海巴戟天乙醇提取物对伤口愈合的价值

其他诺尼的保健功效一国际最新研究进展论文集Evidence-based Complementary and Alternative Medicine,2009, 6（3）: 351 -56.海巴戟天乙醇提取物对伤口愈合作用的评价海巴戟天乙醇提取物对伤口愈合作用的评价B. Shivananda Nayaka, Steve Sandiforda and Anderson Maxwellb（a西印度群岛大学医学院生物化学系临床专业，特立尼达；b西印度群岛大学生命科学院化学系生命科学专业，特立尼达）海巴戟天（诺尼）是最重要的传统波利尼西亚药用植物之一。这种植物的叶子 的最原始用途是作为一种治疗伤口愈合外用药物。诺尼叶子的乙醇提取物（150mgkg-i, day-i）被用以评估对鼠类伤口愈合的作用，使用切除手术和死腔伤 口模型。动物被随机分成 2 组，每组六个。试验组动物饮用掺入诺尼乙醇提取物 的混合饮用水，对照组动物饮用普通水。根据伤口的收缩速度、上皮化时间、肉 芽组织重量及羟基脯氨酸含量等指标，对治疗效果进行评估。实验组动物在第 11天伤口面积表现出了71的减少，而对照组仅表现出了57的减少。相对于 对照组（P 0.002），实验组在死腔伤口位置的肉芽组织重量和羟脯氨酸含量也 显著增加。促进伤口的收缩，上皮形成时间减少，羟脯氨酸含量的增加和组织学 特征表明，诺尼叶提取物在伤口愈合方面可能具有治疗作用。关键词：切除手术和死腔伤口、羟脯氨酸、诺尼、伤口愈合引言伤口愈合分三个阶段：炎症，分芽繁殖和重塑。分芽繁殖期的特征是血管生 成，胶原沉积，肉芽组织的形成，上皮形成和伤口收缩。在血管生成阶段，新生 血管在内皮细胞中生长。在纤维组织增生和肉芽组织的形成阶段，成纤维细胞通 过分泌胶原蛋白和纤维连接蛋白生长并形成一个新的、临时的细胞外基质。支撑 细胞外组织的主要成分胶原蛋白，含有大量的羟脯氨酸，这一直是用于作为胶 原组织的一个生化标记1。在上皮形成阶段，上皮细胞在伤口表面扩散和蔓延。 成肌纤维细胞收缩导致伤口的收缩。血小板释放生长因子和其它细胞因子2。虽 有足够和适当的照料但伤口仍不愈合的属于慢性伤口，这些伤口的处理是困难和 令人沮丧的3。目前用于治疗慢性伤口的清创、冲洗、抗生素处理、组织移植和 蛋白水解酶等方法具有重大缺陷和有害的副作用。海巴戟天（茜草科），也被称为诺尼或巴戟天，是一种常绿小乔木。叶子为 8-10 英寸长，椭圆形，深绿色，有光泽，纹理较深。传统的波利尼西亚医师使用 植物的某一部分用于治疗包括肠病在内的一些疾病4。海巴戟天一直因为用途广 泛备受推崇，包括关节炎，动脉粥样硬化，膀胱感染，脓疮，烧伤，癌症，慢性 疲劳综合征，循环系统虚弱，容易感冒，感冒疮，充血，便秘，糖尿病，药物成 瘾，眼睛发炎，发烧，骨折，胃溃疡，牙龈炎，头痛，心脏疾病，高血压，免疫 力低下，消化不良，肠道寄生虫病，肾脏病，疟疾，月经不调，口舌生疮，呼吸 系统疾病，癣，鼻窦炎，扭伤，中风，皮肤发炎，伤口等 4-5。这种植物的叶子 的最原始用途是作为一种治疗局部伤口愈合。一些动物研究表明，诺尼有防癌6-7， 提高免疫力8和缓解疼痛的作用9。最近高岛等人10证明了从诺尼叶中分离出来 的新成分的药用用途。诺尼叶粗提取物已被用于传统上的促进伤口愈合。但是没 有伤口愈合过程中诺尼所起作用的相关论文实验数据。在这篇文章中，我们首次 报告了诺尼果提取物在治疗伤口过程中的疗效。1、方法1.1 植物原料诺尼叶 2006 年 4 月采集于特立尼达岛，鉴定者为来自圣奥古斯丁，西印度 群岛大学，特立尼达和多巴哥的国家标本馆的植物分类学家和策展人 Yasmin S 女士。凭单试样存放在植物标本室（样本数：36456）。1.2 萃取诺尼叶（200 克），用水洗涤，在空气中干燥，并在一个电动搅拌器中搅拌 为粉末。然后取 180 克粉末在室温条件下悬浮在 200ml 乙醇中 20 小时。使用平 纹细布加滤纸（Whatmanl号）过滤该混合物。将滤液置于40度烘箱中干燥， 清晰的所得残余物将用于本研究。萃取物将用于进行初步的植物化学分析。l.3 植物化学物质筛选方法1.3.1 皂甙提取物（300mg）,用5ml的水煮沸2分钟；混合物冷却，剧烈混合并静置3 分钟。泡沫状物质的行程表示存在皂貳】。1.3.2 单宁取lml提取物（300mg每毫升）加入到2ml的氯化钠（2% ）中，过滤并用5ml 1%的明胶溶液混合。有沉淀物形成表示存在单宁111。1.3.3 三萜取提取物（300mg）混入5ml氯仿中，在80度条件下加热30分钟，溶液中 加入数滴浓硫酸并充分混合，出现红色表示三萜类化合物的存在12-13。1.3.4 生物碱取提取物（300mg）加入2M盐酸，将这种酸性滤液在室温下与戊醇混合。 醇层出现粉红色表示存在生物碱13-14。1.3.5 黄酮类化合物黄酮类化合物存在的确认方法是：取 1%的三氯化铝溶液，加入甲醇，浓HC1,镁成分和氢氧化钾溶液in,对硅胶上的水提取物进行薄层色谱分析。（氯仿介质：甲醇（9:1 体积/体积），作为流动相氯仿：丙酮（1:1 体积/体积）1.4 小鼠从特立尼达岛，圣奥古斯丁，西印度群岛大学兽医学院采购的健康近交系雄 性小鼠，体重在 200 至 220 克之间，他们用正常的食物和水随意的分开饲养。动 物实验前后进行定期称重。密切观察所有动物，发现任何感染及感染迹象，立即 从研究群体中分离出去。并从研究中排除。小鼠随机分成 2 组，每组六个如下：1.4.1 对照组这组小鼠饮用纯净水。1.4.2 试验组 这组小鼠饮用掺入提取物的饮用水，剂量为每一公斤水 150 mg 提取物。1.5 动物伦理委员会许可这项研究被西印度群岛大学医学系动物伦理委员会批准（AHC06/07/01）。1.6 急性毒性试验使用阶梯法，对提取物进行了急性毒性研究15。溶解在水中 14 天后提取的 诺尼乙醇提取物，增大剂量喂养给小鼠（1 克、2 克、4 克、8克每公斤体重） 。 4 克每公斤体重的剂量内，未出现中毒和死亡的任何迹象。动物的各项身体活动和 饮食情况也都一切正常。1.7 伤口愈合能力切除术和死腔伤口模型被用来评估诺尼对伤口愈合活动的能力。1.8 创口模型制造伤口之前，采用静脉注射氯胺酮盐酸盐（120mg每公斤体重）的方式， 先将动物麻醉。小鼠被切割出伤口，像莫顿和马龙 16所描述的。用电动推剪将 后背的毛发剃掉，使用圆形不锈钢模板用亚甲蓝在在预期的后背区域画标记线。 使用齿钳，手术刀和尖锐的剪刀沿标记创建一个完整的面积为300平方毫米，深 度为2mm的伤口区域。将动物随机分为两组，每组各六个。对照组动物提供普 通饮用水。试验组小鼠提供掺入提取物的饮用水，剂量为每一公斤水150 mg 提 取物，直到伤口完全愈合。由于小鼠平均每天消耗110毫升水，我们的提取物在 100毫升的饮用水中溶解度为150mg。在伤口愈合速度的评估方法是，在第1天、 第 5 天和第 11 天，使用透明纸和永久性标记对伤口进行追踪，采用方格纸对伤 口面积进行计算。直到焦痂脱落后，没有任何残留的伤口时，才被视为彻底完成 了上皮化。1.9 死腔伤口模型达西等人的方法是，通过在小鼠的腹面上的任一侧上的腹股沟和腋窝之间注 入无菌棉颗粒（5mg）,就像特纳所描述的Ml。将动物随机分为两组，每组各六 个。对照组动物提供普通饮用水。试验组小鼠提供掺入提取物的饮用水，剂量为 每一公斤水150 mg提取物。10天后，在麻醉状态下，从棉花球团上小心取下其上 形成的肉芽组织。记录下肉芽组织的湿重。将这些组织在60度环境下干燥12小时 后，进行称重，以确定干燥的肉芽组织的重量。将5ml 6N盐酸溶液加入该干燥后 的组织，并在110度环境下保持24小时。组织的酸水解产物被用于测定羟脯氨酸 含量18。其余的湿肉芽组织保存在10福尔马林中用于组织学研究。1.10 羟脯氨酸测量 从对照组和实验组取出的干肉芽组织被用以评估羟脯氨酸含量。酸水解产物中的羟脯氨酸，被加入硫酸铜的过氧化钠氧化，并随后与p-二甲基氨基苯甲醛的 络合物合成，产生粉红色后，采用540nm波长的光谱进行测量。1.11 组织学研究获得肉芽组织de第10天，对试验组和对照组动物形成的组织进行切片，并 采用Van Gieson方式对胶原蛋白进行染色。1.12 统计分析在不同的时间间隔内，试验组和对照组动物伤口面积的测量手段：上皮化时 间、湿重、干重和肉芽组织的羟脯氨酸含量等都在进行对比，使用非参数化的 Mann Whitney方法，并采用SPSS （12.0版本，芝加哥，美国）和P值0.05对所 有的数据进行分析。2、结果2.1 植物化学分析通过定性和薄层色谱法进行的植物化学分析都表明，提取物中含有酚类，生 物碱，三萜类化合物，类固醇和羧基的酸。2.2 切除伤口模型相比对照组，采用诺尼果提取物治疗的实验组动物的伤口愈合活动显着增 加。图1和图2显示诺尼乙醇提取物的对小鼠伤口愈合活性的效果。在此模型中， 相对于饮用纯净水的对照组，使用提取物处理的动物表现出更快速的伤口面积减 小（图1）和更短时间的上皮组织形成（图2）。Wound area图1,相比于对照组，诺尼叶提取物对雄性小鼠伤口愈合活动的影响（创口模型，n=6）,每一个竖条表 示代表平均值。* P 0.002与对照组（采用非参数Mann-Whitney U试验方法）。Epithelialization图2,相比于对照组，诺尼叶提取物对雄性小鼠伤口愈合活动的影响（创口模型，n=6）,每一个竖条表 示代表平均值。* P 0.002与对照组（采用非参数Mann-Whitney U试验方法）。2.3 死腔伤口模型在死腔伤口模型中，相比对照组动物（P 0.002），实验组动物提取的组织中，有更高水平的羟脯氨酸含量，肉芽组织中的重量也有显著增加（P0.002）（图3）。2.4 组织学研究实验组小鼠肉芽组织的切片显示，含有更多更富纹理的胶原蛋白、纤维母细胞和更少的炎症细胞（图4）。从对照组小鼠获得的肉芽组织切片显示更多的炎症细胞和更少的胶原纤维和成纤维细胞（图5）。3、讨论 伤口愈合是一个过程，其中受损的组织尽可能地恢复到正常状态。伤口收缩 是多次不断的收缩伤口面积。这主要是依赖于伤口的类型和程度，平时的健康状 况和组织的修复能力。伤口的肉芽组织的成分主要是成纤维细胞，胶原蛋白和新 的小血管。伤口边缘的未分化的间充质细胞分化为成纤维细胞，沿着纤维方向输 送到伤口中。图3实验组和对照组的肉芽组织的湿重，干重和羟脯氨酸含量对比（死腔伤口模型，n= 6）。每一个竖条表示代表平均值。* P 0.002与对照组（采用非参数Mann-Whitney U试验方法）。噬细胞，B：成纤维细胞，C：胶原纤维。3.1 提取物对伤口的作用针对康复过程的研究表明，诺尼的乙醇提取物显著增加伤口的收缩率、上皮 化率和生成的肉芽组织的重量。增殖最后阶段形成的肉芽组织的主要成分是成纤 维细胞，胶原蛋白，水肿和新的小血管。实验组动物的干燥提取物中的肉芽组织 显示含有更高的胶原蛋白。诺尼成分可能是负责在伤口愈合的增殖期促进胶原蛋 白的形成（图6）。图5服用纯净水的对照组小鼠测试中得到的肉芽组织的组织学研究，（Van Gieson染色），A：巨噬细胞,B：成纤维细胞，C：胶原纤维。图6 诺尼叶提取物对促进伤口愈合的活动可能产生的影响示意图3.2 诺尼的植物化学成分对伤口愈合可能发挥的作用 诺尼中含有的三萜类化合物和生物碱等成分可能在伤口愈合的过程中发挥 了重要作用，但要找出促进伤口愈合活性的活性化合物（S），需要进一步的植物 化学成分研究。三萜类化合物和黄酮类化合物能够促进伤口愈合是公认的，可能 主要是由于他们的收敛性能和抗菌性能，这似乎是创面收缩和上皮化速度加快的 原因19-20。一些研究，包括我们早期在其它的植物材料的方面做的一些工作表明， 类似负责小鼠用于促进伤口愈合活性的植物化学物质成分是存在的21-22。4、结论 我们的数据表明，诺尼的乙醇提取物能增加伤口愈合活性。但是，在考虑用 于治疗伤口之前，它需要在临床做进一步的评估。5、致谢 作者对加勒比地区卫生研究委员会资助该项目表示诚挚的谢意，也感谢在整 个研究过程中，西印度群岛大学、特立尼达医学系（圣奥古斯丁）一直以来的支 持和鼓励。作者真诚地感谢s Yasmin女士在特立尼达和多巴哥国家标本馆识别和 存放样品，真诚感谢Quintyne Walcot女士、Mathew先生、Beverly Moore女士、 Vernie Ramkissoon先生 V ERNIE 的技术援助。（选自埃及循证补充替代医学，6（3）: 351-356,葛媛媛译。）