蔗糖酶米氏常数的测定ppt课件.ppt

【 目的 】 ：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习 求蔗糖酶米氏常数的方法 【 原理 】 ：米氏方程式 v = 米氏常数的求法很多，最常用的是 Lineweaver Burk的 作图法 (双倒数作图法 )。 米氏方程式可改写为下列倒数形式： 选择不同的 s，测定相应的 v，求出两者的倒数，以 1/s 为横坐标，以 1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至 横轴相交，横轴截距即为 -1/Km。 蔗糖酶米氏常数的测定 VmaxS Km +S 1 S 1/2VMAX v VMAX Km 底物浓度与反应速度关系曲线 VmaxS V= Km + S 2 3 还原糖与 3,5-二硝基水杨酸 (DNS)试剂反应： 4 【 仪器与试剂 】 1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表、 坐标纸 2试剂 标准葡萄糖溶液（ 1 mg/mL） 3%蔗糖溶液（ 87.7 mM） 0.2 mol/L NaAc缓冲溶液（ pH4.6） 0.5 mol/L NaOH溶液 3,5-二硝基水杨酸试剂 5 【 操作步骤 】 1葡萄糖标准曲线的制定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准液 (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 (mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 3,5-二硝基水杨酸试剂 (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热 5min，取出后立即用 冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至 25mL，摇匀。测 540nm处 A值。以葡萄糖含量（ mg）为横坐标， A值为纵坐标作出标 准曲线。 6 取试管 8支编号，按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管， 于 37 水浴中保温 10min。一定量酶液同一水浴中保温约 10min。 于各管中依次按同样间隔 (0.5min)加入已保温过的酶液 1.0mL， 计时，立即 摇匀 ，在 37 中 准确 温浴 5min。 按同样次序和时间间隔，加入 1mL 0.5mol/L NaOH， 摇匀 ，终 止反应。 吸取反应物 1.0mL，加入盛有 3.0mL 3， 5-二硝基水杨酸试剂和 1.0mL水的试管中 混匀 ，放入沸水浴中加热 5min，冷却后稀释 至 25mL，摇匀，在 540nm比色测定 A值。 以 A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以 1/S为横坐标， 1/v 为纵坐标作图，由图求出 Km值。 2底物浓度和初速度 测定 7 反应物 终止反应 活力测定 数据处理 管 号 3% 蔗糖 液 (mL) 醋酸 缓 冲液 (mL) 酶液 (mL) 1mol L NaOH (mL) 吸取 反 应物 (mL) 水杨 酸 试剂 (mL) 水 (mL) A540 底物 浓度 1/s 1/ 1 2 3 4 5 6 7 8 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.75 5.0 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 1.25 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 8 此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！ 9