双水相萃取以及固相萃取

这时目标物被较强的吸附在填料上，而杂质和基体物质不被吸附或仅有微弱吸附。为了增加 目标物的吸附，防止目标物的流失，溶解样品的溶剂的强度应该很弱，不至于起到洗脱液的 作用而将目标物冲出萃取柱。在反相固相萃取中，通常用水和缓冲液作溶解样品的溶剂，为 了增加有机物的溶解，可以在水相溶液中加入少量的有机溶剂（如不超过10%的甲醇）。为 了避免上样过程中目标物的流失，可以减少样品体积、增加填料量、用弱溶剂稀释样品或选 择对目标物吸附更强的填料SPE柱选定后可以通过实验测定出其对特定样品溶液的穿透体 积。若目标组分和基体组分都竞争吸附位置，则对于不同基体的样品溶液将观察到目标物不 同的穿透行为。在进行穿透实验时，选择目标物的浓度为实际试样中预期的最大浓度。最后 选定的上样体积（上样量）应该小于测定的穿透体积，以防止在后续洗脱杂质的操作步骤中 将目标物洗脱出来。干扰物洗脱通常用相对比较弱的溶剂（清洗剂）通过萃取柱，将弱保留的杂质或基体物质 洗脱出来，而目标物仍然保留在萃取柱中。对于反相固相萃取，通常用含适当浓度有机溶剂 的水（缓冲）溶液洗脱干扰物质。在此步骤中，应根据需要选择合适的洗脱液强度和洗脱体 积，尽可能多的将干扰物质洗脱掉。为了确定最佳清洗溶剂和体积，可以将样品上柱后，用 510倍柱床体积的清洗剂洗脱，并依次收集和分析流出物，得到清洗溶剂对目标物的洗脱 曲线。依次增加清洗溶剂强度，根据不同溶剂强度下的洗脱曲线，决定合适的清洗剂浓度和 体积。目标物洗脱操作是用相对较强的洗脱液，将吸附在萃取柱中的目标物全部洗脱出来,同时， 尽可能使部分强烈吸附在萃取柱上的杂质或基体物质仍然留在萃取柱上。关键还是选择合适 的洗脱液浓度和体积。可以加样于SPE柱上，改变洗脱液的强度和体积，测定目标物的回 收率，用以确定最佳洗脱溶剂的强度和体积。洗脱下来的样品可能对于后续分析而言浓度太 低，或者洗脱溶剂不适合后续分析，通常需将洗脱下来的样品溶液用氮气吹干（有与固相萃 取仪配套的浓缩仪），再用适合后续分析的溶剂进行复溶。对于以除去特定干扰物为目的的固相萃取操作，通常是干扰物较强的吸附在萃取柱上，而 目标物和大部分基体物质在萃取柱中不保留或者仅仅微弱保留。这时的操作程序就和上述步 骤有所不同，但分离的原理是相同的。以硅胶作为载体的固相萃取填料占多数，硅胶载体上的残余硅醇基具有不利的一面，但有 时也可以加以利用。硅胶载体的非极性固定相通常采用封尾技术将硅胶表面的残余硅醇基屏 蔽，但极性或离子交换固定相通常不封尾。封尾程度非常重要，因为残余硅醇基对化合物的 保留和洗脱起着不可忽视的作用。即使采用最严格的封尾方法，也只能将键合相形成后剩余 的硅醇基团的70%封住。因此，那些残余硅醇基还会在待测组分的分离中发挥作用。残余硅醇基的作用表现在：在pHv2时，硅醇基不带电荷；pH2时,硅醇基逐渐离解而带 负电荷，从而影响萃取。静电相互作用比疏水相互作用更强，因此，如果存在混合保留机理， 必须采取措施减小或扩大残余硅醇基的影响。例如，固相萃取法萃取胺时，带正电荷的胺与 带负电荷的硅醇基形成非共价键，很难离解。为了降低硅醇基的影响，最好选择封尾的固定 相。残余硅醇基可用三乙胺或醋酸铵等竞争碱来屏蔽。残余硅醇基有时可以利用。使用没有封尾的固定相和pH4的缓冲溶液以保证残余硅醇 基离子化。推荐采用缓冲溶液作为二级调节溶剂是因为水的pH是波动的，而且没有缓冲能 力。一个利用残余硅醇基的实例是血浆中舒喘宁测定的样品预处理。采用未封尾的硅胶萃取 小柱，先用甲醇和水活化萃取柱，血浆流经萃取柱，戴正电荷的输出安宁通过与贵春季的相 互作用而被萃取在柱上。先用水然后用乙腈冲洗固定相以消除有可能，最后用含有0.5%醋 酸铵的甲醇溶液将舒喘宁从萃取柱上洗脱下来，作为后续分析的样品。如果从相互作用的角度来考虑溶质与固定相之间的作用，可以认为待测组分通过氢键、偶 极-偶极相互作用、疏水相互作用等机理保留到固定相上。在萃取中，这些作用机理可能单 独存在，也可能多种分离机理同时存在。了解是哪些力在起作用，有利于制订特效的分离方 法。各种键合力的能量相差较大：疏水键合能（偶极-偶极、偶极-诱导偶极、扩散相互作用） 为110kcal/mol；极性基团间的氢键为510kcal/mol,这种类型的相互作用在硅胶表面发生 的机会较多；相反电荷间的离子或静电相互作用为50200kcal/mol。有机高分子聚合物填料在固相萃取中也常常用到。溶质与这种填料也是利用范德华力、氢 键、离子相互作用、偶极-偶极相互吸引等机理进行分离的。与硅胶载体的固定相相反，有 机聚合物固定相没有由硅烷醇或痕量金属引起的附加效应干扰待测组分在固定相表面的吸 附。非极性物质，如脂肪、蜡、碳氢化合物、类脂类和芳香类化合物，可以强烈地吸附在这 类固定相上，如果采用温和的洗脱条件，上述非极性物质可以与极性或离子性污染物分离。 如果抑制离子型化合物的离解，使它们成为“电中性”的，它们也能在有机聚合物萃取柱上 保留，然后通过改变淋洗液的pH将它们从洗脱柱上洗脱下来。5.5.3固相萃取的应用近年来随着生物医药等学科的快速发展,固相萃取这一新的样品前处理技术得到了飞速发 展，在药物、临床、食品和环境分析等诸多领域都有应用。例如，环境水样中有机物含量低， 采用传统的溶剂萃取不仅误差大，而且操作繁琐，若采用SPE进行富集，简单有效，而且 节省溶剂。目前美国标准方法（EPA）已经允许采用SPE法代替溶剂萃取作为水样前处理方 法，富集水样等环境样品中的微量有机污染物。又如在生物样品分析中，大量蛋白质的存在 会干扰后续分析，必须预先除去，多数情况下采用C18柱即可分离蛋白质，目标组分的回 收率大多能达到80%以上。5.5双水相萃取随着生物化学工程等新型学科的发展，一些含量微小、具有生理活性又极有价值的生物物质 的分离提纯成了十分关键的技术课题。换句话说，生物化学工程的发展在很大程度上依赖于 生物分离技术的开拓和发展。例如，生物界已经存在的酶有2500种之多，但又有100多种 酶的工业性分离提取有过文献报道。显而易见，生物工程的产品分离问题，即生物工程的下 游技术的开发是极为重要的。众所周知，生物物质多是有生理活性的。使用常规的分离技术 来处理这类对象往往会带来处理量小、流程长、易失活、收率低和成本高等缺点。开发新型 的生物物质分离技术，使其适应于一定的生产规模，且经济简便、快速高效，是十分迫切的 要求。双水相萃取正是作为这类新型分离技术应运而生的。早在1896年，Beijerinek在把明胶和琼脂或可溶性淀粉混合时发现，两种亲水性的高分子 聚合物并非混为一相，而是出现了两个水相旳成相现象，这种现象称为聚合物的“不相容性” 20世纪60年代，研究者们开始提出了双水相萃取技术，利用双水相成相现象及待分离物质 在两相间所具有的分配系数，来实现分离提纯的目的。20世纪70年代，一些研究者开始进 行了双水相萃取的应用性研究，这类研究是从发酵液中提取各种酶的实验开始的。十多年来，双水相萃取技术取得了较大的发展，它的研究及应用领域已经逐步扩展，可对 于各种酶、核酸细胞、蛋白质、细胞器和菌体进行分离。已有的研究成果表明，双水相萃取 技术是一种具有独特性能、针对性很强的、有前途的分离技术。5.5.1双水相体系5.5.1.1双水相体系双水相旳成相现象实际上是由于亲水高聚物之间的不相容性造成的。绝大多数天然的或合 成的亲水性高聚物的水溶液在与第二种亲水性高聚物混合时，超过一定的浓度范围就能产生 两相，两种高聚物则分别溶于互不相溶的两相中，形成所谓的“双水相体系” 一般认为， 由于高聚物之间的不相容性，即高聚物分子的空间阻碍作用，使之相互无法渗透，出现分离 的倾向。当满足一定的成相条件时，即可分为两相。近年来，又发现某些高聚物溶液有分离 的倾向、某些高聚物溶液与一些无机盐溶液相混合时，同样会在一定的浓度下形成双水相体 系。这就是高聚物/无机盐双水相体系。目前，许多研究者仍致力于双水相成相机理的研究， 现仍无十分成熟的理论。常见于生物产物分离的高聚物/高聚物双水相体系有乙二醇（PEG）/葡萄糖（dextran），高 聚物/无机盐体系有PEG/磷酸盐和PEG/硫酸盐体系。以PEG/dextran体系为例，图5-36所给出的体系相图可以直观的表示出体系的成相条件。 PEG、dextran高聚物和水均可无限混溶。但是，当体系的组成在图5-36中的曲线上方时 （M点所示），体系就可以分为两相，两相的组成和密度均不同，上相（或称轻相）组成以 点表示，主要组成为PEG；下相（或称重相）组成用B点表示，主要组成为dextran。相图 中曲线TCB称作结线，直线TMB称作系线。十分明显，体系总组成处于系线TMB之上时, 分相后的上相及下相组成均为T和B.如果体系的总组成处于结线TMB的下方，则不满足成 相条件，体系呈均一的单相。5.5.1.2双水相萃取及其特点双水相萃取从原则上讲与一般萃取有共同之处。在满足成相的条件下，待分离物质若在两 个水相之间存在分配的差异，就可能实现分离提纯。在常用的双水相萃取体系中，各种细胞、噬菌体等的分配系数或大于100，或小于0.01，蛋白质（如各类酶）的分配系数在0.110之间，无机盐的分配系数则一般在1.0左右。这些 不同物质分配系数的差异，构成了双水相萃取分离的基础。 双水相萃取的主要分离对象一般是具有生理活性的生物物质。采用一般溶剂萃取的方法 可能会造成失活而使收率大幅度下降。双水相体系中水的含量高达70%90%，组成双水相 体系的高聚物PEG、dextran和无机盐等对于生物活性物质如酶、核酸等无毒害，不会造成 生理活性旳质的失活和变性。有时，有的物质还可能起到稳定和保护生物活性的作用。 双水相萃取可以直接从含菌体的发酵液或培养液中直接提取所需要的蛋白质。根据不同 物质在双水相体系中分配系数的差异，可以在不经破碎的条件下操作，直接提取胞内酶。通常的生产工艺中，从发酵液中分离酶一般采用加入大量（NH4）2CO3使酶盐析出来的方 法。此后，连同菌体和其他固体物一起过滤，滤饼加热烘干制成酶粉。这类工艺不仅过滤速 度慢、效率低，而且失活也比较严重，所制得的酶制剂为含菌体、盐类及其固体的粗制酶, 总收率一般在75%左右。目前采用双水相萃取分离纯化酶，纯化系数（组分在两相中浓度 比值之比）为18左右，收率在90%以上，优点十分明显。 双水相萃取的操作与通常的溶剂萃取相似。所用设备可以选用柱式萃取设备、混合澄清 槽和离心萃取器等。这一操作便于连续进行、处理量可以较大。5.5.2双水相分配原理两种聚合物溶液或一种聚合物与一种小分子物质互相混合时，是否会形成双水相，取决于 混合熵增和分子间作用力两个因素。混合是自发的熵增过程，而分子间相互作用力则随着相 对分子质量的变大而增强。两种物质混合时熵的增加与所涉及的分子数目有关，经计算，小分子间与大分子间的混合 熵增相同，而分子间作用力可看做分子中各基团间相互作用力之和。对两种高分子聚合物的 混合，分子间的作用力与分子间的混合熵相比占主要地位，分子越大，作用力也越大。当两 种聚合物所带电荷相反时，聚电解质之间混合均匀不分相；若两种聚合物分子间有相互排斥 作用，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，达到平衡时，会形成分别富 含不同聚合物的两水相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容 性。除双聚合物系统外，基于盐析作用原理，聚合物与无机盐的混和溶液也能形成双水相。（1）双水相系统 可形成双水相的双聚合物体系很多，典型的双水相系统列于表5-13中， 其中A类为两种非离子型聚合物；B类其中一种为带电荷的聚电解质；C类两种都为聚合 物电介质；D类为一种聚合物与一种低分子物质（无机盐、有机盐）组成。在双水相萃取中，常采用双聚合物系统为PEG/葡聚糖，该系统的上相富含PEG，下相富 含葡聚糖；常用的聚合物/无机盐双水相系统有PEG/磷酸钾、PEG/硫酸铵、PEG/硫酸钠等， 其上相富含PEG，下相富含无机盐。A、D两类聚合物为多元醇、多元糖结构，能使生物大分子稳定，且无毒性，已被许多国 家的药典所收录，因此，这两类在生物制品分离应用较多。对高聚物高聚物体系操作比较 容易，且变性作用少，界面吸附少；而聚合物-无机盐体系由于高浓度的盐废水不能直接排 入生物氧化池，使其可行性受到环保的限制，且某些生物物质会在这类体系中失活。（2）双水相组成的定量关系双水相组成条件和定量关系可用相图表示，由两种聚合物 和水组成的体系，其相图如图5-37所示。若聚合物Q的浓度以纵坐标表示，聚合物P的浓度以横坐标表示，当体系的总浓度在图 5-37中所示的曲线以下时，体系为单一的均相，只有达到一定浓度时才会形成两相。图5-37 中曲线把均匀区域和两相区域分隔开来，称为双节线。在双节线下面的区域是均匀的，在上 面的区域为两相区。例如点M代表整个系统的组成，该系统实际上有两相组成，M、T、B 三点在一直线上，T和B代表呈平衡的两相，上相和下相分别由点T和B表示，在同一条 线上的各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同，结线的长度是衡量两相间相对差别 的尺度，结线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当体系的总浓度在曲线上方时, 体系分为两相，若上相（轻相）的组成用T表示，下相（重相）的组成用B表示，曲线TCB 称为双节点曲线。即T和B相质量之比等于结线上MB与MT的线段长度之比。当体系的 总组成由M变到M 时，两相的组成变为T 和B体系组成差变小。当结线长度趋向 于零时，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1,因此C点称为临界点，在此 浓度下，体系为单一的均相。以VE、VF分别代表上相和下相体积，则点之间的距离服从杠杆定律：匕FV FCE 二V ECF又由于两相的密度与水相近，故上、下相体积之比也近似等于结上MB和MT线段长度 之比。温度的变化可以引起双结节点曲线的位置和形状的变化，也能引起临界点的位移。如 果用盐来代替某一个聚合物，也可得到类似的相图（图538）。影响生物物质在双水相系统中分配的因素很多，主要有：组成相系统的聚合物种类、结构、 平均分子量、浓度；系统中所加盐的种类、浓度、电荷等；被分配物质的分子大小、形状、 荷电性；温度、pH等环境因素。（3）双水相系统中的作用力 已有大量研究表明，生物分子的分配系数（表514）取 决于溶质与双水相系统间的各种相互作用力，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等，其 分配系数可为各种相互作用之和：lnKp-lnK+lnKs+lnKA式中，Kp为总分配系数；Ke，Ks，KA分别为静电作用、疏水作用、亲和作用对溶质分 配系数的贡献。 静电作用 双水相体系中常含有缓冲溶液和无机盐等电解质，这些荷电溶质的存在会导 致溶质在两相中分配浓度的差异，由此在两相间产生电位差，常称为唐南电位。从相平衡热 力学理论推导溶质的分配系数Kp表达式为：FZlnK = lnK +A申P 0 RT式中，K0为溶质静电荷为零时的分配系数；F为法拉第常数；Z为溶质的静电荷数；为相间电位差。由式（5186）克制，荷电溶质分配系数的对数与溶质的静电荷数成正比。在另一方面， 分配系数因荷电的正负离子、荷电数而异，如图539所示为5.8%PEG6000和 804%dextran500所组成的双水相系统，在20C时，含有不同负离子的无机盐其电荷对分配 系数产生影响。由于各种相应保持电中性，因而在两间形成电位差，这对带电生物大分子，如蛋白质和核 酸等的分配，产生很大影响。在pH=6.9时，溶菌酶带正电，而卵蛋白带负电。当NaCl的 浓度低于60mmol/L时，上相电位低于下相，因而使溶菌酶的分配系数增大，而卵蛋白的分 配系数减小。 疏水作用某些大分子物质的表面具有疏水区，疏水区所占比表面积越大，疏水性越 强。因此，双水相系统中，两种组分的表面疏水性差异使各自在系统的两相中产生相应的分 配平衡。对于等电点双水相系统中，氨基酸的分配系数可用以下公式计算：