不同的效应。和力，在生物学上具有各自不同的效应。受体亚型的区分是生物进化的结果，有利受体亚型的区分是生物进化的结果，有利于机体处理信息的能力及适应性更强。于机体处理信息的能力及适应性更强。二、跨膜受体的信号传递通路二、跨膜受体的信号传递通路 跨膜受体是含糖或不含糖的蛋白质分子跨膜受体是含糖或不含糖的蛋白质分子，它的主要作用是将细胞外的信号传导到细，它的主要作用是将细胞外的信号传导到细胞内，信号再从细胞浆传递到效应器，最后胞内，信号再从细胞浆传递到效应器，最后是一个特定的生物学效应。信号的这种传导是一个特定的生物学效应。信号的这种传导过程称为信号传导通路（过程称为信号传导通路（signal transudation signal transudation pathwaypathway），它是当今生物学领域中一个重大），它是当今生物学领域中一个重大的研究课题。受体信号传导的确切通路和机的研究课题。受体信号传导的确切通路和机理至今仍未完全阐明，同学们可参阅理至今仍未完全阐明，同学们可参阅“细胞细胞生物学生物学”等相关课程。等相关课程。三、受体与配基结合的特性三、受体与配基结合的特性 1 1、可饱和性（、可饱和性（satiabilitysatiability）每个细胞所每个细胞所含受体数是有限的，因此配基与受体结合的反应含受体数是有限的，因此配基与受体结合的反应曲线应该具有可饱和性，受体结合反应呈高亲和曲线应该具有可饱和性，受体结合反应呈高亲和性和低容量，而非特异结合则呈低亲和性和高容性和低容量，而非特异结合则呈低亲和性和高容量，后者的剂量反应曲线不呈可饱和性。量，后者的剂量反应曲线不呈可饱和性。2 2、可逆性（、可逆性（reversibilityreversibility）激素、递质激素、递质和药物与特异性受体结合反应是可逆的，当受体和药物与特异性受体结合反应是可逆的，当受体周围的配基浓度降低，结合反应就逆向进行，即周围的配基浓度降低，结合反应就逆向进行，即配基受体复合物很快解离，解离后的配基是原形配基受体复合物很快解离，解离后的配基是原形，不起代谢变化，这跟酶与底物作用结果不同，不起代谢变化，这跟酶与底物作用结果不同，底物经酶作用后变成代谢产物。底物经酶作用后变成代谢产物。3 3、特异性（、特异性（specificityspecificity）和亲和性（）和亲和性（affinityaffinity）受体具有特异识别配基的性能，因此，只有受体具有特异识别配基的性能，因此，只有严格构型和构象的配基分子才能选择性地与受体严格构型和构象的配基分子才能选择性地与受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织（靶器结合。受体的特异性还表现在器官或组织（靶器官）的专一性上，如雌激素对子宫、阴道、乳腺官）的专一性上，如雌激素对子宫、阴道、乳腺等器官有兴奋作用，这是因为这些器官上雌激素等器官有兴奋作用，这是因为这些器官上雌激素受体的数量明显高于非靶器官。受体的亲和性是受体的数量明显高于非靶器官。受体的亲和性是指受体和配基的结合能力，受体亲和性高就说明指受体和配基的结合能力，受体亲和性高就说明受体和配基结合的牢固，不容易解离。受体亲和受体和配基结合的牢固，不容易解离。受体亲和性的定量指标就是受体的平衡解离常数性的定量指标就是受体的平衡解离常数KDKD值。受值。受体的体的KDKD值一般在值一般在1010-8-8-10-10-10-10mol/Lmol/L之间，之间，KDKD值在值在1010-9 9mol/Lmol/L以上的受体，一般认为是高亲和性。以上的受体，一般认为是高亲和性。4 4、与效应的一致性、与效应的一致性 受体的主要功能是介导配基的生物效应，如受体的主要功能是介导配基的生物效应，如果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定的生果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定的生物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。所以用物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。所以用生物效应作为观察受体和配基性质的标准是十分生物效应作为观察受体和配基性质的标准是十分必要的。从配基的角度分析，有的是阳性效应，必要的。从配基的角度分析，有的是阳性效应，有的是阴性效应。阳性效应就是配基与受体结合有的是阴性效应。阳性效应就是配基与受体结合后引起阳性生理效应，称为激动剂。阴性效应就后引起阳性生理效应，称为激动剂。阴性效应就是配基与受体结合后不但不引起阳性生理效应，是配基与受体结合后不但不引起阳性生理效应，而且阻断内源性配基的阳性生理作用，称为拮抗而且阻断内源性配基的阳性生理作用，称为拮抗剂或阻断剂。剂或阻断剂。四、受体的生理调节四、受体的生理调节 细胞膜上受体的数量和亲和性随细胞所处的细胞膜上受体的数量和亲和性随细胞所处的环境而发生变化。受体的这种生理调节现象与人环境而发生变化。受体的这种生理调节现象与人体的疾病、药物作用有着密切的关系。受体的生体的疾病、药物作用有着密切的关系。受体的生理调节作用可分为向上调节和向下调节。理调节作用可分为向上调节和向下调节。1 1、向下调节（、向下调节（down-regulationdown-regulation）细胞所处环境中某种激动剂的浓度增高或长细胞所处环境中某种激动剂的浓度增高或长期作用，其结果使相应受体的数量减少，并出现期作用，其结果使相应受体的数量减少，并出现受体对此物质的敏感性下降，或耐受性增高等现受体对此物质的敏感性下降，或耐受性增高等现象，如哮喘病人长期服用象，如哮喘病人长期服用-激动剂产生的耐受性激动剂产生的耐受性增高，即药效减弱。增高，即药效减弱。2 2、向上调节（、向上调节（up-regulationup-regulation）细胞所处环境中某种拮抗剂的浓度过高或细胞所处环境中某种拮抗剂的浓度过高或长期作用，结果会使受体数量增高，出现受体敏长期作用，结果会使受体数量增高，出现受体敏感性增高，表现为增敏，或撤药后反跳现象。如感性增高，表现为增敏，或撤药后反跳现象。如高血压病人长期服用心得安时对儿茶酚胺增敏，高血压病人长期服用心得安时对儿茶酚胺增敏，若突然停药，可出现血压升高的反跳现象。由于若突然停药，可出现血压升高的反跳现象。由于受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生受体在整体条件下，随机体状态变化，会出现生理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研理调节，因此对受体数量和亲和性测定就成为研究病理变化和评价药效的重要内容。究病理变化和评价药效的重要内容。第二节第二节 受体配基结合反应的基本原理受体配基结合反应的基本原理 一、简单单位点系统受体与配基相互结合一、简单单位点系统受体与配基相互结合的基本规律的基本规律（一）质量作用定律（一）质量作用定律（mass action lawmass action law）对某种受体而言，它的全部受体都以相同的亲和对某种受体而言，它的全部受体都以相同的亲和性以单分子与特定的配基相结合（分子比为性以单分子与特定的配基相结合（分子比为1 1：1 1），而且不表现明显的正负协同作用，理论上讲），而且不表现明显的正负协同作用，理论上讲结合后产生的生物效应也应完全相同。即为简单结合后产生的生物效应也应完全相同。即为简单单位点系统。有时，一个受体系统中存在两（多单位点系统。有时，一个受体系统中存在两（多）种亚型，但所用配基无选择性，尽管亚型的生）种亚型，但所用配基无选择性，尽管亚型的生物效应可能不全相同，结合反应却表现出完全相物效应可能不全相同，结合反应却表现出完全相同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。（二）复合物的浓度和配基浓度的关系：（二）复合物的浓度和配基浓度的关系：上式展开，重排，得到下式：上式展开，重排，得到下式：可以看出，可以看出，RLRL和和LT LT 并非线性关并非线性关系，而是曲线关系，对一定数量（系，而是曲线关系，对一定数量（RTRT固定）和一定亲和力（固定）和一定亲和力（KDKD固定）的受体固定）的受体来说，配基浓度从零开始上升时，复合来说，配基浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大多数受体都变为复合物，也就最后绝大多数受体都变为复合物，也就是受体被饱和了。这就是饱和曲线是受体被饱和了。这就是饱和曲线 （saturation curve)saturation curve)（图（图9 91 1）。）。曲线的曲线的高度主要反高度主要反映受体的数映受体的数量多少，曲量多少，曲线上升的快线上升的快慢则主要反慢则主要反映受体和配映受体和配基的亲和力基的亲和力（亲和力越（亲和力越高，上升越高，上升越快）。快）。（三）非特异结合（三）非特异结合（nonnonspecific specific bindingbinding，NSBNSB）上述饱和曲线是受体与配上述饱和曲线是受体与配基的特异结合形成的。这种结合的特点是基的特异结合形成的。这种结合的特点是低容量（受体的数量不多）和高亲和力，低容量（受体的数量不多）和高亲和力，所以容易饱和。但是，任何受体标本除特所以容易饱和。但是，任何受体标本除特异结合外，还会有一部分非特异结合，当异结合外，还会有一部分非特异结合，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分非特异结合的放射性混在一起，测到部分非特异结合的放射性混在一起，测到的是总放射性（的是总放射性（total bindingtotal binding，TBTB），），必需先减去非特异结合（必需先减去非特异结合（NSBNSB），才能得），才能得到特异结合（到特异结合（specific bindingspecific binding，SBSB）的）的放射性。放射性。NSBNSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱和，也就是随着配基浓度的升在一般情况下不被饱和，也就是随着配基浓度的升高，它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线（图高，它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线（图9 9l l）。另外，如果系统中存在大量同种受体的非）。另外，如果系统中存在大量同种受体的非标记配基，则放射性的标记配基，则放射性的SBSB被非标记配基取代，而被非标记配基取代，而NSBNSB由于容量很大，空余的位点很多，放射性不被由于容量很大，空余的位点很多，放射性不被取代。所以要从取代。所以要从TBTB中减去中减去NSBNSB，最基本的办法是做，最基本的办法是做一系列平行管，所有的条件都与一系列平行管，所有的条件都与 TBTB管相同，只是管相同，只是多加多加 100-1000100-1000倍量的非标记配基，将倍量的非标记配基，将SBSB完全取代完全取代掉，这时的放射性结合即为掉，这时的放射性结合即为NSBNSB。由于。由于NSBNSB和放射配和放射配基呈直线关系，多点饱和法的实验中往往只需做基呈直线关系，多点饱和法的实验中往往只需做3-3-4 4点，再用直线回归法求出其余各点的放射性。点，再用直线回归法求出其余各点的放射性。（四）（四）ScatchardScatchard作图（作图（Scatchard plotScatchard plot）将将9 91 1写成以下形式：写成以下形式：KDKD RT RTRLRL L LRLRL上式重排，得到著名的上式重排，得到著名的ScatchardScatchard函数：函数：可以看出，当可以看出，当 RTRT和和 KDKD固定时，固定时，RLRL L L和和RLRL是线性关系，也就是说，以是线性关系，也就是说，以RLRL为横为横坐标，以坐标，以RLRLL L为纵坐标，将得到一为纵坐标，将得到一条直线。这是简单单位点系统的一个重要特征。条直线。这是简单单位点系统的一个重要特征。横截距即为横截距即为RTRT值（当值（当RLRLL L 0 0时，时，RTRTRLRL），直线斜率的倒数就是），直线斜率的倒数就是KDKD（图（图9 93 3）。）。ScatchardScatchard作图除进行数据处理外，作图除进行数据处理外，还能判断一些较复杂的情况。例如，一还能判断一些较复杂的情况。例如，一般来说，般来说，ScatchardScatchard作图在下列情况下不作图在下列情况下不呈直线：双位点或多位点系统，亦即呈直线：双位点或多位点系统，亦即受体有两种以上亲和力；受体有正协受体有两种以上亲和力；受体有正协同（同（nositive cooperativelynositive cooperatively）或负协）或负协同（同（negative cooperativelynegative cooperatively）现象；）现象；非特异结合的测定所用非标记配基浓非特异结合的测定所用非标记配基浓度不对，或把一部分非特异结合也抑制度不对，或把一部分非特异结合也抑制了，或对特异结合的抑制不完全。了，或对特异结合的抑制不完全。（五）正负协同作用（五）正负协同作用 何谓正负协同作用？它是指当一部分受体与配何谓正负协同作用？它是指当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲和力逐步下降，称之为负协同作用（如图和力逐步下降，称之为负协同作用（如图9 94 4中曲中曲线（线（2 2），亲和力逐步增大，称之为正协同作用。，亲和力逐步增大，称之为正协同作用。（曲线（曲线（3 3）。）。（六）受体与配基反应的动力学（六）受体与配基反应的动力学（kineticskinetics）受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快（图合物的解离也很快（图9 96 6），这种快速结合和快），这种快速结合和快速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。（七）竞争性取代反应（七）竞争性取代反应 （competitive competitive displacement reaction)displacement reaction)在一个受体和放射配基的反应系统中加在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体的配基结入另一个化合物，它若能和受体的配基结合位点结合，则会与放射配基竞争与受体合位点结合，则会与放射配基竞争与受体结合，最终将表现为放射配基与受体形成结合，最终将表现为放射配基与受体形成复合物的能力降低（亲和力降低），但受复合物的能力降低（亲和力降低），但受体数量不变所以叫竞争性取代反应，此时体数量不变所以叫竞争性取代反应，此时，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂（competitiveagentcompetitiveagent），它们和受体结合），它们和受体结合后不改变受体分子的结构。后不改变受体分子的结构。表示竞争剂抑制作用强弱的指标有表示竞争剂抑制作用强弱的指标有二个：二个：ICIC5050值和值和KIKI。ICIC5050值是指抑制值是指抑制5050受体与放射配基结合所需竞争剂的浓受体与放射配基结合所需竞争剂的浓度，度，ICIC5050值大，表明竞争剂抑制作用小。值大，表明竞争剂抑制作用小。KIKI则是指竞争剂的平衡解离常数，则是指竞争剂的平衡解离常数，KIKI越越小，表明竞争剂抑制作用越大。小，表明竞争剂抑制作用越大。二、双位点系统二、双位点系统 一种配基可以和两种以上的受体亚一种配基可以和两种以上的受体亚型结合，每种亚型都有相应的型结合，每种亚型都有相应的KDKD值。这值。这一部分的内容感兴趣的同学自己阅读！一部分的内容感兴趣的同学自己阅读！第三节第三节 受体放射分析的基本方法受体放射分析的基本方法 一、放射性配基的要求一、放射性配基的要求 制备优良的放射性配基是受体结合试验的首制备优良的放射性配基是受体结合试验的首要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：配标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：配基的特性；实验目的。基的特性；实验目的。（）对放射性配基的基本要求（）对放射性配基的基本要求1 1、高比活度、高比活度 组织细胞内的受体浓度一般都组织细胞内的受体浓度一般都很低，约在很低，约在10104 4-10-105 5个细胞，或蛋白的水平，个细胞，或蛋白的水平，而且受体对配基的平衡解离常数约在而且受体对配基的平衡解离常数约在1010-9-9mol/Lmol/L上下。因此，低比活度的配基难于达到分析灵敏上下。因此，低比活度的配基难于达到分析灵敏度的要求。度的要求。一般要求配基比活度至少在一般要求配基比活度至少在 3 37 7 10101111BqBq（10Ci10Ci）mmolmmol以上。另外，配基比以上。另外，配基比活度高，加入反应管的放射性配基量才有活度高，加入反应管的放射性配基量才有可能减少，从而有利于用小量标本得到可可能减少，从而有利于用小量标本得到可靠的数据，并有利降低非特异性结合率。靠的数据，并有利降低非特异性结合率。2 2、高亲和力、高亲和力 因为亲和力高，可以减少标因为亲和力高，可以减少标记配基用量，从而既可降低非特异性结合，记配基用量，从而既可降低非特异性结合，又可使放射性配基与受体的结合物解离变又可使放射性配基与受体的结合物解离变慢，便于进行结合和游离配基的分离。不慢，便于进行结合和游离配基的分离。不仅方便操作，而且获得的数据准确。仅方便操作，而且获得的数据准确。3 3、特异性强、特异性强 即该配基与所研究受体有选择即该配基与所研究受体有选择性结合，理想的是该配基只与一种受体或受体性结合，理想的是该配基只与一种受体或受体亚型结合。但没有一种配基是完全选择性的，亚型结合。但没有一种配基是完全选择性的，所以要结合实验研究的目的，选择对某一受体所以要结合实验研究的目的，选择对某一受体或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。4 4、稳定性好、稳定性好 包括标记的稳定性、贮藏时的包括标记的稳定性、贮藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性。稳定性以及温育分析时之稳定性。从实验目的考虑则主要针对具体研究目标来从实验目的考虑则主要针对具体研究目标来选择。例如有的受体有几种亚型，如果实验的意选择。例如有的受体有几种亚型，如果实验的意图是放射性配基要结合所有这几个亚型，即可选图是放射性配基要结合所有这几个亚型，即可选择无亚型选择的配基。相反，想研究其中某一个择无亚型选择的配基。相反，想研究其中某一个亚型，则应选择针对该亚型的高亲和力配基。亚型，则应选择针对该亚型的高亲和力配基。目前，用作受体放射分析的放射性配基多用目前，用作受体放射分析的放射性配基多用3 3H H、125125I I标记。氚标记配基与原型配基为同型式，标记。氚标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用肽及蛋白质配基多用125125I I标记，其优点是可以达标记，其优点是可以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条件（单碘到较高的比活度。只要很好掌握标记条件（单碘标记物），仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记物），仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。测量操作简单，所以测量操作简单，所以125125I-I-配基也大量采用。需要配基也大量采用。需要注意的是自行标记注意的是自行标记125125I-I-配基要解决两个难题：配基要解决两个难题：要确定标记物的比活度，如果比活度不确切，最要确定标记物的比活度，如果比活度不确切，最后所得的受体结合位点数不确切。标记配基的纯后所得的受体结合位点数不确切。标记配基的纯化：多 肽 的 碘 标 化 合 物 往 往 产 生 一 碘化：多 肽 的 碘 标 化 合 物 往 往 产 生 一 碘（monoiodinatedmonoiodinated）和二碘（）和二碘（iodinatediodinated）标记物。）标记物。这些标记物对受体的亲和力有可能是不同的。这些标记物对受体的亲和力有可能是不同的。125125I I核素在存放过程中要衰变，因此核素在存放过程中要衰变，因此125125I I配基应该配基应该注意比活度的衰变校正，而且要有正确的校正方法。注意比活度的衰变校正，而且要有正确的校正方法。标记配基的存放问题：标记配基在存放过程中，标记配基的存放问题：标记配基在存放过程中，由于受到核素的衰变，放射性的损伤等原因，其化学由于受到核素的衰变，放射性的损伤等原因，其化学和生物学性质必然会产生某些变化。为减轻损伤，氚和生物学性质必然会产生某些变化。为减轻损伤，氚标记物，一般采用原包装的溶剂作适当稀释后，在原标记物，一般采用原包装的溶剂作适当稀释后，在原推荐的温度下保存。推荐的温度下保存。125125I I标记物常用标记物常用1 1BSABSA的缓冲液的缓冲液适当稀释后分装，在适当稀释后分装，在-20-20中存放。中存放。（二）放射性配基的质量鉴定（二）放射性配基的质量鉴定 选定好某一种放射性配基后，在具体使用选定好某一种放射性配基后，在具体使用前还应对其质量作适当的鉴定，以保证受体结前还应对其质量作适当的鉴定，以保证受体结合分析结果的准确性。例如，一般是假定和推合分析结果的准确性。例如，一般是假定和推测所用的标记配基与原型配基具有相同的生物测所用的标记配基与原型配基具有相同的生物活性，但具体使用时，应认真进行评价。这一活性，但具体使用时，应认真进行评价。这一点常常是很多研究报告的结果对同一受体出现点常常是很多研究报告的结果对同一受体出现很大差别的重要原因。很大差别的重要原因。1 1、放射化学纯度、放射化学纯度 放射性配基的放射化学纯度放射性配基的放射化学纯度对受体结合率及分析灵敏度均有较大影响。除新对受体结合率及分析灵敏度均有较大影响。除新鲜产品外存放一定时间后的标记配基均应重测其鲜产品外存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在纯度应在9595以上。以上。2 2、结合活性鉴定、结合活性鉴定 受体结合分析中，放射性配基受体结合分析中，放射性配基的活性特别重要，特别是生物活性。目前，测定配的活性特别重要，特别是生物活性。目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力。即测定其最基的活性主要是指与受体的结合能力。即测定其最大结合活性。现介绍大结合活性。现介绍JC KermodeJC Kermode提出的一种方法如提出的一种方法如下：以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制下：以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂（饱和结合实验）进行反应，测定结合百分率；剂（饱和结合实验）进行反应，测定结合百分率；以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条直线；延长直线与纵座标的交点，即可算得一条直线；延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活性。（如图）出该标记配基结合活性。（如图）3 3、比活度、比活度 受体结合分析最后的结果计算时离不受体结合分析最后的结果计算时离不开准确的比活度数据。必要时也可用放射受体自身开准确的比活度数据。必要时也可用放射受体自身置换法测定比活度。这一方法若使用得当，能较准置换法测定比活度。这一方法若使用得当，能较准确测定比活度，而且也反映标记配基的受体结合活确测定比活度，而且也反映标记配基的受体结合活性。性。二、受体标本的制备二、受体标本的制备 在受体结合实验的研究中，所用的受体材在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。体，可溶性的受体蛋白等。（）组织切片（）组织切片 冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5-50m5-50m。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（用放射自显影法或免疫组化法）。用放射自显影法或免疫组化法）。（二）游离的完整细胞悬液（二）游离的完整细胞悬液 完整的活细胞可以是血细胞，培养的单层细完整的活细胞可以是血细胞，培养的单层细胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等。完整细胞的优点是在研究受体结合特性同时，。完整细胞的优点是在研究受体结合特性同时，能进行生物效应的测定。使用完整细胞的优点如能进行生物效应的测定。使用完整细胞的优点如下：下：1 1、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱，膜内，膜内pHpH、离子梯度也保存着。受体与其相连的、离子梯度也保存着。受体与其相连的效应系统（如效应系统（如G G蛋白）也保存完好。蛋白）也保存完好。2 2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。3 3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。、能直接给出平均每一个细胞的受体数。但完整细胞的受体分析较难控制分但完整细胞的受体分析较难控制分析条件。操作过程可能导致细胞表面生析条件。操作过程可能导致细胞表面生理活性的改变，因此结果有时不够稳定。理活性的改变，因此结果有时不够稳定。另外，若细胞上某种受体的含量低，作另外，若细胞上某种受体的含量低，作分析时需加入大量细胞才能获得足够的分析时需加入大量细胞才能获得足够的放射性计数，给实际工作带来一定困难。放射性计数，给实际工作带来一定困难。完整细胞来源分三种：从组织分离出完整细胞来源分三种：从组织分离出游离细胞；血细胞；培养细胞。一游离细胞；血细胞；培养细胞。一般都需采用台盼蓝等检查细胞活性。般都需采用台盼蓝等检查细胞活性。（三）膜制剂（三）膜制剂（membranous preparationmembranous preparation）绝大多数受体结合分析使用膜制剂。使绝大多数受体结合分析使用膜制剂。使用膜制剂可以减少非特异性结合率。而且，用膜制剂可以减少非特异性结合率。而且，在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。内源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。膜制剂通常也保存有受体膜制剂通常也保存有受体-效应器（包括效应器（包括GTPGTP结合蛋白等）结合系统。但受体功能的其他结合蛋白等）结合系统。但受体功能的其他方面则失去了。另外，膜内离子浓度梯度、方面则失去了。另外，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也失去了。但是，受体受体与细胞结构关系也失去了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构本身，而不是结合需要的是膜双层脂质结构本身，而不是细胞内其他组份。所以膜碎片内仍保留受体细胞内其他组份。所以膜碎片内仍保留受体的药理学特性。的药理学特性。细胞膜和细胞浆受体的制备一般都利用蔗糖细胞膜和细胞浆受体的制备一般都利用蔗糖密度梯度离心法分离不同的亚细胞组分。其优点密度梯度离心法分离不同的亚细胞组分。其优点是除去大部分杂蛋白，以减小非特异结合。为保是除去大部分杂蛋白，以减小非特异结合。为保证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意：证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意：全部过程在全部过程在0-40-4下进行操作。制备缓冲下进行操作。制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，液的蔗糖密度，离子强度，pHpH值及其它物质值及其它物质（如（如 EDTAEDTA，MgMg2 2）应严格控制。组织匀浆）应严格控制。组织匀浆条件应保持一致：一般先用高速分散器，后改用条件应保持一致：一般先用高速分散器，后改用玻璃匀浆器将细胞破裂。匀浆的时间、速度、温玻璃匀浆器将细胞破裂。匀浆的时间、速度、温度应尽量一致。离心的时间、速度、温度应保度应尽量一致。离心的时间、速度、温度应保持恒定。为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加持恒定。为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂。细胞组份的分离一般采用差速离心法。通过适当控制细胞组份的分离一般采用差速离心法。通过适当控制离心力及离心时间可使某些颗粒组份沉淀，而另一些保留离心力及离心时间可使某些颗粒组份沉淀，而另一些保留在上清液中。细胞组份的一般分离流程图见图在上清液中。细胞组份的一般分离流程图见图9 91515：l、粗膜制剂（、粗膜制剂（crude membranous preparation）冷冻的组织块切碎后加低渗缓冲液进行匀浆。低冷冻的组织块切碎后加低渗缓冲液进行匀浆。低速离心（速离心（800 3500 g）10 15分钟，上清波分钟，上清波再高速高心（再高速高心（1000030000 g）10 15分钟分钟（均在（均在 4下进行）。所得即为膜制剂或粗膜制下进行）。所得即为膜制剂或粗膜制剂。两次离心的目的是尽可能去除可溶性物质剂。两次离心的目的是尽可能去除可溶性物质（如内源性配基、（如内源性配基、GTP等），以免干扰结合分析。等），以免干扰结合分析。2、洗 膜 制 剂（、洗 膜 制 剂（w a s h e d m e m b r a n o u s preparation）有时，上述粗制剂经洗膜步骤后可）有时，上述粗制剂经洗膜步骤后可有效地进一步降低非特异结合及内源性配基的结有效地进一步降低非特异结合及内源性配基的结合。但洗膜过程必需防止受体蛋白的分解。目前合。但洗膜过程必需防止受体蛋白的分解。目前抑制受体蛋白分解作用的主要方法有：用新鲜抑制受体蛋白分解作用的主要方法有：用新鲜组织；低温状态下操作膜的制备；加蛋白酶组织；低温状态下操作膜的制备；加蛋白酶抑制剂。抑制剂。3 3、可溶性受体蛋白、可溶性受体蛋白 大多数跨膜受体大多数跨膜受体用用1 1（V VV V）TritonX-100TritonX-100能有效地能有效地将受体蛋白从双脂层中溶解出来，也有用将受体蛋白从双脂层中溶解出来，也有用DigitoninDigitonin或或Tween-80Tween-80等物质来溶解。溶等物质来溶解。溶解受体时常加蛋白酶抑制剂以保护可溶性解受体时常加蛋白酶抑制剂以保护可溶性受体蛋白不被水解。一般用受体蛋白不被水解。一般用100000 100000 g g的超速离心法分离可溶性和不可溶性的物的超速离心法分离可溶性和不可溶性的物质。所有操作都应在质。所有操作都应在4 4 下进行，以免受下进行，以免受体蛋白产生凝结、变性。假如受体蛋白还体蛋白产生凝结、变性。假如受体蛋白还需进一步纯化，常用特异的配基或抗体，需进一步纯化，常用特异的配基或抗体，以亲合层析法分离受体蛋白。以亲合层析法分离受体蛋白。三、结合反应的类型三、结合反应的类型 （）标记配基饱和法（）标记配基饱和法 （radioligand radioligand saturation methodsaturation method）它又分为单点他和及多点饱和法。它又分为单点他和及多点饱和法。1 1、单点饱和法、单点饱和法（Single point Saturation Single point Saturation methodmethod）定量受体制剂加大量的标记配基使定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体受体得以饱和结合。根据受体-配基复合物的放配基复合物的放射性计算受体结合容量（或结合位点数）。这射性计算受体结合容量（或结合位点数）。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出低，不能给出KDKD，误差也较大。，误差也较大。2 2、多点饱和法、多点饱和法（multi-point saturation multi-point saturation methodmethod）一定量的受体制剂，逐步增加标记配基的一定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量（一般量（一般7-87-8个实验点），使受体的结合趋于饱个实验点），使受体的结合趋于饱和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力（容量和亲和力（RTRT、KDKD），结果可靠性高。但），结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大，工作量大。受体标本、标记配基用量大，工作量大。如果在此类实验中，受体存在两种亚型，如果在此类实验中，受体存在两种亚型，而所选的放射配基对两种亚型又有一定选择性，而所选的放射配基对两种亚型又有一定选择性，则得到双位点饱和曲线，用双位点饱和曲线的则得到双位点饱和曲线，用双位点饱和曲线的数学模型可得到两种亚型的数学模型可得到两种亚型的RTRT和和KDKD。（二）非标记配基饱和法（二）非标记配基饱和法 一定量的受体制剂和标记配基，逐一定量的受体制剂和标记配基，逐渐增加非标记配基（一般渐增加非标记配基（一般7 78 8个实验点个实验点），使受体饱和结合，曲线拟合法或直），使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。线拟合法计算受体结合容量和亲和力。这种方法克服了多点饱和法标记配基用这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。配基比活度较高才能得到满意结果。四、分析条件的选择四、分析条件的选择（一）标记配基浓度（一）标记配基浓度 试验类型不同，选用的标记配基浓度也有不同。试验类型不同，选用的标记配基浓度也有不同。单点饱和试验要求饱和量的标记配基。对于多点饱单点饱和试验要求饱和量的标记配基。对于多点饱和试验，应尽可能覆盖饱和区及非饱和区，还应考和试验，应尽可能覆盖饱和区及非饱和区，还应考虑最低一点有足够的放射性满足放射性测量统计上虑最低一点有足够的放射性满足放射性测量统计上的要求，最高一点的浓度则往往要考虑配基的来源的要求，最高一点的浓度则往往要考虑配基的来源及价格。及价格。（二）受体浓度（二）受体浓度 一般说在一定范围内受体结合位一般说在一定范围内受体结合位点随组织量的增加而增加，特异性结合量与组织浓度点随组织量的增加而增加，特异性结合量与组织浓度成线性关系。在线性范围内，较高受体浓度，有时可成线性关系。在线性范围内，较高受体浓度，有时可增加特异性结合与非特异性结合的比值，有人提出，增加特异性结合与非特异性结合的比值，有人提出，受体浓度应选为约相当于受体浓度应选为约相当于KDKD值。在实践中，往往需要值。在实践中，往往需要通过实验来确定受体浓度。通过实验来确定受体浓度。（三）温育温度与时间（三）温育温度与时间 温度是影响反应速率的重要因素。温度高，结温度是影响反应速率的重要因素。温度高，结合快，达到反应平衡时间短，温度低，反应终止时合快，达到反应平衡时间短，温度低，反应终止时容易降温，减少分离过程中复合物的解离。另外，容易降温，减少分离过程中复合物的解离。另外，温度低对配基及受体的稳定性有利。不同受体结合温度低对配基及受体的稳定性有利。不同受体结合系统的最佳温度和时间要经过试验选定。系统的最佳温度和时间要经过试验选定。对于饱和或竞争取代试验，应要求反应达到平对于饱和或竞争取代试验，应要求反应达到平衡，故温育时间应足够长以达到平衡状态。温育温衡，故温育时间应足够长以达到平衡状态。温育温度与平衡时间是紧密相关的，不同的受体结合系统度与平衡时间是紧密相关的，不同的受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、温育温度、配基及受体的反应平衡时间因亲和力、温育温度、配基及受体浓度的不同而不同。一般室温（浓度的不同而不同。一般室温（2222）操作比较方）操作比较方便，但有人认为使用生理温度便，但有人认为使用生理温度37 37 更好。更好。00温育温育平衡时间虽然长一些，但其结果之重复性更好。平衡时间虽然长一些，但其结果之重复性更好。（四）缓冲液（四）缓冲液 结合分析使用过多种缓冲液，如磷酸盐缓冲液结合分析使用过多种缓冲液，如磷酸盐缓冲液，Tvrit-HCITvrit-HCI缓冲液等，所选缓冲液应不干扰结合，缓冲液等，所选缓冲液应不干扰结合，并在较大范围内可稳定并在较大范围内可稳定pHpH。一般说，结合分析的一般说，结合分析的pHpH应处于生理范围，即应处于生理范围，即pH7-8pH7-8。钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同。钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同的影响。因此要根据具体目的决定选用与否。如果的影响。因此要根据具体目的决定选用与否。如果加入的受体蛋白量较少时，宜在缓冲液加入适量蛋加入的受体蛋白量较少时，宜在缓冲液加入适量蛋白，使反应液内蛋白浓度为白，使反应液内蛋白浓度为mlml为好。为好。为了阻止肽类的降解，常在分析时加入各种肽为了阻止肽类的降解，常在分析时加入各种肽酶抑制剂。但要视具体是哪种肽而定，以确保实际酶抑制剂。但要视具体是哪种肽而定，以确保实际有效。因为有些蛋白酶抑制剂有抑制特异性结合的有效。因为有些蛋白酶抑制剂有抑制特异性结合的作用。作用。五、结合与游离配基的分离五、结合与游离配基的分离 受体受体-配基结合分析主要是测定反应平衡时结配基结合分析主要是测定反应平衡时结合配基的量，求解受体的密度与平衡解离常数。反合配基的量，求解受体的密度与平衡解离常数。反应一般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放应一般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。少数实验测定分离后的游离部分放射性。理射性。少数实验测定分离后的游离部分放射性。理论上，一经分离，反应的平衡就会被破坏，所以选论上，一经分离，反应的平衡就会被破坏，所以选择适当的分离方法和环境，使受体择适当的分离方法和环境，使受体-配基复合物在配基复合物在分离过程中的解离减少到最低限度。低温是降低解分离过程中的解离减少到最低限度。低温是降低解离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。常用的分离方法有离心法、过滤法、吸附法、常用的分离方法有离心法、过滤法、吸附法、透析法、电泳法等。若复合物解离快，则只能选择透析法、电泳法等。若复合物解离快，则只能选择快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温度等方面保持各样品管之间的一致性，以减少误差度等方面保持各样品管之间的一致性，以减少误差。（）抽滤法（滤膜法）（）抽滤法（滤膜法）此法应用十分广泛。此法应用十分广泛。1 1、选用的滤膜材料、选用的滤膜材料 既能阻挡复合物又不要过多产生对既能阻挡复合物又不要过多产生对游离标记配基的非特异性吸附。常用的滤膜是玻璃纤维滤膜，游离标记配基的非特异性吸附。常用的滤膜是玻璃纤维滤膜，比如上海虹光造纸厂生产的比如上海虹光造纸厂生产的4949或或6969型滤膜。型滤膜。2 2、影响因素、影响因素 （1 1）复合物的解离：）复合物的解离：一般说，低温时解离较慢，故滤膜一般说，低温时解离较慢，故滤膜及缓冲液应保存于低温。用冰冷缓冲液抽洗为好。及缓冲液应保存于低温。用冰冷缓冲液抽洗为好。（2 2）负压：若为多头抽滤器，应注意各孔压力的均一性。）负压：若为多头抽滤器，应注意各孔压力的均一性。3 3、减少标记配基对滤膜的吸附、减少标记配基对滤膜的吸附 标记配基吸附于滤膜是标记配基吸附于滤膜是抽滤法非特异性结合的主要来源之一。也是抽滤法的主要缺点抽滤法非特异性结合的主要来源之一。也是抽滤法的主要缺点，减少标记配基吸附于滤膜的方法有：滤膜预先用非标记配，减少标记配基吸附于滤膜的方法有：滤膜预先用非标记配基浸泡；如果是多肽或蛋白标记配基，用基浸泡；如果是多肽或蛋白标记配基，用1 1白蛋白或白蛋白或0.l0.l PEIPEI（polyethyleniminepolyethylenimine）浸泡；用一定量的淋洗液或保）浸泡；用一定量的淋洗液或保证一定淋洗次数，充分淋洗。证一定淋洗次数，充分淋洗。（二）离心法（二）离心法 这也是常用方法之一。很多受体分析建立之初都这也是常用方法之一。很多受体分析建立之初都用此法。对于用此法。对于KDKD大于大于1010-8-8mol/Lmol/L的受体，不宜选用滤膜的受体，不宜选用滤膜法分离。离心法可以在复合物很少解离的状态下达到法分离。离心法可以在复合物很少解离的状态下达到较好的分离效果，但非特异性结合较高。较好的分离效果，但非特异性结合较高。（三）吸附法（三）吸附法 上述分离方法均系分离后测定复合物的放射性。上述分离方法均系分离后测定复合物的放射性。但当研究可溶性受体时，如类固醇激素受体，上述方但当研究可溶性受体时，如类固醇激素受体，上述方法就不适合，可采用吸附法。固相吸附物有炭素、滑法就不适合，可采用吸附法。固相吸附物有炭素、滑石粉、葡聚糖衣活性炭等。其中以活性炭使用最多。石粉、葡聚糖衣活性炭等。其中以活性炭使用最多。目前，已广泛应用葡聚糖衣活性炭。它是在固相炭素目前，已广泛应用葡聚糖衣活性炭。它是在固相炭素上包一层葡聚糖，形成分子筛的作用，吸附小分子的上包一层葡聚糖，形成分子筛的作用，吸附小分子的游离配基。这种炭液有一定的粘性，易于离心沉淀，游离配基。这种炭液有一定的粘性，易于离心沉淀，分离效果好。分离效果好。第四节第四节 受体放射分析的数据处理受体放射分析的数据处理 受体放射分析所得测定数据都是放射性单受体放射分析所得测定数据都是放射性单位，如位，如cpmcpm，dpmdpm等，而受体分析没有标准品，不等，而受体分析没有标准品，不能通过标准曲线得到所需结果，只能靠数据换算能通过标准曲线得到所需结果，只能靠数据换算来解决。如换算成每毫克蛋白或来解决。如换算成每毫克蛋白或10105 5细胞所含受细胞所含受体数（通常以体数（通常以fmolfmol或受体分子数表示）或平衡解或受体分子数表示）或平衡解离常数（通常以离常数（通常以nmol/Lnmol/L表示）。另外，较多的受表示）。另外，较多的受体放射分析是各种多点法，实验得到的是若干点体放射分析是各种多点法，实验得到的是若干点的实测值，需要经过用一定的数学模型进行直线的实测值，需要经过用一定的数学模型进行直线或曲线拟合，才能得到所要的结果。所以受体放或曲线拟合，才能得到所要的结果。所以受体放射分析的数据处理包括两个方面，一是正确的单射分析的数据处理包括两个方面，一是正确的单位换算，二是各种手工或计算机的数据拟合。位换算，二是各种手工或计算机的数据拟合。一、单点饱和分析法的单位换算一、单点饱和分析法的单位换算 设测得复合物的放射性是设测得复合物的放射性是2000cpm2000cpm，则除以测，则除以测量效率成为量效率成为dpmdpm（除以（除以6060成为成为BqBq），再除以标记配），再除以标记配基的比活度（绝大多数受体以基的比活度（绝大多数受体以1 1：1 1关系与配基结合）关系与配基结合）就成为该标本中的受体量：就成为该标本中的受体量：设测量效率是设测量效率是 ，标记配基的比活度是，标记配基的比活度是 1.85 1.85 10101212BqBqmmolmmol，则标本中的，则标本中的 如果该标本的受体密度欲以每毫克蛋白计算，则如果该标本的受体密度欲以每毫克蛋白计算，则60 fmol60 fmol除以实测蛋白的毫克数即可。如果欲以每一除以实测蛋白的毫克数即可。如果欲以每一细胞所含受体数表示，则细胞所含受体数表示，则fmolfmol应进一步换算成受体应进一步换算成受体数。因为每数。因为每mmolmmol物质所含分子数是常数（物质所含分子数是常数（6.02 6.02 10102020或近似或近似 6 6 10 102020 ），所以），所以 标本所含受体分子数标本标本所含受体分子数标本 mmolmmol数数 6 6 10 1