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果蝇幼虫的甘油三酯和蛋白的测定方法陈洁茹;陈晓伟;杨利敏【摘 要】目的:了解果蝇三龄幼虫甘油三酯和蛋白质的提取方法和操作的注意事项.方法:选取同时间段收集的WT1118果蝇三龄幼虫雌雄各10只,以自制裂解液 PBST进行裂解研磨取材后,利用甘油三酯测定试剂盒(冻干粉型)GPO-PAP法和BCA蛋白质测定试剂盒,测量果蝇幼虫体内甘油三酯和蛋白质含量,对雌雄幼虫的甘 油三酯和蛋白质含量进行分析结果:发现雌性幼虫体内,无论是甘油三酯或蛋白质含 量都高于雄性幼虫结论:以果蝇三龄雌性幼虫各10只为例,雌性幼虫的甘油三酯和 蛋白含量均高于雄性幼虫.期刊名称】黑龙江医药科学年(卷),期】2017(040)004【总页数】3页(P3-4,7)关键词】 果蝇幼虫;提取方法;甘油三酯和蛋白质测试盒测定法;注意事项【作 者】 陈洁茹;陈晓伟;杨利敏【作者单位】 佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯154007;北京大学分子研究所,北京100871;佳木斯大学基础医学院,黑龙江 佳木斯154007;大连大学医学院,辽宁大连 116600正文语种】 中 文【中图分类】R392;R446.5果蝇(Drosophila)是生物科学实验研究中不可缺少的模型,作为经典的模式生物, 本身具有自身特异的优势。首先,它的生长周期快,在25C条件下,大约10 14d可繁殖一代至成虫1,2。所以,为相同条件下,同时期收集同等大小及数量 相同的虫卵提供了条件。其次,果蝇培养基的制作方法已经成熟,可根据不同实验 条件而改变,在此所述为果蝇基础培养基的制法:例如制作200mL培养基,(1)琼 脂:3g(2)酵母:16g(3)玉米面:15g(4)葡萄糖:4g(5)加灭菌的超纯水或三蒸水 补齐,溶质溶剂共200mL。1.1 实验对象、试剂盒及仪器野生果蝇WT1118(来自北京大学生命科学院饶毅实验室),甘油三酯测定试剂盒 (北京普利莱公司),BCA蛋白质测定试剂盒(Therm。科学公司),恒温水浴箱(保恒 恒温技术有限公司)、普通光学显微镜(BH-Z日本Olympus公司)。幼虫和成虫均 可按以下方法对甘油三酯和蛋白质进行提取,但成虫身体成分和杂质较多,对于测 量结果易产生影响,所以以下实验未涉及果蝇成虫的提取。1.2 实验步骤果蝇杂交的设计:首先收集25只未交配的WT1118成虫处女蝇,同15只成 虫雄性果蝇放于同一培养瓶中,放于培养箱中饲养,使它们交配完全。收集虫卵:3d后,于中午12时,将全部果蝇转移到新的培养瓶中,收集时间 为2h(研究表明果蝇每天12 16时内,产卵率偏高),保证虫卵在一个发育时期。 三龄幼虫雌雄分装:将收集两小时虫卵的培养瓶置于培养箱,3d后,当幼虫生 长到三龄期,用钩针或钝头镊子将虫卵移置装有灭过的PBS溶液或超纯水中,在 显微镜下区分雌雄,雌性各10只,用1.5mL EP管分装,注明样品名称(由于三龄 期幼虫会在培养基内爬行,虫体会沾有培养基,会影响测量结果,可在分装前,可 用超纯水清洗虫卵3次,后用无尘纸将虫卵表面的水分吸干)。 (4)贮存方法:入管 后立即放入事先准备好的液氮中,冻存于-80C冰箱(液氮和低温冻存是为了保证幼 虫样本体液不失活)。1.3 裂解液的配置通过查阅文献,可以自制研磨虫体的裂解液PBST(PBS+0.05%Tween20,二者比 例4:1)3,4,配置好后,通过滤膜过滤杂质,将裂解液放于4工冰箱贮存。2.1甘油三脂(TG)诊断试剂盒对于冻干粉型甘油三酯测试盒,实验原理如下:1)甘油三脂+水在脂肪酶催化下生 成甘油+脂肪酸2)甘油+ATP在甘油激酶的作用在生成甘油-3-磷酸+ADP 3)甘油- 3-磷酸+氧气在甘油磷酸氧化酶催化下生成磷酸二羟丙酮过氧化物酶+双氧水 4)双 氧水+4-氨基安替比林+对氯苯酚在过氧化物酶作用下生成醌染料+水+氯化氢,醌 染料在波长500nm有最大光吸收,颜色的强度与血清中甘油三酯含量成正比。反应液可按照说明书进行配置,一般条件是向干粉瓶中加入10mL R1原液,室温 手动匀速摇瓶10min即可。标准品用所配置的PBST裂解液按照1:4的比例进行 稀释,单独用EP管进行分装,以免对原装校准品造成污染,结束后立即放入4工 贮存。2.2 BCA蛋白浓度测定试剂盒BCA法是应用较广的测定蛋白质浓度的方法。原理为双缩脲反应,即在碱性环境下蛋白质将二价酮离子还原成一价酮离子,产生一种紫蓝色复合物,这种复合物在 一定波长处有较高的吸光值,同时反应产物量与蛋白质的浓度成正比。试剂盒中所 提供的蛋白标准品(BSA)为实验者设置标准曲线提供了便捷。试剂盒可室温保存, 但蛋白标准品(BSA)需负20工保存。2.3 配制蛋白标准品和工作液配制BSA标准液:1)向30mg BSA标准品中加入1mL蛋白标准品配制液,充 分溶解后配制成30mg/mL的蛋白标准母液,配置后应立即稀释使用。2)取适量 浓度为30mg/mL的蛋白标准母液,稀释至终浓度为2mg/mL。标准品稀释液为 蛋白样品的裂解液,原则上是:蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用该溶液稀释(也可用0.9%的Nacl或PBS溶液进行稀释)。配制BCA工作液:1)计算实验中所需要的BCA工作液总体积公式:BCA工作 液总体积=(标准品+待测样品)x重复数x每个样品所需要的BCA工作液。2)配制 BCA工作液:在50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B(比例为 A:B=50:1),使其充分混匀。BCA试剂B加入BCA试剂A中后,立即浑浊,摇匀 后则立即变澄清。待一切准备就绪,正式开始实验前,预冷4工离心机,准备好足够冰盒、冰袋或者 铝块(铝块传导温度快),将负80工样本取出,用长镊子夹住EP管,置于铝块或冰 上。(1)加入200pL事先配制的裂解液进行匀速研磨,尽量降低研磨过程中摩擦产热, 研磨速度为10次/分(研磨器可使用成品,需事先将研磨棒进行灭菌,一种样本用 根,切勿混淆;若没有成品研磨器,可用干净的1000pL枪头制作简易的研磨棒。 用酒精灯灼烧枪头尖部,塑料制品遇火融化,枪头融为闭塞状,可用1.5mL EP管 测试与管底契合程度,按照实验需求制作,灭菌备用)。所有的研磨都要在冰上进 行,防止样本降解。(2)待裂解样本溶液呈均匀浑浊样,于4工离心机瞬离30秒,将管壁上残留的样品 溶液轻轻弹下,后置于冰上。将离心好的样品溶液,取出1OOpL上清液到另一个 1.5mL EP管后置于冰上或负80C贮存,待测甘油三酯;剩余100ML用来测定蛋 白含量(鉴于蛋白成分易受温度影响,建议先做蛋白浓度测定)。4.1 甘油三酯的测定将用于测定甘油三酯的1OOpL样本的EP管,置于70C水浴锅煮10min。待到时 间,按照下列表格(表1)加好样品,37C水浴锅加热30min后加样。很多甘油三酯测试盒说明上都以水为背景作为空白对照组,但考虑到果蝇无血液且 数据的严密,所以将裂解液作为背景。30min后,取出用指腹轻弹管壁,充分混 匀。按照上述列表顺序加样,尽量减少加样产生的气泡;如果为了测量的准确,可 同一种样本分别三次加样,取平均值。根据说明书要求的波长进行设置,完毕后进 行读取数据进行分析。计算公式: 甘油三酯校准液浓度本实验雌雄三龄幼虫各取10只进行检测,结果见图1。4.2 蛋白质浓度测定将用于测定的蛋白的100pL样品溶液4C 12000rpm离心10min,吸取BSA反 应液于酶标板,定好点样图,做好标记。吸取离心后样品上清溶液(上样量根据预 实验在标准曲线可测范围显色而定于反应液。设置标准曲线6个点,分别是0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0(mg/mL),加5pL标准品溶液于反应。将盛有混合液 的酶标板置于37C水浴10min后取出放于室温。然后微孔板加样,加样方法如下:1)各取25pL标准品和待测样品加入到微孔板中2)每孔加入200pL BCA工作液, 振荡30秒充分混匀,37C放置30min 3)冷却到室温,在酶标仪上的562nm波 长处检测吸光度4)根据BSA标准品的吸光度,绘制标准曲线。依据标准曲线和样 品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。置于酶标仪测定,记录分析。见图2。使用BCA蛋白测定法测量时,颜色会随着时间延长而不断加深,且显色反应的速 度和温度相关,所以在实验过程中需注意保持定时和定温,以确保定量精确。每次 测定时,都需重新做相应的标准曲线。根据以上两项结果显示:雌性果蝇三龄幼虫体内甘油三脂和蛋白含量均高于雄性幼 虫,这与雌性幼虫体内雌激素有关。希望通过本实验的提取方法和操作步骤为日后 其他人对果蝇的实验和学习提供技术支持与帮助5,6,本人的提取方法和实验操 作尚有不足,我会在日后的实践操作中继续探索解决实验的瑕疵之处,努力提高实验技术水平。【相关文献】1 饶友生,柴学文,王障凤果蝇一打开生命科学之门的金钥匙J.生物学通报,2008,43(12):8-102 万永奇,谢维生命科学与人类疾病研究的重要模型一一果蝇J.生命科学,2006,(5):425-4293 Justin R,DiAngelo and Morris J. Birnbaum.Regulation of Fat Cell Mass by Insulin in Drosophila melanogasterJ.Molecular and Cellular Biology,2009,6341-63524 Laura Palanker,Musselman, Jill L Fink,et al.Baranski.A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type DrosophilaJ.Disease Models & Mechanisms ,2011,4: 842-8495 王桂梅,王彩霞.CBL教学法在临床病理学教学中的实践和探索J.黑龙江医药科学,2016, 39(2):50-516 栾倩,刘蕾灵芝酸对痫样放电海马神经元2磷酸化ERK1/2水平的影响J.黑龙江医药科 学,2014,37(2):1-3
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