园林植物育种学第9章植物组织培养技术及其在育种中的应用ppt课件

植物组织培育技术是现代植物植物组织培育技术是现代植物生物技术的根本技术。生物技术的根本技术。一生物技术概念一生物技术概念 生物技术生物技术Biotechnology)，有时也，有时也称生物工程称生物工程Bioengineering,是指人们是指人们以现代生命科学为根底，结合先进的工程以现代生命科学为根底，结合先进的工程技术手段和其他根底科学的原理，按照预技术手段和其他根底科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综合人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已胜利地运用于植性学科。现代生物技术已胜利地运用于植物育种中。物育种中。l基因工程基因工程Gene Engineeringl细胞工程细胞工程Cell Engineering l酶工程酶工程Enzyme Engineering l发酵工程发酵工程Fermentation Engineering l蛋白质工程蛋白质工程Protein Engineering 细胞工程就是在细胞程度研讨开发、利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改动细胞的遗传根底，经过无菌操作，大量培育细胞、组织乃至完好个体的技术。l分别基因的技术；分别基因的技术；l扩增基因的技术；扩增基因的技术；l将单一细胞扩增成细胞群体的技术；将单一细胞扩增成细胞群体的技术；l将一个生命体复制成一个与之完全一样将一个生命体复制成一个与之完全一样的新个体的过程；的新个体的过程；l将单一个体扩增成一个遗传上完全一样将单一个体扩增成一个遗传上完全一样的群体。的群体。l一个遗传上来源完全一样的生物群体。一个遗传上来源完全一样的生物群体。1、植物细胞的全能性、植物细胞的全能性Cell Totipotency 一个植物细胞能产生一个完好植株一个植物细胞能产生一个完好植株的固有才干称之为细胞的全能性。的固有才干称之为细胞的全能性。2、植物离体分化的类型、植物离体分化的类型无菌短枝型无菌短枝型丛生芽增殖型丛生芽增殖型器官发生型器官发生型胚状体发生型胚状体发生型原球茎发生型原球茎发生型3、植物组织培育的特点、植物组织培育的特点培育资料经济；培育资料经济；培育条件可人为控制；培育条件可人为控制；生长周期短，繁衍率高；生长周期短，繁衍率高；管理方便，利于自动化控制。管理方便，利于自动化控制。5、植物组织培育的根本操作、植物组织培育的根本操作无菌操作技术无菌操作技术细胞培育技术细胞培育技术原生质体交融技术原生质体交融技术v接种器具的灭菌接种器具的灭菌v 接种前，必需把器具放入接种室或接种前，必需把器具放入接种室或箱内，初用接种室或箱时要用甲醛普箱内，初用接种室或箱时要用甲醛普通市售分析纯的有效成份为通市售分析纯的有效成份为 36-38%熏熏蒸蒸5小时以上再开紫外光灯照射小时以上再开紫外光灯照射40-60分分钟，以后在每次接种之前，把要接种的钟，以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入接种室箱内，用试管或三角瓶放入接种室箱内，用5%的煤酚瓶皂溶液即来苏尔普通市售的煤酚瓶皂溶液即来苏尔普通市售的有效成份为的有效成份为47-53%或或 5%的石灰炭的石灰炭酸液喷雾消毒，再翻开紫外光灯照酸液喷雾消毒，再翻开紫外光灯照20-40分钟，这样消毒后，再经分钟，这样消毒后，再经30-40分钟便可分钟便可进展接种。进展接种。v接种资料的外表灭菌接种资料的外表灭菌v 接种前花蕾或穗的彻底灭菌是杜绝接种前花蕾或穗的彻底灭菌是杜绝污染的主要关键，先用污染的主要关键，先用70-75%的酒精浸泡的酒精浸泡10-15秒钟或用酒精棉球擦两遍，初步杀死秒钟或用酒精棉球擦两遍，初步杀死外表所带的微生物，放在外表所带的微生物，放在10%的漂白粉液的漂白粉液或饱和漂白粉液中浸泡或饱和漂白粉液中浸泡15-30分钟杀菌，然分钟杀菌，然后用无菌水冲洗后用无菌水冲洗2-3次。次。v 消毒过的穗子或花蕾用消毒纱布包消毒过的穗子或花蕾用消毒纱布包好，待取花药接种，留意，穗子或花蕾的好，待取花药接种，留意，穗子或花蕾的操作要在无菌条件下进展。操作要在无菌条件下进展。5、植物组织培育所需营养与环境条件、植物组织培育所需营养与环境条件1无机营养无机营养大量元素：大量元素：普通是指浓度大于普通是指浓度大于0.5mmol/L.氮氮(N)、磷、磷(P)、钾、钾(K)、钙、钙(Ca)、镁、镁(Mg)、硫硫(S)。微量元素：微量元素：包括铁包括铁(Fe)、铜、铜(Cu)、钼、钼(Mo)、锌锌(Zn)、钠、钠(Na)、锰、锰(Mn)、钴、钴(Co)、硼、硼(B)、碘、碘(I)。2有机营养有机营养维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。3生长调理物生长调理物生长素：生长素：2，4-D、奈乙酸、奈乙酸(NAA)、吲哚丁、吲哚丁酸酸IBA、吲哚乙酸、吲哚乙酸(IAA)。细胞分裂素：激动素细胞分裂素：激动素KT、6-苄基氨基苄基氨基嘌呤嘌呤6BA、玉米素、玉米素ZT。赤霉素赤霉素GA：零落酸：零落酸ABA、乙烯利、乙烯利CEDP。4琼脂琼脂5能源和浸透压能源和浸透压6其他成分其他成分7温度温度8光照光强、光质光照光强、光质培育基的配制：培育基的配制：培育基母液的配制培育基母液的配制；配制培育基的步骤；配制培育基的步骤；培育基的分装及灭菌。培育基的分装及灭菌。6、植物组织培育阅历的五个阶段：、植物组织培育阅历的五个阶段：1预备阶段预备阶段外植体的获得；外植体的获得；接种资料的消毒处置；接种资料的消毒处置；配制适宜的培育基；配制适宜的培育基；2诱导去分化阶段诱导去分化阶段3继代增殖阶段继代增殖阶段4生根成芽阶段生根成芽阶段5移栽成活阶段移栽成活阶段种质资源维护；种质资源维护；优良种类快速繁衍；优良种类快速繁衍；诱发和离体挑选突变体；诱发和离体挑选突变体；抑制远缘杂交困难；抑制远缘杂交困难；抑制种子发育中的妨碍；抑制种子发育中的妨碍；单倍体育种的技术环节单倍体育种的技术环节基因工程的根底技术基因工程的根底技术l单倍体的概念及其特点单倍体的概念及其特点l 只含有一套染色体组的生物体；只含有一套染色体组的生物体；l 被子植物的配子体世代。被子植物的配子体世代。矮小性；矮小性；不育性；不育性；全显性。全显性。l单倍体植物的直接利用；单倍体植物的直接利用；l抑制杂种分别，缩短育种年限；抑制杂种分别，缩短育种年限；l快速获得异花授粉植物的自交系；快速获得异花授粉植物的自交系；l单倍体植物的诱变育种；单倍体植物的诱变育种；l抑制远缘杂种不孕性与不稳定的景象；抑制远缘杂种不孕性与不稳定的景象；1单倍体资料的采集单倍体资料的采集 单倍体育种的首要问题是如何获得大单倍体育种的首要问题是如何获得大最的单倍体植株。据现有的研讨资料，用最的单倍体植株。据现有的研讨资料，用花药培育产生单倍体植株有两个途径花药培育产生单倍体植株有两个途径:第一是在离体培育的花药中，花粉经第一是在离体培育的花药中，花粉经过类似胚胎发育的过程直接构成单倍体植过类似胚胎发育的过程直接构成单倍体植物，如烟草、曼陀罗等。物，如烟草、曼陀罗等。第二是在离体培育的花药中，花粉构第二是在离体培育的花药中，花粉构成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体成愈伤组织，再从愈伤组织分化出单倍体植株。植株。2花药的接种花药的接种接种前的预备任务接种前的预备任务 接种和培育花药是在无菌条件下接种和培育花药是在无菌条件下进展的，所用的一切器具必需彻底灭进展的，所用的一切器具必需彻底灭菌。菌。花粉发育时期的鉴定花粉发育时期的鉴定 适宜的花粉发育时期对于提高花适宜的花粉发育时期对于提高花粉诱导愈伤组织分化的频率是很重要粉诱导愈伤组织分化的频率是很重要的，为此，进展花药培育前，要用显的，为此，进展花药培育前，要用显微镜进展花粉发育时期的鉴定。微镜进展花粉发育时期的鉴定。经显微镜检查后，把花粉细胞的经显微镜检查后，把花粉细胞的发育进期与花药或花序的外部形状联发育进期与花药或花序的外部形状联络起来，找出花粉单核期或单核期的络起来，找出花粉单核期或单核期的花蕾或花序的外部形状标志选取花药花蕾或花序的外部形状标志选取花药进展接种培育。进展接种培育。向上，否那么会影响生长，同时在转移时，向上，否那么会影响生长，同时在转移时，就防止沾带过多的培育基。就防止沾带过多的培育基。l处置方式：处置方式：l试管内进展；试管内进展；l花粉植株定植后进展；花粉植株定植后进展；l药剂处置；药剂处置；l植株鉴定。植株鉴定。二原生质体培育与体细胞杂交二原生质体培育与体细胞杂交 常规杂交育种由于物种间难以跨越常规杂交育种由于物种间难以跨越的天然屏障而举步维艰。的天然屏障而举步维艰。科学家们受细科学家们受细胞全能性实际及组织培育胜利的启示，胞全能性实际及组织培育胜利的启示，逐渐将目光转向细胞交融，试图经过这逐渐将目光转向细胞交融，试图经过这种崭新的手段冲破自然界的禁锢。种崭新的手段冲破自然界的禁锢。原生质体的概念原生质体的概念 植物细胞原生质体是指那些以去植物细胞原生质体是指那些以去除全部细胞壁的细胞。除全部细胞壁的细胞。此时，细胞外仅此时，细胞外仅由细胞膜包裹，由细胞膜包裹，呈圆形只需在高渗溶液呈圆形只需在高渗溶液中才干相对稳定。中才干相对稳定。原生质体经适当处置，可与其他细原生质体经适当处置，可与其他细胞交融成新的体细胞。胞交融成新的体细胞。比完好的细胞更容易获得外来遗传物质，比完好的细胞更容易获得外来遗传物质，为实现异源遗传物质转化提供了较好的为实现异源遗传物质转化提供了较好的实验资料。实验资料。原生质体在一定条件下可以交融成杂种原生质体在一定条件下可以交融成杂种细胞，开辟了一条新的育种途径。细胞，开辟了一条新的育种途径。1892，J.A.Klerker 用机械法获得原生质体；用机械法获得原生质体；1960，E.C.Cocking 用酶法首先从番茄根尖中分别出用酶法首先从番茄根尖中分别出大量有活性的原生质体并经过培育再生出细胞壁大量有活性的原生质体并经过培育再生出细胞壁构成再生植株构成再生植株;1960，G.Barski发现发现,题细胞原生质体能交融在一同题细胞原生质体能交融在一同构成单核的、并能进展分裂的杂种细胞；构成单核的、并能进展分裂的杂种细胞；1972，P.S.Carlon初次获得烟草体细胞种间杂种。初次获得烟草体细胞种间杂种。80s 此项技术在我国得到开展。此项技术在我国得到开展。l4.原生质体的制备原生质体的制备l1取材与灭菌取材与灭菌l2酶解酶解(纤维素酶、半纤维素酶、果胶纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶酶)l3分别分别 沉淀法、漂洗法、滴洗法沉淀法、漂洗法、滴洗法l4洗涤洗涤l5鉴定形状观测、活性鉴定鉴定形状观测、活性鉴定原生质体的培育：原生质体的培育：细胞壁再生；细胞壁再生；细胞分裂；细胞分裂；植株再生。植株再生。l5.原生质体的交融原生质体的交融l化学法诱导交融化学法诱导交融l按比例混合双亲原生质体按比例混合双亲原生质体-l滴加滴加PEG-l滴加高钙高滴加高钙高PH值溶液值溶液-l洗涤原生质体溶液洗涤原生质体溶液-l离心获得原生质体溶液离心获得原生质体溶液-l挑选杂种细胞挑选杂种细胞-l再生杂种细胞。再生杂种细胞。v物理法诱导交融物理法诱导交融l根本程序：根本程序：l原生质体的获得；原生质体的获得；l电击交融；电击交融；l挑选杂种细胞；挑选杂种细胞；l杂种细胞再生和完杂种细胞再生和完好植株的构成。好植株的构成。6.交融细胞的培育鉴定与挑选交融细胞的培育鉴定与挑选杂和细胞的显微镜鉴别；杂和细胞的显微镜鉴别；互补法鉴定杂和细胞；互补法鉴定杂和细胞；细胞与分子生物学法；细胞与分子生物学法；植株形状的鉴别。植株形状的鉴别。三人工种子三人工种子 人工种子即人为制造的种子，它人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素、及其他成分的人工胶囊。分、激素、及其他成分的人工胶囊。其具有种子的功能，可直接用于田间其具有种子的功能，可直接用于田间播种。播种。1、人工种子的构成 人工种皮 胚 状 体 人工胚乳2、人工种子的特点：、人工种子的特点：1可以不受环境条件的限制，周年进展消费；可以不受环境条件的限制，周年进展消费；2经人工无性繁衍产生，有利于保管该种系经人工无性繁衍产生，有利于保管该种系 的优良性状；的优良性状；3本钱低，适于田间机械化消费；本钱低，适于田间机械化消费；4可根据需求调理胚乳成分。可根据需求调理胚乳成分。3、人工种子的制备、人工种子的制备1胚状体的制备及其同步生长；胚状体的制备及其同步生长；2人工胚乳的制备；人工胚乳的制备；3配制包埋剂及人工包埋。配制包埋剂及人工包埋。人工种子包埋表示图人工种子包埋表示图 4%海藻酸钠海藻酸钠 体细胞胚体细胞胚 包埋丸包埋丸 2%CaCl 人工种子人工种子 水水 4、人工种子的储存与萌生、人工种子的储存与萌生 低温、枯燥、干净。低温、枯燥、干净。一基因工程的含义 按照人们的愿望，进展严密的设计，经过体外 DNA重组技术 和DNA转移技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在短时间内趣于完善，发明出新的生物类型。致癌农杆菌介导的致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法质粒载体转化法2、重组、重组DNA的直接转化法的直接转化法微粒散射技术微粒散射技术 (Particle bombardment)二基因工程的根本步骤1、目的基因的克隆与鉴定；2、植物表达载体的构建；3、植物的遗传转化；4、转化细胞的挑选；5、转基因植株的鉴定。基因基因基因克隆基因克隆基因转化基因转化DNA重组技术重组技术植物遗传转化技术植物遗传转化技术植物组织培育技术植物组织培育技术1.DNA1.DNA遗传标志的特点：遗传标志的特点：数量极多；数量极多；遗传上稳定；遗传上稳定；排除了环境差别排除了环境差别.v构建遗传图谱；构建遗传图谱；v分析亲缘关系；分析亲缘关系；v定位农艺性状；定位农艺性状；v分子标志辅助选择；分子标志辅助选择；v种质资源及杂种后代的鉴定。种质资源及杂种后代的鉴定。RFLP Restriction fragment length polymorphismsRAPDAFLPSSRSSLP