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第第七七章章色谱分析色谱分析法法一、气相色谱流出气相色谱流出曲线曲线二、保留因子与分二、保留因子与分配系数配系数三、塔板理论三、塔板理论四、四、速率理论速率理论五、五、分离度分离度2023-1-3色谱过程色谱过程(P339)：实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，动的两相，固定相固定相(stationary phase)(stationary phase)和和流动流动相相(mobile phase)(mobile phase)。色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次多次“分配分配”的过程。的过程。通过组分分子在固定相的吸附能力和在流动通过组分分子在固定相的吸附能力和在流动相中的相中的溶解度溶解度存在的微小差异，来实现组分的存在的微小差异，来实现组分的分离。分离。2023-1-32023-1-3一、色谱流出曲线和有关概念一、色谱流出曲线和有关概念(P339)1.1.色谱流出曲线色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间作图是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为所绘制的曲线，又称为色谱图色谱图。2.2.基线基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器线反映仪器 (主要是检测器主要是检测器)的噪音随时间的变化。的噪音随时间的变化。3.3.色谱峰色谱峰是流出曲线上的突起部分，即组分流经检测器所是流出曲线上的突起部分，即组分流经检测器所产生的信号。产生的信号。色谱峰可用色谱峰可用峰高或峰面积峰高或峰面积（用于定量）、（用于定量）、峰位峰位（用于定量）（用于定量）及及峰宽峰宽（用于衡量柱效）来衡量。（用于衡量柱效）来衡量。正常色谱峰正常色谱峰：对称形正态分布曲线；拖尾峰壑前延峰：对称形正态分布曲线；拖尾峰壑前延峰2023-1-34.4.对称因子对称因子f fs s：衡量色谱峰的对称性衡量色谱峰的对称性 ABAAWfhs2/)(2/05.0 f fs s在在0.95-1.050.95-1.05之间的之间的色谱峰为对称峰；小于色谱峰为对称峰；小于0.950.95者为前延峰；大于者为前延峰；大于1.051.05者为拖尾峰者为拖尾峰2023-1-3定量参数定量参数n 峰高峰高(peak height；h)：组分在柱后出现组分在柱后出现浓浓度极大度极大时的检测信号，即时的检测信号，即色谱峰顶至基线的色谱峰顶至基线的距离距离。n 峰面积峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间色谱曲线与基线间包围的面积。包围的面积。2023-1-31.1.保留值保留值 （1 1）时间表示的保留值）时间表示的保留值 保留时间（保留时间（tR）：）：组分从进样到柱后出现浓度极组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间大值时所需的时间 死时间（死时间（tM）：）：不与固定相作用的气体（如空气不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。）的保留时间。调整保留时间（调整保留时间（tR）：）：tR=tRtM 定性参数定性参数1 1图图16-2（P340）2023-1-3调整保留时间调整保留时间 调整保留时间是常用的色谱定性参数之一；调整保留时间是常用的色谱定性参数之一；在实验条件（稳定、固定相等）一定时，在实验条件（稳定、固定相等）一定时，调调整保留时间仅决定于组分的性质整保留时间仅决定于组分的性质，因此，因此调整调整保留时间是定性的基本参数保留时间是定性的基本参数。2023-1-3（2 2）用体积表示的保留值）用体积表示的保留值 保留体积（保留体积（VR）：）：是从进样开始到某组分在柱后是从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积流动相体积。V VR R =t tR RF F0 0(F F0 0为色谱柱出口处的载气流量，单位：为色谱柱出口处的载气流量，单位：m L/min)m L/min)死体积（死体积（VM）：）：V VM M=t tM M F F0 0 调整保留体积（调整保留体积（VR）：）：V V R R=V VR R V VM M 定性参数定性参数1 12023-1-32 2.相对保留值相对保留值r r2121 组分组分2 2与组分与组分1 1调整保留值之比：调整保留值之比：r r2121=ttR R2 2 /ttR R1 1=VVR R2 2/VV R R1 1 相对保留值相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分示了固定相对这两种组分的选择性的选择性。定性参数定性参数2 22023-1-3 1.1.色谱峰区域宽度色谱峰区域宽度 是衡量柱效的重要参数之一，是衡量柱效的重要参数之一，区域宽度越小柱效区域宽度越小柱效越高越高 有三种表示方法：有三种表示方法：（1）标准偏差）标准偏差()：即即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度色谱峰高一半处的宽度 Y1/2=2.354 （3）峰底宽）峰底宽(Wb)：Wb=4 柱效参数柱效参数区域宽度常用半峰宽和区域宽度常用半峰宽和峰宽描述峰宽描述2023-1-3总分离效能指标总分离效能指标n 分离度分离度(resolution；R R)：又称分辨率。是相又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。值之比。21RR21RR)(22/)(1212WWttWWttR2023-1-3分离度分离度(P342)设正常峰，设正常峰，W1W2=4，则则R=1.5时，时，99.7%面积面积(tR 3)被分开，被分开，tR=6 ，称，称 6 分离分离。在做定量分析时，为了能获得较好的精密度在做定量分析时，为了能获得较好的精密度和准确度，应使和准确度，应使R1.52023-1-3二、分配系数与色谱分离二、分配系数与色谱分离(P342)(一一)分配系数和保留因子分配系数和保留因子 分配系数分配系数(distribution coefficient；K)是在是在一定温度和压力下，达到一定温度和压力下，达到分配平衡分配平衡时，时，组分组分在固定相在固定相(s)与流动相与流动相(m)中的浓度中的浓度(C)之比之比。ms=CCK分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（及温度（和压力）和压力）有关。是组分的有关。是组分的特征常数特征常数。2023-1-3 保留因子保留因子(capacity factor；k)：在一定温度和压在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流 动动相中的质量相中的质量(m m)之比。（摩尔数？）之比。（摩尔数？）又称为质量分配系数或分配比，还称为又称为质量分配系数或分配比，还称为容量因容量因子子。msmmk 保留因子不仅与温度和压力有关，还与固定相保留因子不仅与温度和压力有关，还与固定相和流动相的体积有关和流动相的体积有关。mmssVCVCmsVVK容量因子与容量因子与分配系数的关系分配系数的关系2023-1-3tR=t0(1+k)tR=t0(1+K )分配系数与色谱分离分配系数与色谱分离（二）分配系数和保留因子与保留时间的关系二）分配系数和保留因子与保留时间的关系uvR v=L/tRu=L/t0RttR0ssmmmmSmmsmmVCVCVCNNNtttRkR11RttR0msVV0R00Rtttttk保留因子保留因子(k)值大则保留时间长值大则保留时间长2023-1-3tR=t0(1+k)tR=t0(1+K )以上为以上为色谱过程方程，是色谱法的最基本公式色谱过程方程，是色谱法的最基本公式之一之一，表示保留时间与分配系数的关系。，表示保留时间与分配系数的关系。tR取取决于分配系数决于分配系数K，K大的组分保留时间长。大的组分保留时间长。msVV0R00Rtttttk 保留因子保留因子(k k)表示组分在色谱柱中多停留的表示组分在色谱柱中多停留的时间（或在固定相中的时间）与死时间的时间（或在固定相中的时间）与死时间的比值。比值。k k值大则保留时间长。值大则保留时间长。2023-1-3（三）（三）色谱色谱分离的前提分离的前提 KAKB 或或kAkB 是色谱是色谱分离的前提。分离的前提。=t0(1+KA )ARtmsVVBRt=t0(1+KB )msVV tR=t0(KAKB)msVVtR0 KAKBkAkB分配系数与色谱分离分配系数与色谱分离推导过程：推导过程：分配系数不等是色谱分分配系数不等是色谱分离的前提离的前提2023-1-321RR21RR)(22/)(1212WWttWWttR要使分离度要使分离度R R大，必须：大，必须：1 1、t tR R大大-k k大大-热力学热力学2 2、W W小小-峰展宽小峰展宽小-动力学动力学三、色谱法基本理论三、色谱法基本理论 2023-1-32023-1-31.1.塔板理论塔板理论 (P351)(P351)塔板理论把色谱柱比作一个塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔分馏塔，设想其中，设想其中有许多塔板。认为在每个塔板的间隔内，试样组分有许多塔板。认为在每个塔板的间隔内，试样组分在两相间达到在两相间达到分配平衡分配平衡，经过多次的分配平衡后，经过多次的分配平衡后，分配系数小的组分先流出色谱柱分配系数小的组分先流出色谱柱。塔板理论中还引入塔板数和塔板高度作为痕量塔板理论中还引入塔板数和塔板高度作为痕量柱效的指标。柱效的指标。各组分的保留时间（各组分的保留时间（t）不同，）不同，能达到分配平衡能达到分配平衡2023-1-3塔板理论有如下基本假设塔板理论有如下基本假设 在色谱在色谱内一小段长度即一个内一小段长度即一个塔板高度塔板高度H内，内，组分可以在两相中瞬间达到组分可以在两相中瞬间达到分配平衡分配平衡。分配系数在各塔板内是常数分配系数在各塔板内是常数。流动相流动相不是连续地而是间歇式地进入色谱柱不是连续地而是间歇式地进入色谱柱，且，且每次只进入一个塔板体积每次只进入一个塔板体积。试样在柱内的试样在柱内的纵向扩散可以忽略纵向扩散可以忽略。2023-1-3塔板理论塔板理论-柱分离效能指标柱分离效能指标色谱柱长：色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：222/1)(16)(54.5WtWtnRR峰宽峰宽半峰宽半峰宽调整保留时间调整保留时间2023-1-3有效塔板数和有效塔板高度有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的单位柱长的塔板数越多塔板数越多，表明，表明柱效越高柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：板数和有效塔板高度：222/1)(16)(54.5WtWtnRR有效有效有效nLHWtWtnRR222/1)(16)(54.52023-1-3塔板理论的特点和不足：塔板理论的特点和不足：(1)(1)当色谱柱长度一定时，塔板数当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大越大(塔板高度塔板高度 H 越小越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。，所得色谱峰越窄。(2)(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。测定物质。(3)(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。无法分离。(4)(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。柱效的途径。2023-1-32.2.速率理论速率理论 (P353)(P353)速率理论充分考虑组分在速率理论充分考虑组分在两相间的扩散两相间的扩散和和传质传质过程过程，以，以动力学理论动力学理论研究了使研究了使色谱峰展宽色谱峰展宽从而影响从而影响塔板高度的因素。塔板高度的因素。色谱峰的峰展宽是由于色谱峰的峰展宽是由于组分分子组分分子在色谱柱内在色谱柱内无规无规则运动则运动的结果，这种随机过程导致组分分子在色谱的结果，这种随机过程导致组分分子在色谱柱内呈正态分布。柱内呈正态分布。速率理论充分考虑了组分在两相间的扩散和传速率理论充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，以质过程，以非平衡过程非平衡过程研究方法导出了速率理论方研究方法导出了速率理论方程。程。峰宽（峰宽（W）增加，）增加，色谱峰展宽色谱峰展宽2023-1-3速率理论速率理论-影响柱效的因素影响柱效的因素 速率方程（也称范速率方程（也称范.弟姆特方程式）弟姆特方程式）:H=A+B/u+Cu H：理论塔板高度，：理论塔板高度，u：载气的线速度：载气的线速度(cm/s)减小减小A（涡流扩散系数）、（涡流扩散系数）、B（纵向扩散系数）、（纵向扩散系数）、C（传质阻抗系数）三项可提高柱效；（传质阻抗系数）三项可提高柱效；存在着最佳流速；存在着最佳流速；A、B、C三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？2023-1-31.1.涡流扩散项涡流扩散项A(P354)A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，填充的越均匀，A，H，柱效，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。峰较窄。考虑到填料粒径大考虑到填料粒径大小不等，导致组分小不等，导致组分分子扩散途径不同分子扩散途径不同2023-1-32.2.分子扩散项分子扩散项B(P354)B=2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱，弯曲因子，填充柱色谱，1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。）。由于由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：a.扩散导致色谱峰变宽，扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差。分离变差。b.分子扩散项与流速有关，流速分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，滞留时间，扩散，扩散 c.扩散系数：扩散系数：Dg（M载气载气）-1/2；M载气载气，B值值考虑到浓度梯度的存考虑到浓度梯度的存在，造成区带展宽在，造成区带展宽2023-1-33.3.传质阻力项传质阻力项 C(P354)组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力和液相传质阻力CL，液相传，液相传质阻力大于气相传质阻力。质阻力大于气相传质阻力。即：即：C=（Cg+CL）LfLDdC2考虑到组分分子与固考虑到组分分子与固定相或流动相分子间定相或流动相分子间相互作用的结果相互作用的结果2023-1-34.4.载气流速与柱效载气流速与柱效最佳流速最佳流速 载气流速高时：载气流速高时：传质阻力项是影响柱效传质阻力项是影响柱效的主要因素，的主要因素，流速流速，柱效，柱效,右图曲线的右边。右图曲线的右边。载气流速低时：载气流速低时：H-u曲线与最佳流速：曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个响使得存在着一个最佳流速最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度以塔板高度H H对应载气流速对应载气流速u u作图，曲线最低点的流速即作图，曲线最低点的流速即为为最佳流速最佳流速。分子扩散项成为影响柱效的分子扩散项成为影响柱效的主要因素，主要因素，流速流速 ，柱效，柱效 ，右图曲线的坐边。右图曲线的坐边。2023-1-35.速率理论的要点速率理论的要点 (1)(1)组分分子在柱内运行的组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散多路径与涡流扩散、浓度梯度浓度梯度所所造成的造成的分子扩散分子扩散及及传质阻力传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降色谱峰扩展柱效下降的主要原因。的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。气流速可提高柱效。(3)(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高选择最佳条件，才能使柱效达到最高。2023-1-3五、分离度五、分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：合影响：保留值之差保留值之差色谱过程的色谱过程的热力学热力学因素；因素；区域宽度区域宽度色谱过程的色谱过程的动力学动力学因素。因素。色谱分离中的四种情况如图所示：色谱分离中的四种情况如图所示：柱效较高，柱效较高，K(分配系数分配系数)较大较大,完全分离；完全分离；K 不是很大，柱效较高，不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；峰较窄，基本上完全分离；柱效较低，柱效较低，K 较大较大,但但分离的不好；分离的不好；K 小，小，柱效低，分离效柱效低，分离效果更差。果更差。2023-1-3分离度的表达式：分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达：两峰的分离程度可达89%；R=1.0：分离程度：分离程度98%；R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准相邻两峰完全分离的标准）。）。)(699.1)(2)(2)1(2/1)2(2/1)1()2()1()2()1()2(WWttWWttRRRbbRR2023-1-3令令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等相邻两峰的峰底宽近似相等），），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：引入相对保留值和塔板数，可导出下式：161112212121121221211212有效nrrWtttrWtttWttWWttRbbbbbRRRRRRRRRR)()()()()()()()()()()()()()()()(有效有效HrrRLrrRn221212221212116116)()(灵活运用上述公式灵活运用上述公式2023-1-3 例：例：在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和秒和100秒，要达到完全分离，即秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为板。若填充柱的塔板高度为0.1 cm，柱长是多少？柱长是多少？解：解：r21=100/85=1.18 n有效有效 =16R2 r21 /(r21 1)2 =161.52(1.18/0.18)2 =1547（块）块）L有效有效 =n有效有效H有效有效 =15470.1=155 cm 即柱长为即柱长为1.55米时，米时，两组两组分可以得到完全分离。分可以得到完全分离。2023-1-3例：例：在一定条件下，两个组分的保留时间分别为在一定条件下，两个组分的保留时间分别为12.2s和和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，即计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5 ，所需要的柱长。所需要的柱长。解：解：8533.036008.12448133.036002.12442211ntWntWRbRb分离度：72.08133.08533.0)2.128.12(2RmLRRL34.4172.05.1212122塔板数增加一倍，分离度增加多少？2023-1-3请选择内容：请选择内容：第一节第一节 色谱法概述色谱法概述第二节第二节 气相色谱仪气相色谱仪第三节第三节 色谱理论基础色谱理论基础第四节第四节 气相色谱操作条件选择气相色谱操作条件选择第五节第五节 色谱定性、定量方法色谱定性、定量方法第六节第六节 毛细管色谱毛细管色谱第七节第七节 液相色谱法液相色谱法第八节第八节 离子色谱法离子色谱法第九节第九节 高效毛细管电泳高效毛细管电泳第十节第十节 薄层色谱与纸色谱法薄层色谱与纸色谱法结束结束结束结束结束结束2023-1-3二、分配系数与保留因子二、分配系数与保留因子(P342)分配系数分配系数K：组分在两相间的浓度比；组分在两相间的浓度比；保留因子保留因子k：平衡时，组分在各相中总的平衡时，组分在各相中总的质量比质量比；k=mS/mmMS为组分在固定相中的质量，为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量。为组分在流动相中的质量。保留因子保留因子k与分配系数与分配系数K的关系为：的关系为：式中式中为相比。为相比。填充柱相比：填充柱相比：635；毛细管柱的相比：毛细管柱的相比：501500MRMMRtttttkKVVccVVmVVmmmkmSmsmmSSSSmS保留因子越大，保留时间越长。保留因子越大，保留时间越长。可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系：可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系：2023-1-3
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