抗原抗体反应的应用

第三节 抗原抗体反应的应用一、免疫沉淀与免疫凝集一、免疫沉淀与免疫凝集二、免疫标记二、免疫标记三、免疫定位分析三、免疫定位分析四、抗原抗体反映的其他应用四、抗原抗体反映的其他应用一、免疫沉淀与免疫凝集v溶液中的环状沉淀试验溶液中的环状沉淀试验n在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼看见的沉淀物。看见的沉淀物。n在液相中形成的沉淀不容易观察判断，在液相中形成的沉淀不容易观察判断，利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于观察。沉淀线便于观察。对照 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160抗血清稀释度抗原沉淀线抗血清环状沉淀实验示意图环状沉淀实验示意图2.凝胶扩散沉淀 n抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散，相遇形成沉淀。遇形成沉淀。n以琼脂扩散实验较为常用。以琼脂扩散实验较为常用。v单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗单向免疫扩散：抗体混于琼脂中，小孔中加入抗原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。原，抗原向周围均匀扩散，与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。v双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两双向免疫扩散：抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体的定孔之间形成白色沉淀线，可用于抗原或抗体的定性检测。性检测。1)缺点：时间长，灵敏度低缺点：时间长，灵敏度低。抗体混于琼脂抗体混于琼脂凝胶中制板凝胶中制板环的直径与抗原环的直径与抗原含量成正相关含量成正相关n双向免疫扩散双向免疫扩散沉淀线形状的变化显示抗原间是否沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇存在共同的抗原决定簇。AbAg1，3AbAb3.电泳条件下的沉淀反应v血清免疫电泳：患者血清和正常人血清分别血清免疫电泳：患者血清和正常人血清分别放在凝胶上近负极端的小孔中进行电泳分离放在凝胶上近负极端的小孔中进行电泳分离后，在两种抗原之间沿电泳方向挖一平行的后，在两种抗原之间沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清进行双扩散。小槽，加入抗血清进行双扩散。v火箭电泳：单向免疫扩散与电泳结合的一种火箭电泳：单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。在电场作用下抗原向正极扩散，与抗方法。在电场作用下抗原向正极扩散，与抗体形成沉淀峰（火箭型沉淀线）。需时短，体形成沉淀峰（火箭型沉淀线）。需时短，能检测微量抗原。能检测微量抗原。v对流电泳对流电泳(电渗析电渗析)：在电场作用下抗原与抗：在电场作用下抗原与抗体相对扩散，形成沉淀线。对流电泳较双扩体相对扩散，形成沉淀线。对流电泳较双扩快速和灵敏。快速和灵敏。4.免疫共沉淀免疫共沉淀 在溶液中两种或两种以上蛋白质相互在溶液中两种或两种以上蛋白质相互作用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分作用，可以通过免疫共沉淀惊醒鉴定和分离。离。蛋白质相互作用通过非共价结合，用蛋白质相互作用通过非共价结合，用针对其中一种蛋白质的特异性抗体进行的针对其中一种蛋白质的特异性抗体进行的免疫沉淀，与该蛋白相互作用的其他蛋白免疫沉淀，与该蛋白相互作用的其他蛋白也同时被沉淀下来。也同时被沉淀下来。如果第一抗体结合后再加入第二抗体如果第一抗体结合后再加入第二抗体或或A A蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物蛋白可使抗原抗体形成更大的复合物易于沉淀，也可通过加入聚乙二醇破坏水易于沉淀，也可通过加入聚乙二醇破坏水化膜加速沉淀形成。化膜加速沉淀形成。免疫共沉淀原理图解免疫共沉淀原理图解5.免疫凝集n 大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结大颗粒性抗原如细胞或细菌等与相应的抗体结合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝合后能使康媛颗粒发生凝集，形成肉眼易见的凝集小块，即为免疫凝集。集小块，即为免疫凝集。n 凝集反应的发生分为两个阶段：凝集反应的发生分为两个阶段：1 1、抗原抗体、抗原抗体的特异性结合阶段；的特异性结合阶段；2 2、出现肉眼可见的凝集现、出现肉眼可见的凝集现象。象。n 最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即最常见的免疫凝集反应是红细胞凝集，即血凝反应。血凝反应。n 血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细血凝反应的抗体识别的抗原可以是红细胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可胞表面的天然抗原，如血凝鉴定试验；也可以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早以通过交联将红细胞连接上其他抗原，如早期的期的HBsAgHBsAg血凝试验。血凝试验。n细菌的血凝试验常用来细菌的血凝试验常用来 对细菌进行鉴定与分对细菌进行鉴定与分型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。型，如沙门菌鞭毛抗原的分析等。n免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度免疫凝集试验虽然简便，但是受反应灵敏度的限制，在实际应用越来越少。的限制，在实际应用越来越少。二、免疫标记n免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易免疫标记技术：将已知抗体或抗原标记上易显示的物质（示踪物），通过检测标记物反显示的物质（示踪物），通过检测标记物反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。抗原或抗体。n目前有四种方法：目前有四种方法：v放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最放射免疫分析法：以同位素为示踪物，为最灵敏、可靠的免疫标记技术。灵敏、可靠的免疫标记技术。v酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）v荧光与发光免疫分析荧光与发光免疫分析1.亲和标记的免疫分析亲和标记的免疫分析标记免疫技术=抗原抗体反应抗原抗体反应示踪物标记示踪物标记灵敏性灵敏性特异性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术1.放射免疫分析法n标记同位素：标记同位素：125I，131I、3H和和35Sn检测方法：检测方法：液相体系用液体闪烁仪计数；液相体系用液体闪烁仪计数；固相体系用固相体系用X射线胶片显影。射线胶片显影。直接法与竞争法检测检测检测检测竞争法基本原理 采用定量的标记抗原（Ag）和非标记抗原（Ag）竞争性结合有限量特异性抗体（Ab）的反应。放射性同位素标记分析法示意图放射性同位素标记分析法示意图2.酶联免疫吸附试验（ELISA）(enzyme linked immunosorbent assay)(1)定义：抗原与抗体吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，抗原与抗体反应后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。(2)测试方法：可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。(3)测试过程v使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性保持其免疫活性（固相抗原抗体的形成）（固相抗原抗体的形成）v在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体（抗原抗体反应）反应）v用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。比例。（酶标抗原抗体复合物的分离）（酶标抗原抗体复合物的分离）v加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。析。（显色反应）（显色反应）酶酶来源来源底物底物检测波长检测波长/nm/nm碱性磷酸酶碱性磷酸酶牛小肠黏膜牛小肠黏膜对硝基酚磷酸盐对硝基酚磷酸盐405405过氧化物酶过氧化物酶辣根辣根邻苯二胺邻苯二胺/过氧化氢过氧化氢492492-半乳糖酶半乳糖酶大肠杆菌大肠杆菌对硝基酚对硝基酚-半乳糖半乳糖405405常用标记的酶及其底物常用标记的酶及其底物(4)ELISA技术类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，在这种测定方法中有3种必要的试剂：v固相的抗原或抗体，固相的抗原或抗体，v酶标记的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，v酶作用的底物。酶作用的底物。双抗体夹心法(直接夹心法）特点：v非竞争结合反应v常用于抗原的检测v适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测v所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 间接法捕获法（反向间接法）n主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。直接法 用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗原，其量与产物颜色成正比。3、均相酶免疫吸附测定 基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记酶的活性发生改变的原理，在不将复合物与游离酶标抗体分离的情况下，直接测定系统中总的标记酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。主要用于主要用于小分子抗原小分子抗原或或半抗原半抗原的检测的检测.酶放大免疫测定技术:（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）n基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。斑点酶免疫试验(dot-ELISA)3.荧光与发光免疫分析n概念：以荧光素作为示踪物，通过荧光显微镜观察进行定位检测。n荧光化合物：异硫氰荧光素、罗丹明荧光素。n基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上与标本中的待检抗原特异结合，采用高发光效率的点光源，透过滤色板发出一定波长的光，使结合在标本上的荧光素被激发而产生荧光，借助荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态，来判断有无待检抗原或抗体。荧光免疫测定技术时间分辨荧光免疫分析法n原理：稀土铕离子Eu3+螯合物标记抗体后，抗体与固相抗原结合，抗体上的Eu3+在紫外光（340nm）激发下，与增强液中的-二酮体重新形成一种微胶体螯合物，发出长寿命的高强度荧光（613nm），比未激发时增强了100万倍，可用时间分辩荧光计记录。EuEuEuEuEu发射高强度荧光时间分辩荧光计记录加入增强液紫外光激发（340nm）时间分辨荧光免疫分析原理时间分辨荧光免疫分析原理直接法间接法夹心法间接夹心法4.亲和标记的免疫分析n亲和标记物：金黄色葡萄球菌的A蛋白、生物素（维生素）、地高辛（小分子药物）n原理：金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG的Fc有高度亲和力。用酶、同位素和荧光素等标记A蛋白，与抗体结合，可用于抗原抗体反应的分析。A蛋白蛋白亲和标记的免疫分析亲和标记的免疫分析三、免疫定位分析1.免疫荧光定位分析2.酶标记免疫定位3.免疫电子显微镜技术1.免疫荧光定位分析n用不同发光颜色的荧光化合物标记抗体用于免疫细胞化学、免疫组织化学检测。（荧光化合物+抗体）-生物大分子（抗原）在细胞或组织中的表达和定位n荧光素：异硫氰荧光素、异硫氰四甲基罗丹明n荧光显微镜观测n荧光激活细胞分拣器（流式细胞仪）n应用：CD4+、CD8+T细胞亚群计数n原理：流式细胞仪产生分析的电信号生要是光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分析和分选细胞。2.酶标记免疫定位n抗原（组织或细胞内）抗原（组织或细胞内）+第一抗体第一抗体+第二第二抗体酶抗体酶+底物底物不溶于水的有色产物不溶于水的有色产物（1）酶标免疫组织化学）酶标免疫组织化学 固相抗原为组织切片或细胞样品。固相抗原为组织切片或细胞样品。（2）免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）蛋白质经凝胶电泳后，形成不同的条带，蛋白质经凝胶电泳后，形成不同的条带，转移至硝酸纤维膜上，用酶标记的抗体进转移至硝酸纤维膜上，用酶标记的抗体进行显色反应，可确定目的蛋白的有无，或行显色反应，可确定目的蛋白的有无，或分子量大小。分子量大小。分三个阶段进行:vSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）v转移硝酸纤维素膜 v酶免疫定位 免疫印迹法原理示意图 3.免疫电子显微镜（免疫电子显微镜（IEM）技术）技术n电子显微镜技术与免疫反应相结合的一项技术。n优点：提高了电镜观察的特异性。如形态相同，但结构和组成不同的生物粒子，细胞器或病毒粒子。n种类：l 一类是先用抗体捕捉抗原，然后用磷钨酸负染色观察。l另一类是用金标记抗体进行抗原定位。胶体金与抗体Fc段结合。四、抗原抗体反应的其他应用v免疫亲和层析n原理：任何一对抗原-抗体的组分之一与固相基质交联后均可用于另一组分的纯化。广泛用于蛋白质抗原的分离纯化。n固相基质：琼脂糖、葡聚糖抗体+琼脂糖上样洗涤洗脱免免疫疫亲亲合合层层析析示示意意图图OD280检测凝胶电泳2.生物感应器与抗体芯片n机理：抗原与抗体在相互结合后，它们的结构发生了变化，一些次级键参与结构的变化。这种结构的改变通过电场效应的改变可以被检测到。n可以判断抗原抗体的结合是否发生及发生的强度。n组成：v生物受体（抗体）v转导体v电子放大处理器转 导 体Y YY Y Y Y Y Y信号放大抗体芯片抗体芯片n抗体芯片是固相化间接免疫反应和免疫生物抗体芯片是固相化间接免疫反应和免疫生物感应器的综合。感应器的综合。n大量不同种类的抗体通过密集布阵在玻片或大量不同种类的抗体通过密集布阵在玻片或其他经过修饰的载体上，经过不同处理的细其他经过修饰的载体上，经过不同处理的细胞蛋白质用荧光染料染色后再与玻片上的抗胞蛋白质用荧光染料染色后再与玻片上的抗体温育，经过洗涤处理后出去非特性吸附的体温育，经过洗涤处理后出去非特性吸附的蛋白质，结合的蛋白质通过光电扫描测定其蛋白质，结合的蛋白质通过光电扫描测定其强度。强度。