大肠杆菌感受态细胞制备和转化

第一节 概 述 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构 建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从 一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受 体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源 DNA 。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状 的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变体(R-,M)它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗 传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCI，RbCI(KCI)等化学试2剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分 子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制， 表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞 在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子 的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl (KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl法简便易行，且其转化效率完2 全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积 15%的无菌甘油于-70C保存(半年)，因此CaCl法为使用更广泛。2为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从一7 0C或-20C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密 度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5a菌 株的OD600为0.5时，细胞 密度在5x107个/ml左右(不同的菌株情况有所不 同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA (cccDNA )。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50卩1的感受 态细胞达到饱和。一般情况下， DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%3. 试剂的质量：所用的试剂，如CaCl等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用 超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷2暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， tip 头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或 杂 DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl处理，使其处于感受态，然 后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Am pr ）,可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS,则在含Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导 入了 pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步 鉴定。第二节 材料、设备及试剂一、材料E. coli DH5a菌株：R_,M_,Amp_； pBS质粒DNA :购买或实验室自制，eppe ndorf 管。二、设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水 浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。三、试剂1. LB 固体和液体培养基。2. Amp 母液。3含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60C 左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4麦康凯培养基（Maconkey Agar）:取52g麦康凯琼脂，加蒸馏水1000ml，微 火煮沸至完全溶解，高压灭菌，待冷至60C左右加入Amp储存液使终浓度为5 Oug/ml，然后摇匀后涂板。5.0.05mol/L CaCl 溶液：称取 0.28g CaCl （无水，分析纯），溶于 50ml 重蒸水22中，定容至100ml,高压灭菌。6含15%甘油的0.05mol/L CaCl :称取0.28g CaCl （无水，分析纯），溶于5220ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。第三节 操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5a单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基 中，37C下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1: 50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37C振荡培养2-3小时至OD600 = 0.5左右。二、感受态细胞的制备 （ CaCl 法）21. 将培养液转入离心管中，冰上放置10分钟，然后于4C下3000g离心10分 钟。2. 弃去上清，用预冷的0.05mol/L的CaCI溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上放置215-30分钟后，4C下3000g离心10分钟。3. 弃去上清，加入4ml预冷含15%甘油的0.05moI/L的CaCI溶液，轻轻悬浮2细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。4. 感受态细胞分装成2001的小份，贮存于-70C可保存半年。三、转化1. 从-70C冰箱中取200pl感受态细胞 悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置 冰上。2. 加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng,体积不超过10卩1），轻轻摇匀， 冰上放置 30 分钟后。3. 42C水浴中热击90秒或37C水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分 钟。4. 向管中加入1ml LB液体培养基（不含Amp），混匀后37C振荡培养1小时， 使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr ）。5. 将上述菌液摇匀后取100pl涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小 时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37C培养16-24小时。同时做两个对照：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。此组 正常情况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5卩1菌液涂 布于不含抗生素的 LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算 出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数=菌落数x稀释倍数x转化反应原液总体积/涂板菌液体积 转化频率(转化子数/每mg质粒DNA )=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数=对照组2菌落数x稀释倍数X菌液总体积/涂板菌液体积感受态细胞 转化效率=转化子总数/感受态细胞总数注意本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但 它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂 板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩 (如离心)， 才能较准确的计算转化率。BL21 (DE3)菌株基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB (rB- mB-)入(DE3 lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5)。特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7 噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于入噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区 整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。用途：蛋白质表达。大肠杆菌高校转化：关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简 单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对 于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年Gene上刊登 的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了 GLP 文件，但其中仍有许 多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮 助。1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章 上必讲的，毋庸置疑。2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量 代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态 的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml, 50ml/250 ml。3、培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包 括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后， 可以测一下 pH 值，不要低于 6.0，最好在 6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧 代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。4、培养后的0D值。其实这是一个非常重要的参数，只是当0D值大到一定的 程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调0D不得 大于0.6、0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。 因此需要在 OD 值的两方面影响中找一个平衡点。5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的M g2+离子时，该 方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用 20mM MgCl2 做为培 养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这 样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了 Inoue 的高效感受态制 备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受 态的效率增加。8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存 于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做 实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞：下面的简单方案是 Clhen 等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感 受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落, 这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用 于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案I快速，重复性更好。该法制备的感受态 细胞可贮存于-70C，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。1）从于37C培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径2 3 mm）, 转到一个含有100ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37C剧烈振摇培养约 3小时（旋转摇床， 300 转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过 108 细 胞ml,可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与 菌株之间，OD600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过 测量特定大 肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的OD600值，并 将各黧度的增减物铺于无抗生素的LB琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从 而使分光光度读 数得到标化。2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50ml 聚 丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0C。切记： 下述所有步骤均需无菌操作。3）于4C用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分 钟，以回收细胞。4）倒出培养液，将管倒置1分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。5）以 10ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发 现将1mol/L CaCl2贮存液用纯水（Mille-Q级或与其相当的级别）配制以10 ml小份贮存于-20C煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀 释至100mlk,用Nalgene滤器（0.45m孔径）过滤除菌，然后骤冷到0C即 可。对于大多数大肠肝菌菌株（除MC1061夕卜），在这一步采用TFB （见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。6）于4C以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。7）倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。8）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2或TFB，见表1.3 和步骤5）注重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于70C冻存有 关讨论请参见53页本节（二）步骤11）b.c）。在这些条件下，尽管长期保存后 转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich（1979）曾 表明细胞可 以于4C在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小 时内，转化效率增加35倍，然后降低到初始水平。9）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200pl转移到无菌的微量离 心管中，每管加DNA （体积810|，DNA850ng），轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30分钟。10）将管放到预加温到42C的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90 秒,不 要摇动试管。11 ）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 2分钟。12）每管加800ISOC培养基（见附录A）。用水溶将培养基加温至37C, 然后将管转移到37C摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生 素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转 速不超过225转/分）。13）将适当体积（每个90mm平板可达200pI）已转化的感受态细胞转移到含2 Ommol/L MgSO4和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。如培养物体积太小（1 0pl）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂 平板表 面。如在一个90mm平板上铺200pl以上的感受态细胞，应离心浓缩细 胞，然后用适量SOC轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转 化混合 物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青 霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青 霉素抗性功的 增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因 为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏物质的缘故。14）将平板置于室温直至液体被吸收。15）倒置平皿，于37C培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗 性，用转化细胞铺增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落），于3 7C培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化可将0内酰胺酶分泌 到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时密度太高或 培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用 氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60pg/ml增至100pg /ml, 可使情况有所改善，但不能彻底根除之。