果蝇幼虫的甘油三酯和蛋白的测定方法

果蝇幼虫的甘油三酯和蛋白的测定方法陈洁茹;陈晓伟;杨利敏【摘 要】目的:了解果蝇三龄幼虫甘油三酯和蛋白质的提取方法和操作的注意事项.方法:选取同时间段收集的WT1118果蝇三龄幼虫雌雄各10只,以自制裂解液 PBST进行裂解研磨取材后，利用甘油三酯测定试剂盒(冻干粉型)GPO-PAP法和BCA蛋白质测定试剂盒,测量果蝇幼虫体内甘油三酯和蛋白质含量，对雌雄幼虫的甘 油三酯和蛋白质含量进行分析结果:发现雌性幼虫体内，无论是甘油三酯或蛋白质含 量都高于雄性幼虫结论:以果蝇三龄雌性幼虫各10只为例，雌性幼虫的甘油三酯和 蛋白含量均高于雄性幼虫.期刊名称】黑龙江医药科学年(卷),期】2017(040)004【总页数】3页(P3-4,7)关键词】 果蝇幼虫;提取方法;甘油三酯和蛋白质测试盒测定法;注意事项【作 者】 陈洁茹;陈晓伟;杨利敏【作者单位】 佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯154007;北京大学分子研究所,北京100871;佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯154007;大连大学医学院,辽宁大连 116600正文语种】 中 文【中图分类】R392;R446.5果蝇（Drosophila）是生物科学实验研究中不可缺少的模型，作为经典的模式生物， 本身具有自身特异的优势。首先，它的生长周期快，在25C条件下，大约10 14d可繁殖一代至成虫1,2。所以，为相同条件下，同时期收集同等大小及数量 相同的虫卵提供了条件。其次，果蝇培养基的制作方法已经成熟，可根据不同实验 条件而改变，在此所述为果蝇基础培养基的制法：例如制作200mL培养基，（1）琼 脂：3g（2）酵母：16g（3）玉米面：15g（4）葡萄糖：4g（5）加灭菌的超纯水或三蒸水 补齐，溶质溶剂共200mL。1.1 实验对象、试剂盒及仪器野生果蝇WT1118（来自北京大学生命科学院饶毅实验室），甘油三酯测定试剂盒 （北京普利莱公司）,BCA蛋白质测定试剂盒（Therm。科学公司），恒温水浴箱（保恒 恒温技术有限公司）、普通光学显微镜（BH-Z日本Olympus公司）。幼虫和成虫均 可按以下方法对甘油三酯和蛋白质进行提取，但成虫身体成分和杂质较多，对于测 量结果易产生影响，所以以下实验未涉及果蝇成虫的提取。1.2 实验步骤果蝇杂交的设计：首先收集25只未交配的WT1118成虫处女蝇，同15只成 虫雄性果蝇放于同一培养瓶中，放于培养箱中饲养，使它们交配完全。收集虫卵：3d后，于中午12时，将全部果蝇转移到新的培养瓶中，收集时间 为2h（研究表明果蝇每天12 16时内，产卵率偏高），保证虫卵在一个发育时期。 三龄幼虫雌雄分装：将收集两小时虫卵的培养瓶置于培养箱,3d后，当幼虫生 长到三龄期，用钩针或钝头镊子将虫卵移置装有灭过的PBS溶液或超纯水中，在 显微镜下区分雌雄，雌性各10只，用1.5mL EP管分装，注明样品名称（由于三龄 期幼虫会在培养基内爬行，虫体会沾有培养基，会影响测量结果，可在分装前，可 用超纯水清洗虫卵3次，后用无尘纸将虫卵表面的水分吸干）。 （4）贮存方法：入管 后立即放入事先准备好的液氮中，冻存于-80C冰箱（液氮和低温冻存是为了保证幼 虫样本体液不失活）。1.3 裂解液的配置通过查阅文献，可以自制研磨虫体的裂解液PBST（PBS+0.05%Tween20，二者比 例4:1）3，4，配置好后，通过滤膜过滤杂质，将裂解液放于4工冰箱贮存。2.1甘油三脂（TG）诊断试剂盒对于冻干粉型甘油三酯测试盒，实验原理如下：1）甘油三脂+水在脂肪酶催化下生 成甘油+脂肪酸2）甘油+ATP在甘油激酶的作用在生成甘油-3-磷酸+ADP 3）甘油- 3-磷酸+氧气在甘油磷酸氧化酶催化下生成磷酸二羟丙酮过氧化物酶+双氧水 4）双 氧水+4-氨基安替比林+对氯苯酚在过氧化物酶作用下生成醌染料+水+氯化氢，醌 染料在波长500nm有最大光吸收，颜色的强度与血清中甘油三酯含量成正比。反应液可按照说明书进行配置，一般条件是向干粉瓶中加入10mL R1原液，室温 手动匀速摇瓶10min即可。标准品用所配置的PBST裂解液按照1:4的比例进行 稀释，单独用EP管进行分装，以免对原装校准品造成污染，结束后立即放入4工 贮存。2.2 BCA蛋白浓度测定试剂盒BCA法是应用较广的测定蛋白质浓度的方法。原理为双缩脲反应，即在碱性环境下蛋白质将二价酮离子还原成一价酮离子，产生一种紫蓝色复合物，这种复合物在 一定波长处有较高的吸光值，同时反应产物量与蛋白质的浓度成正比。试剂盒中所 提供的蛋白标准品（BSA）为实验者设置标准曲线提供了便捷。试剂盒可室温保存， 但蛋白标准品（BSA）需负20工保存。2.3 配制蛋白标准品和工作液配制BSA标准液：1）向30mg BSA标准品中加入1mL蛋白标准品配制液，充 分溶解后配制成30mg/mL的蛋白标准母液，配置后应立即稀释使用。2）取适量 浓度为30mg/mL的蛋白标准母液，稀释至终浓度为2mg/mL。标准品稀释液为 蛋白样品的裂解液，原则上是：蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用该溶液稀释（也可用0.9%的Nacl或PBS溶液进行稀释）。配制BCA工作液：1）计算实验中所需要的BCA工作液总体积公式：BCA工作 液总体积=（标准品+待测样品）x重复数x每个样品所需要的BCA工作液。2）配制 BCA工作液：在50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（比例为 A:B=50:1），使其充分混匀。BCA试剂B加入BCA试剂A中后，立即浑浊，摇匀 后则立即变澄清。待一切准备就绪，正式开始实验前，预冷4工离心机，准备好足够冰盒、冰袋或者 铝块（铝块传导温度快），将负80工样本取出，用长镊子夹住EP管，置于铝块或冰 上。（1）加入200pL事先配制的裂解液进行匀速研磨，尽量降低研磨过程中摩擦产热， 研磨速度为10次/分（研磨器可使用成品，需事先将研磨棒进行灭菌，一种样本用 根，切勿混淆；若没有成品研磨器，可用干净的1000pL枪头制作简易的研磨棒。 用酒精灯灼烧枪头尖部，塑料制品遇火融化，枪头融为闭塞状，可用1.5mL EP管 测试与管底契合程度，按照实验需求制作，灭菌备用）。所有的研磨都要在冰上进 行，防止样本降解。（2）待裂解样本溶液呈均匀浑浊样，于4工离心机瞬离30秒，将管壁上残留的样品 溶液轻轻弹下，后置于冰上。将离心好的样品溶液，取出1OOpL上清液到另一个 1.5mL EP管后置于冰上或负80C贮存，待测甘油三酯；剩余100ML用来测定蛋 白含量（鉴于蛋白成分易受温度影响，建议先做蛋白浓度测定）。4.1 甘油三酯的测定将用于测定甘油三酯的1OOpL样本的EP管，置于70C水浴锅煮10min。待到时 间，按照下列表格（表1）加好样品,37C水浴锅加热30min后加样。很多甘油三酯测试盒说明上都以水为背景作为空白对照组，但考虑到果蝇无血液且 数据的严密，所以将裂解液作为背景。30min后，取出用指腹轻弹管壁，充分混 匀。按照上述列表顺序加样，尽量减少加样产生的气泡；如果为了测量的准确，可 同一种样本分别三次加样，取平均值。根据说明书要求的波长进行设置，完毕后进 行读取数据进行分析。计算公式： 甘油三酯校准液浓度本实验雌雄三龄幼虫各取10只进行检测，结果见图1。4.2 蛋白质浓度测定将用于测定的蛋白的100pL样品溶液4C 12000rpm离心10min，吸取BSA反 应液于酶标板，定好点样图，做好标记。吸取离心后样品上清溶液（上样量根据预 实验在标准曲线可测范围显色而定于反应液。设置标准曲线6个点，分别是0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0（mg/mL）,加5pL标准品溶液于反应。将盛有混合液 的酶标板置于37C水浴10min后取出放于室温。然后微孔板加样，加样方法如下:1）各取25pL标准品和待测样品加入到微孔板中2）每孔加入200pL BCA工作液， 振荡30秒充分混匀,37C放置30min 3）冷却到室温，在酶标仪上的562nm波 长处检测吸光度4）根据BSA标准品的吸光度，绘制标准曲线。依据标准曲线和样 品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。置于酶标仪测定，记录分析。见图2。使用BCA蛋白测定法测量时，颜色会随着时间延长而不断加深，且显色反应的速 度和温度相关，所以在实验过程中需注意保持定时和定温，以确保定量精确。每次 测定时，都需重新做相应的标准曲线。根据以上两项结果显示:雌性果蝇三龄幼虫体内甘油三脂和蛋白含量均高于雄性幼 虫，这与雌性幼虫体内雌激素有关。希望通过本实验的提取方法和操作步骤为日后 其他人对果蝇的实验和学习提供技术支持与帮助5,6，本人的提取方法和实验操 作尚有不足，我会在日后的实践操作中继续探索解决实验的瑕疵之处，努力提高实验技术水平。【相关文献】1 饶友生，柴学文,王障凤果蝇一打开生命科学之门的金钥匙J.生物学通报,2008,43(12):8-102 万永奇，谢维生命科学与人类疾病研究的重要模型一一果蝇J.生命科学，2006,(5):425-4293 Justin R，DiAngelo and Morris J. Birnbaum.Regulation of Fat Cell Mass by Insulin in Drosophila melanogasterJ.Molecular and Cellular Biology,2009,6341-63524 Laura Palanker,Musselman, Jill L Fink,et al.Baranski.A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type DrosophilaJ.Disease Models & Mechanisms ，2011，4： 842-8495 王桂梅，王彩霞.CBL教学法在临床病理学教学中的实践和探索J.黑龙江医药科学,2016, 39(2):50-516 栾倩，刘蕾灵芝酸对痫样放电海马神经元2磷酸化ERK1/2水平的影响J.黑龙江医药科 学,2014,37(2):1-3