实时荧光定量PCR的原理和实验

实时荧光定量PCR的原理及实验不管是对遗传病（如地中海贫血和血友病）、传染病（如肝炎和艾滋病）或肿瘤 进行基因诊断，仍是研究药物对基因表达水平的阻碍，或监控药物和疗法的医治 成效，定量per技术都能够发挥专门大作用。定量per技术的最新进展是实时荧 光定量。该技术借助于荧光信号来检测per产物，一方面提高了灵敏度，另一方 面还能够做到per每循环一次就搜集一个数据，成立实时扩增曲线，准确地确信 et值，从而依照et值确信起始dna拷贝数，做到了真正意义上的dna定量。这 是dna定量技术的一次飞跃。依照最终取得的数据不同，定量per能够分为相对定量和绝对定量两 种。典型的相对定量如比较通过不同方式处置的两个样本中基因表达水平的高低 转变，取得的结果是百分比；绝对定量那么需要利用标准曲线确信样本中基因的 拷贝数或浓度。依照所利用的技术不同，荧光定量per又能够分为taqman探针 和sybr green i荧光染料两种方式。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严 格，所得数据更为精准；荧光染料技术那么本钱更为低廉，实验设计更为简便。 在选择实验方案时要依如实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严 格的校正，以排除偶然误差。因此重复实验和设立内对照超级重要。由于各类各 样的客观缘故，这一点在实践中往往被轻视或轻忽，需要着重强调。固然，与定 性实验一样，定量per也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可 能显现的问题。1什么缘故终点定量不准确？咱们都明白理论上per是一个指数增加的进程，可是实际的per扩增曲 线并非是标准的指数曲线，而是s形曲线。这是因为随着per循环的增多，扩增 规模迅速增大，taq酶、dntp、引物，乃至dna模板等各类per要素慢慢不敷需 求，per的效率愈来愈低，产物增加的速度就慢慢减缓。当所有的taq酶都被饱 和以后，per就进入了平台期。由于各类环境因素的复杂彼此作用，不同的per 反映体系进入平台期的机会和平台期的高低都有专门大转变，难以精准操纵。因 此，即便是重复实验，各类条件大体一致，最后取得的 dna 拷贝数也是完全不一 样的，波动专门大（图 1）。图 1 同一个样本重复 96 次 pcr 的扩增曲线传统的定量方式，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等， 测定的都是 pcr 的终产物，而不是起始 dna 拷贝数。由于 pcr 的终产物量与起始 模板量之间没有线性关系，因此依照最终的 pcr 产物量不能计算出起始 dna 拷贝 数。关于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是 pcr 放大之前标本中的 dna 原始拷贝数，通过 pcr 扩增以后的 dna 拷贝数已经不 能反映真实情形。在这种情形下，就不能采纳终点定量，而要依照 ct 值确信 dna 起始拷贝的数量。2 什么缘故 ct 值与起始模板拷贝数成线性关系？ct值的概念是per扩增进程中，荧光信号开始由本底进入指数增加时期的 拐点所对应的循环次数。从图1的重复实验中能够直观地看到，尽管平台期dna 拷贝数波动专门大，ct值却是相对固定的。若是用不同浓度的dna作per，能够 看出dna浓度越高，ct值越小。dna浓度每增加1倍，ct值减小1个循环。ct 值与模板dna的起始拷贝数成反比。这一结论能够从数学上严格证明。为使表达式简便，以下推导忽略pcr效率 等细节。若是考虑这些因素，能够在方程上增加修正项。这些修正项的增加并非 改变方程的线性性质。一样地，咱们有rn二rb+xo(1+ex)nrs,也确实是说第n次pcr循环时的荧光 信号强度(rn)等于背景信号强度(rb)加上每一个分子的荧光强度(即单位荧光强 度，rs)与分子数量的乘积。当循环次数n二ct时，那么有rt二rb+xo(1+ex)ctrs。 两边取对数，得 log(rt -rb) = logxO + ctlog(1+ ex) + logrs。整理此式， ctlog(1+ ex) = - logxO + log(rt -rb) - logrs。U _ log! log( Rr - log Rs因此关于每一个特定的per反映来讲，ex、rt、rb和rs都是常数，因此ct 值与log x0成反比，也确实是说et值与起始模板拷贝数(xO)的对数成反比，起 始dna浓度每增加1倍，et值减小1个循环。依照et值的定量是精准和严格的， 而传统的终点定量那么比较粗放。若是读者有爱好的话，也能够假设per的效率(即ex)为100%，从上式推算 出定量per标准曲线的最正确斜率和et值的最正确范围。3如何确信ct值？实验操作中，ct值概念为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光 发射时所对应的pcr循环次数(图2)。“基线上方”也确实是阈值高度的量化 概念是基线范围内荧光信号强度标准误差的10倍。阈值所在的横线与pcr扩增 曲线的交点所指的pcr循环次数确实是ct值。基线范围的概念是从第3个循环 起到ct值前3个循环止，其终点要依照每次实验的具体数据调整，一样取第3 到第15个循环之间。早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号 往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在ct值前3个循环之内，大多数情 形下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜看成基线来处置。阈值基线范图2 ct值和阈值显然，ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，ct值 是一个完全客观的参数。ct值越小，模板dna的起始拷贝数越多；ct值越大， 模板dna的起始拷贝数越少。正常的ct值范围在18-30之间，过大和过小都将 阻碍实验数据的精度。4荧光信号和定量数据的归一化虽然大多数定量pcr仪都会自动扣除本底，但是仍然需要注意荧光信号强度 和定量数据的归一化校正，以便不同样本之间的实验数据可以严格地相互比较。由于加样操作的误差、离心管透光性能的不同、荧光激发效率的不一样偶然 误差不可幸免，因此仪器搜集到的原始信号必需进行归一化校正，以排除这些因 素对定量结果的阻碍。这种校正能够通过在反映体系中添加额外的荧光染料来实 现，一样采纳红色rox荧光，称为阳性参比信号。rox在反映缓冲液中的浓度是 固定的，因此其信号的强度与反映体系的整体积和总的荧光激发效率正相关。目 标基因和对照基因的信号除以阳性参比信号以后，即rn = r / rrox,就能够够 在一样的起点上进行比较和各类计算。rox校正能够提高定量数据的精度和重现性，减少孔间不同（图3）。TjTi图3 rox荧光校正（左）和不校正（右）对实验数据的阻碍归一后的荧光信号再扣除本底，就取得drn： drn = rn，样本-rn,空白。drn 是最后构建per实时扩增曲线的纵坐标。不管绝对定量仍是相对定量，在取得实验结果后，还要考虑数据之间的可比 性问题。在实验操作中，取样都是以体积或重量为单位的，可是一样体积或重量 的样本所来源的细胞数量并非一样，因此拷贝/Ul或拷贝/ng的定量数据彼此之 间事实上并非可比。只有将这些数据归一到以拷贝/细胞或拷贝/基因组为单位 后，才可进行严格意义上的比较。这种校正能够通过适当的参比来完成。参比一样选用b-aetin、gapdh、rrna 基因等管家基因。由于它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的， 受环境因素阻碍较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。校正 方式为：dna样本/ dnaipe，或det二ct,样本-ct, ipc。因为et值与起 始dna拷贝数的对数是反比关系，能够证明，这两种计算方式在数学上是等价的。为了减少误差，目标基因和参比基因最好在同一反映管内同时进行定量测 定，因此这种对照称为阳性内对照（internal positive control，ipc）。要进行 ipc归一化校正，定量per仪必需具有多色检测能力，最好是4色。不然，目标 基因和参比基因只能分两管作定量，就不成其为“内”标了。5污染的预防和热启动为保证定量的准确性，要预防非特异性pcr扩增和污染。经常使用的方法有 利用ung酶(uracil-n-glycosylase)和热启动。ung酶的作用原理是降解含有du 的双链或单链dna。它在50c激活，95c灭活。由于商用pcr试剂盒均以dutp 取代dttp，因此pcr产物都是含有du的dna链。在定量per开始前增加50c 的保温步骤，ung酶即可将已有的pcr产物降解破坏，避免可能造成的污染。一般的taq酶即便在室温下也有必然的活性，若是不采取方法，在加入pcr 试剂的进程中、正式per开始前就会完成少量pcr扩增，增加了背景，阻碍定量 精度。而金牌taq酶通过特殊修饰，常温下其活性部位被封锁，没有活性；只有 通过95c 10 min的热启动以后，封锁被解除，才能开始dna链延伸，如此就 最大限度地减少了杂讯的生成。6标准曲线、重复实验和阴性、阳性对照定量实验，误差是不可幸免的。设立重复实验，对数据进行统计处置，能够 将误差降低到最小。因此定量实验的每一个样本至少要重复3次以上，严格的定 量更应当重复68次，以知足小样本统计的要求。若是作绝对定量，那么标准曲线需要在5个点以上。标准曲线利用的标准品 是浓度已知的dna样本，能够自己制备，也能够购买商品化的试剂盒。其pcr反映 条件应当与未知样本的一致，以便在同一反映板上同时定量。阴性对照中不加模板dna，而以水或缓冲液代替，用于查验是不是存在pcr 污染。阳性对照那么用于查验pcr试剂和实验操作上可能显现的问题。若是实验 中设立了 ipc，那么ipc既能够用来校正数据，也能够起到阳性对照的作用。7 taqman探针技术原理taqman探针法是高度特异的定量per技术,其核心是利用taq酶的 外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，因 此荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在taqman探针法的定量per反映体系中，包括一对per引物和一条探针。 探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5端标记有 报告基团(reporter, r),如fam、vie等，3端标记有荧光淬灭基团(quencher, q),如tamra等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸 收，仪器检测不到信号。随着per的进行，taq酶在链延伸进程中碰到与模板结 合的探针，其3一5外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基 团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号(图4)。因此，每通过一个per循环， 荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增加的进程。信号的强度就代表了 模板dna的拷贝数。TaqMan 探针下游引物图4 taqman探针的荧光信号产生机制taqman探针依照其3端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：一般的 taqman探针和taqman mgb探针。mgb探针的淬灭基团采纳非荧光淬灭基团 (non-fluorescent quencher),本身不产生荧光，能够大大降低本底信号的强度。 同时探针上还连接有mgb （minor groove binder）修饰基团（图5）,能够将探针 的tm值提高10c左右。因此为了取得一样的tm值，mgb探针能够比一般 taqman 探针设计得更短,既降低了合成本钱,也使得探针设计的成功率大为提 高。因为在模板的 dna 碱基组成不睬想的情形下，短的探针比长的更易设计。 实验证明，taqman mgb探针关于富含a/t的模板能够区分得更为理想。图 5 taqman mgb 探针8 sybr green i荧光染料技术原理sybr green i是一种只与dna双链结合的荧光染料（图6）。当它与dna双链结合时，发出荧光；从dna双链上释放出来 时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链dna分 子的数量。sybr green荧光染料法定量per的大体进程是：一、开始反映，当sybr green染料与dna双链结合时发出荧光。二、dna变性时，sybr green染料释放 出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸进程中，引物退火并形成per产物。4、聚 合完成后，sybr green染料与双链产物结合，定量per系统检测到荧光的净增量 加大。图6 sybr green i荧光染料与dna双链的结合sybr green i荧光染料能与所有的dna双链相结合，对dna模板没有选择性, 因此特异性不如taqman探针。要想用荧光染料法取得比较好的定量结果，对 per引物设计的特异性和per反映的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一 种本钱低廉的选择。9定量per仪简介目前在国内利用得比较多的荧光实时定量per仪有美国应用生物系统公司 (applied biosystems，abi)的 7000、5700、7900、7700 型和罗氏公司的 lightcycler 等。下面以abi最新推出的7000型为例作简单介绍。7000型荧光定量pcr仪设计知足临床查验、医学研究和基础实验的要求， 面向低通量至中等通量的用户。随机配置的定量pcr引物和探针设计软件primer express超级有效，因为到目前为止尚未其他软件有能力设计定量pcr所需的 taqman 探针。7000型有实时动态(real-time)和终点读板(plate read)两种运行模式。实时 动态模式用于定量，测定dna或rna拷贝数。7000型能够动态显示pcr扩增曲 线的生成，定量的线性范围大于7个数量级，区分5000和10000个拷贝的dna 模板可信度达%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(snp)分析等。固然，7000型也能够作为一般pcr仪利用。abi已经发布12 万个商品化的定量 pcr 试剂盒，覆盖人类全数 4 万个基因，平均每一个基因 3 个 检测试剂盒，为运用 7000、7700、7900 型开展课题研究制造了绝佳的条件。7000型最大特色是具有多色检测能力，荧光检测的波长范围为530590 nm, 能够有效地分辨 famtm / sybr? green、victm / joetm、tamratm 和 roxtm 等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、 snp 分析、基因型分型和带阳性内 对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反映管内同时对多个目标基 因进行定量，能够大大提高精度并节约本钱。7000型支持两种定量化学：taqman荧光探针和sybr green i荧光染料。其 熔解曲线(dissociation curve)功能用于判定pcr扩增反映是不是特异，有无杂带 生成。进一步阅读材料大体方式1 lie, y. s. and c. j., petropoulos. advances in qua ntitative pcr tech no logy: 5nu clease assays. curr opin biotech nol 9: 43-48. 1998.2 orlando, c., p., pinzani, and m., pazzagli. developments in quantitative pcr. clin chem lab med 36: 255-269. 1998.绝对定量3 becker k., d. pan and . whitley. 1999. real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. hum. gene ther. 10: 2559-2566, 1999.4 de kok, ., hendriks, ., van solinge, ., willems, ., mensink, ., and swinkels, . use of real-time quantitative pcr to compare dna isolation methods. . 44(10): 2201-2204, 1998. 5 wang x., x. li, . currie, . willette, . barone and . feuerstein. application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1beta mrna in ischemic brain tolerance. j. neurosci. res. 59(2): 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