原-位-杂-交-原理剖析

原 位 杂 交 原理原理 原位杂交技术是分子生物学和组织化学成功结合的产物。是以特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行原位检测的方法（in situ hybridization）。基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。应应 用用 于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已广泛地应用于医学分子生物学的研究中，对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律、肿瘤发生机制及病原微生物的检测，有广泛的应用前景。如：（1）用标记的探针与分裂中期染色体DNA杂交以研究染色质中特定核酸序列在染色体中的精确定位；（2）与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平；（3）用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织、细胞进行杂交，以确定有无该病原体的感染等。优优 点点（1）能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；（2）由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。分 类l根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；l根据其所用探针及所要检测核酸的不同可分为 DNA-DNA杂交 RNA-DNA杂交 RNA-RNA杂交 试 剂lTNE:50mmol/L Tris-HCl,pH7.4,10mmol/L NaCl,1mmol/L EDTAl20SSC:3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/L NaOH调)l2SSC:17.53g NaCl，8.82g柠檬酸钠，pH7.0(用10mol/L NaOH调)，定容至1Ll杂交液:4SSC,50%甲酰胺，1Denhardts，5%硫酸葡聚糖，0.5mg/ml鲑精DNAlBufferI:0.1mol/L Tris-HCl,pH7.5,0.15mol/L NaCllBufferII:0.5%Blocking agent,BufferIlBufferIII:0.1mol/L Tris-HCl,pH9.5,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2lBufferIV:10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTAl显色液：4.5l NBT+3.5l X-phosphate+1ml BufferIIIl 方 法1.1.取材取材2.2.固定固定 3.3.脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）4.4.切片切片 5.5.杂交杂交 6.6.冲洗与显色冲洗与显色 7.终止显色与复染终止显色与复染8.封片封片9.观察与拍照观察与拍照 固 定l现场取濒死斑节对虾，于第2、3腹节间和头胸部注射Davidsons AFA固定液全身固定，切取头胸部，从额剑将头胸部分成2部分，再置Davidsons AFA固定液中固定24h，转入70%乙醇中保存。l组织块(V)：固定液(V)=1：30lDavidsons AFA固定液配方（1升）：95乙醇 330 ml 福尔马林（3739甲醛水溶液）220 ml 冰醋酸 115 ml H2O 335 ml 混匀后封口，室温放置。脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）70%乙醇 1h2 可停留80%乙醇 1h2 可停留95%乙醇 1h2 无水乙醇 45min21/2无水乙醇+1/2二甲苯 20 min二甲苯 5 min21/2二甲苯+1/2石蜡 30 min 60 烘箱石蜡I 45min1h 60 烘箱石蜡II 45min1h 60 烘箱石蜡III 45min1h 60 烘箱石蜡包埋切 片 载玻片和盖玻片的准备：3%HCl+95%乙醇泡30min以上，擦干备用。硅化载玻片：2%APES于丙酮中 2min 丙酮 1min dH2O 1min 37 烘干备用切4m厚，42展片。杂 交 I 烘片：60 45min 脱蜡与水化：二甲苯 10min2 1/2无水乙醇+1/2二甲苯 5min 无水乙醇 23min2 95%乙醇 23min2 80%乙醇 23min 70%乙醇 23min 可停留 50%乙醇 23min 可停留 dH2O 23min杂杂 交交 II 消化：1TNE 5min PrK 10g/ml 200l/片，37，10 min (10mg/ml母液用1TNE稀释1000倍)后固定：0.4%甲醛 5min 杂交：2SSC 5min 探针先于100变性510 min，立即置冰上5min，甩。含1025ng/100l探针的杂交液100l/片，并用盖玻片和矿物油封片，95，6 min 立即置冰上 5min 42杂交 过夜冲 洗 与 显 色 2SSC 37 5min2 1SSC 37 5min2 0.5SSC 37 5min2 0.1SSC 37 5min2 1BufferI 室温 5min BufferII 200l/片 室温 5min Ap(用BufferII 稀释5000倍）100l/片 37 3045min BffeurI 室温 5min2 BufferIII 室温 5min NBT/BCIP(200l溶于10ml BufferIII中)，200l/片，避光勿动 室温 2 h过夜终止显色、复染与封片终止显色、复染与封片 BufferIV停止显色 室温 15min dH2O 23min 中性红或Bismark棕Y复染 1min dH2O洗 3 次 封片、观察及拍照 参考文献1、Bruce,L.D.,et al.1993.Application of gene probes to detect a penaeid shrimp baculovirus in fixed tissue using in situ hybridization.Disease of Aquatic Organisms 17:215-221.2、Mari,J.,et al.1993.Partial cloning of the genome of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,an unusual parvovirus pathogenic for penaeid shrimps;diagnosis of the disease using a specific probe.J.General Virology 74:2637-2643.3、Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual.Boehringer Mannheim Corporation,BiochemicalProducts,9115 Hague Road,P.O.Box50414,Indianapolis,IN 46250,USA.pp.1-75.4、Poulos,B.T.,et al.1994.Use of non-radioactively labeled DNA probes for the detection of a baculovirus from Penaeus monodon by in situ hybridization on fixed tissue.J.Virological Methods 49:187-194.探探 针针l原位杂交探针的非放射性标记物DIG标记与检测试剂盒标记与检测试剂盒（B.M公司）：Digoxigenin，类固醇半抗原，可与DNA、RNA及寡核苷酸杂交，随后用显色或发光检测。DIG与dUTP通过碱不稳定酯键相连为DIG-11-dUTP，因此可用NaOH洗掉探针，以进行第二个探针的杂交。探探 针针 标标 记记l探针 探针是原位杂交中用于组织细胞内特定的DNA或序列定位的关定位的关键试剂键试剂。种类：双链cDNA,单链cDNA，合成寡合苷酸、单链cRNA及 PCR产物。长度：50-300个碱基（bp）。l探针制备l探针标记 地高辛精是一种仅存于洋地黄类植物的花和叶子中的类固醇半抗原。*探针检测 用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体及免疫组织化学技术检测注注 意意 事事 项：项：（1）载玻片的处理：清洁无核酸酶污染（洗衣粉泡过夜，水冲，酸泡4-8小时，双蒸水冲2-3次，干燥，160烤2-4小时或15磅高压灭菌20分钟），用新鲜配制的1mg/ml多聚赖氨酸（Mr300000以上）作为组织细胞粘附剂。也可用明胶液。（2）湿盒：（3）探针的标记：放射性标记与非放射性标记；探针长度50-300 bp，小分子探针穿透力强，大分子探针可在组织细胞中形成网络而增加杂交信号，同时也使本底增高。（4）杂交条件：杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度（高温严谨）、pH及杂交液中甲酰胺（高浓度）和盐离子的浓度（低盐）；硫酸葡聚糖提高探针相对浓度PCR教学教学lDNA双螺旋学说-1953年，Watson和Crick提出。两条链上的碱基必须是腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）;鸟嘌呤(G)与胞嘧啶（C）配对。G与C之间以3个氢键，A与T之间以2个氢键连接。加热至近100C、或PH10、PH3、以及某些化学试剂，如乙酸、尿素和酰胺等，都可引起DNA变性变性-即解链。Tm融解温度融解温度：变性的DNA达到总量1/2时的温度。Tm受溶液中的离子的种类、离子强度、DNA中碱基组成的均一性以及G-C碱基对含量等因素的影响PCR教学教学l复性（退火）DNA与 DNA;DNA 与RNA;RNA 与RNA。