第四章营养和培养基2

第四节第四节 培养基培养基Foods of Microorganisms1887培养基的概念培养基的概念 人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合营养基质。培养基的条件任何培养基都应该具备微生物生长所需的六大营养要素 合适的营养素种类 合适的营养素比例培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水l 培养基中应含满足微生物生长发育的：水分、碳源、氮源、生长因子以及基本的离子，磷、硫、钠、钙、镁、钾和铁及各种微量元素。l 此外，培养基还应具有适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。一、选用和设计培养基的原则和方法一、选用和设计培养基的原则和方法（一）选用和设计培养基的原则 1、目的明确 2、营养协调 3、理化条件适宜 4、经济节约在微生物学的研究和生产实践中，配制合适的培养基是一项最基本的要求。1、目的明确、目的明确 培养对象及产物 培养目的不同，原料的选择和配比不同。培养不同的微生物应根据其特点采用不同的培养条件。营养类型及种类不同的微生物需要不同的培养基。自养型微生物的培养基：不能含有机物，由简单的无机物组成。异养型微生物需要在培养基中添加有机物，如异养型细菌常用牛肉 膏蛋白胨琼脂培养基。光能营养型需要提供光照。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的营养要求既有共性也有特性，应选用不同的培养基。放线菌：麦芽汁培养基；酵母菌：高氏培养基；霉菌：察氏培养基或豆芽汁等培养基。主要几类微生物所需的培养基各不相同。2、营养协调、营养协调 微生物细胞组成元素调查分析，是培养基设计的重要参考依据。培养基中营养物质浓度合适时，微生物才能生长良好。浓度过低，不能满足需要；浓度过高，对其生长有抑制作用，如高渗溶液的抑菌作用。营养物质之间的浓度配比，直接影响微生物的生长繁殖或代谢产物的积累。不同营养物质之间的比例：大体十倍递减。营养协调原则中需要注意的几点营养协调原则中需要注意的几点 其中碳氮比（C/N）的影响较大。碳氮比（C/N Ratio）指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮源中氮原子摩尔数之比 指培养基中碳源物质与氮源物质的质量比值，也指培养基中还原糖的含量与粗蛋白含量的比值 碳氮比的重要性 碳源不足，菌体易早衰；氮源过量，菌体生长过旺，代谢产物积累少；氮源不足，菌体生长过慢。真菌：高C/N比 细菌：低C/N比我们可以通过控制培养基碳氮比，来调控菌体生长或代谢产物的积累。培养基中各矿质元素间的比例要适当，防止单盐毒害作用。某种氨基酸过多，发生氨基酸不平衡，将会影响对其它氨基酸的吸收。微量元素除特别需要外，一般不另外供给。因为培养基中所加牛肉膏、蛋白胨、糖及其它无机盐中均含有一定量的微量元素。用自来水配制培养基时，微量元素更不成问题。3、理化条件适宜、理化条件适宜 培养基的理化条件 pH 水分活度（Aw）和渗透压 氧化还原电位（Eh）(1)pH 各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，各大类微生物都有合适的生长pH范围。通常培养条件 细菌和放线菌：pH7.07.5 酵母菌和霉菌：pH4.56.0范围内生长 在微生物生长繁殖和代谢过程中，常因营养物质的消耗和代谢产物的积累，引起pH变化，导致微生物生长缓慢、代谢产物产量下降。为避免此现象，维持培养基pH的相对恒定，通常加入pH 缓冲剂，进行调节。pH的内源调节 磷酸盐缓冲液（KH2PO4、K2HPO4）不溶性碳酸盐CaCO3或碳酸氢钠 pH的外源调节指在培养过程中不断或间断向液体培养基中流加酸液或碱液的调节方法。(2)水分活度（水分活度（Aw）和渗透压）和渗透压 微生物在等渗环境中良好生长高渗环境生长受抑：质壁分离低渗环境脆弱菌体易破裂死亡：吸水膨胀 微生物有一定的适应渗透压变化的能力细胞内渗透压的调节机制 渗透压大小由溶液中所含的的分子或离子的质点数决定 几个数据G+细菌：20 atmG-细菌：510 atm水分活度水分活度 水分活度Aw相同温度和压力下，体系中溶液的水蒸汽压与纯水的蒸汽压之比。亦等于该溶液的百分相对湿度。表示微生物可实际利用的游离水的含量 Aw=p/p0 微生物生长的最低Aw 普通细菌：0.91（嗜盐细菌0.75,葡萄球菌0.85）普通酵母：0.88（耐高渗酵母：0.60）普通霉菌：0.80（干性霉菌：0.65）常见食品的水分活度常见食品的水分活度物品名称纯 水人 血新鲜水果海 水家畜鲜肉面 包糖酱、火腿Aw1.0000.9950.970.980.980.970.950.90物品名称香 肠果 酱饱和蔗糖液咸 鱼糖果、干果谷物、面粉奶 粉Aw0.850.800.760.750.700.650.20 度量某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势的一种指标。（3）氧化还原电位（）氧化还原电位（Eh）一般好氧菌：0.1伏以上可生长，0.3-0.4伏适宜兼性厌氧菌：0.1伏以上有氧呼吸；0.1伏以下进行发酵厌氧菌：低于0.1伏的条件下生长不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同。影响Eh的因素 与氧分压有关 受pH影响。pH或O2，Eh增加通气量（如振荡培养、搅拌）提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，可增加Eh；煮沸驱氧后将培养基与空气隔绝，以及在培养基中加入抗坏血酸（0.1%）、硫化氢（0.025%）、半胱氨酸（0.05%）、铁屑等可降低Eh。4、经济节约、经济节约 配制培养基时应尽量选用廉价且易获得的原料做培养基的成分。特别是在发酵工业中，以降低生产成本。以粗代精：糖蜜V蔗糖 以野代家：粗木薯粉V优质淀粉 以废代好黄豆浆水造纸厂亚硫酸废液（含戊糖）以简代繁 以无机氮代蛋白 以纤代糖 以烃代粮 以国代进选用粗原料-对微生物而言，纯度较高的精原料(如蔗糖)其营养成分倒不 如纯度低的粗原料(如红糖)完全。粗原料中的所谓“杂质”能提供微生物多种营养要素，且价格较低。设计培养基时应尽量利用粗原料。-选用工农业副产品-微生物发酵所需的标准原料(如碳源中的糖、淀粉及氮源中蛋白胨等)价格昂贵，农副产品及其它工业的下脚料等价格低廉。故在碳源选择上，应选用富含淀粉的薯类、废糖蜜、麸皮、酒糟、酱渣及纸厂含有戊糖等成分的亚硫酸废液等代替纯淀粉和糖类；在氮源上，用棉子饼粉、蚕蛹粉、豆饼粉及花生饼粉等副产物代替黄豆粉等蛋白质原料。-选用无机氮源-“无机氮”指硝酸盐、铵盐和尿素等。在培养基中用无机氮作氮源，让微行物将其转化为氨基酸、蛋白质等含氮有机物，生产菌体蛋白。微生物蛋白的生产效率远高于植 物和动物蛋白，可补充目前人类食物及动物饲料中蛋白质严重不足。-选用低浓度培养基-一般认为培养基中营养物质种类愈多、含量愈高其营养 愈丰富，发酵效果愈好。但营养物质过多，会造成溶氧量下降，渗透压增大等副效应，对微生物生长不利。故培养基设计应充分考虑营养物的种类和含量，用“稀薄”培养基代替营养物过“浓”的丰富培养 基，节约原料，提高发酵产物产量（二）选用和设计培养基的方法（二）选用和设计培养基的方法 生态模拟自然基质或模拟：初级天然培养基 肉汤、鱼汁 果汁 湿润的麸皮米糠、米饭、面包 查阅文献 精心设计：优选法或正交实验 试验比较 培养皿琼脂平板 摇瓶培养 台式发酵罐二、培养基种类二、培养基种类 对培养基成分的了解 培养基的物理状态 培养基对微生物的功能按对培养基成分的了解来分按对培养基成分的了解来分 天然培养基 合成培养基 半合成培养基天然培养基天然培养基 利用化学成分还不清楚或不恒定的天然有机物制成的培养基 牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米粉、马铃薯、麸皮、动物组织器官浸出液、麦芽汁培养基 特点 营养丰富 重复性差:成分复杂，每批成分不稳定 适于实验室制备基础培养基及大生产种子培养基合成培养基合成培养基 用化学成分和量都确切知道的高纯化学试剂配成的培养基 高氏一号（淀粉硝酸盐培养基）柠檬酸盐培养基 葡萄糖铵盐培养基 蔗糖硝酸盐培养基（察氏培养基）特点重现性好、价格高、配制繁 常用于研究,不宜于大规模生产。半合成培养基半合成培养基 由部分天然有机物和部分化学药品配成的培养基。马铃薯蔗糖培养基 特点成本低、配制方便，用于生产、试验 液体培养基 固体培养基 半固体培养基 脱水培养基按物理状态分按物理状态分液体培养基（液体培养基（Liquid Medium）未加任何凝固剂。在用液体培养基培养微生物时，可以通过振荡或搅拌增加培养基的通气量，同时使营养物质分布均匀。应用 微生物生理、代谢研究 获得大量菌体获得大量菌体：营养物质以溶质状或高度分散态存在，微生物能充分与养料接触，微生物生长快 发酵工业大规模生产发酵工业大规模生产：工业上常采用液体深层发酵法生产抗生素等多种微生物产品。固体培养基（固体培养基（Solid Medium）外观呈固态的培养基，可在液体培养基中加入凝固剂成固体胨状 凝固剂：对大多数微生物来说，琼脂是最理想的凝固剂。1.52%琼脂：聚半乳糖的硫酸酯 512%明胶：蛋白质理想的凝固剂应具备的条件 1、不被所培养的微生物分解利用；2、在微生物生长的范围内保持固体状态。在培养嗜热细菌时，为防止由于高温引起的培养基液化，通常在培养基中适当增加凝固剂。3、凝固点温度不能太低，否则不利于微生物的生长。4、对所培养的微生物无毒害作用。5、在灭菌过程中不被破坏。6、透明度好、黏着力强。7、配制方便且价格低廉。常用的凝固剂有琼脂、明胶、硅胶等，对大多数微生物来说，琼脂是最理想的凝固剂。固体培养基的类型固体培养基的类型 固化培养基凝固剂：琼脂、明胶、海藻酸胶、脱乙酰吉兰糖胶、多聚醇 非可逆固化培养基血清培养基无机硅胶培养基 天然固态培养基麸皮、米糠、木屑、纤维、稻草粉马铃薯片、胡萝卜条、大米、麦粒、大豆、面包动植物组织培养基 滤膜：醋酸纤维薄膜固体培养基的应用固体培养基的应用 应用广泛 菌种分离计数 选种育种 检验杂菌 菌种保藏 生物活性物质的生物测定 真菌孢子 微生物固体培养和大规模生产 天然固体培养基如小米、大米、麸皮及马铃薯等可直接用作培养基培养霉菌、放线菌。小米麸皮等物质含有一定量碳源和能源物质，又含有大量矿质元素、微量元素和生长素，而且质地疏松透气，比表面大，是培养孢子和制备粗酶制剂的良好培养基。如用麸皮培养黑曲霉生产糖化酶，培养米曲霉生产米曲霉孢子，用蒸煮的大豆接种米曲霉进行固体培养，利用分泌的蛋白酶制作豆酱等。液体培养基中加0.2-0.5%琼脂，表观呈固态，剧烈震荡后则破散。应用 菌运动性、趋化性研究 细菌、酵母菌菌种保藏 厌氧菌的培养分离和计数半固体培养基半固体培养基脱水培养基脱水培养基 预制干燥培养基含有除水以外的一切成分的商品培养基。使用时加适量水并加以灭菌即可 生产商品化培养基的公司Merck按培养基的功能分按培养基的功能分 基础培养基 选择性培养基 鉴别培养基 其他培养基基础培养基基础培养基 尽管不同微生物的营养需求不同，但大多数微生物所需的基本营养物质是相同的。基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。牛肉膏蛋白胨培养基是最常用的基础培养基。选择培养基选择培养基 用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入特殊的营养物质或化学物质，有利于所需微生物生长，抑制或杀死其他微生物。实例 红曲霉耐高温耐酸 泡菜 加富性选择培养基 抑制性选择培养基 也称为营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。如加入血、血清、动植物组织提取液等，以培养营养要求比较苛刻的异养微生物。加富营养物：特殊的碳源和氮源、甘露醇、纤维素和浓糖。该培养基中生长的微生物并不是一个纯种，而是营养要求相同的一类微生物，用于菌种的保存或菌种的分离筛选。加富性选择培养基加富性选择培养基抑制性选择培养基抑制性选择培养基 在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。选择性抑菌剂：染料、抗生素、脱氧胆酸钠 抗生素抑制细菌、放线菌 苯酚抑细菌、霉菌 制霉菌素抑真菌 结晶紫、牛胆酸盐抑G+细菌 亚硫酸铋抑制革兰氏阳性菌和绝大多数革兰氏阴性菌鉴别培养基鉴别培养基 添加特定试剂或化学药品对特定微生物鉴别、区分的培养基。添加能够与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而可以用肉眼就能容易地辨别目的菌菌落的培养基；伊红美蓝（EMB）平板用于检查饮水和乳品中是否含肠道致病菌E.coli呈紫绿色金属光泽，沙门氏菌菌落无色透明EMB培养基的组成培养基的组成 EMB培养基的成分/g 蛋白胨：10 乳糖：5 蔗糖：5 K2HPO4：2 伊红Y：0.4 美蓝：0.065 蒸馏水：1000 最终pH：7.2培养基中常用的指示剂培养基中常用的指示剂 酸碱指示剂 酚红 溴甲酚紫 溴荫香草酚蓝 中性红 中国蓝 甲基红 酸性复红 氧化还原指示剂：美蓝和刃天青1配制：计算、称量、溶解2调节pH：用3%的HCI/NaOH调节，pH 7.0-7.23 溶化琼脂 4分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。培养基的配制编号成分含量粉状硫10g（NH4）2SO40.4gK2HPO44.0gMgSO49.25gFeSO40.5gCaCl20.5gH2O100ml 5灭菌l 任何培养基一旦配成，必须立即灭菌处理。只能灭菌一次。常规高温蒸汽灭菌 （1.05kg/2,121.3,15-30min）某些成分进行分别灭菌 过滤除菌6倒平板:待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板 平板冷凝后，要将平板倒置。7检查培养基制作是否合格：将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。编号编号成分成分含量含量粉状硫粉状硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml右表是某微生物培养基成分：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 （2）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养（3）表中营养成分共有几类 自养型微生物自养型微生物 固氮微生物固氮微生物 配制培养基倒平板土壤悬浮液作10倍递减稀释至适当浓度涂布法接种平板培养划线纯化接斜面保存关于实验：从土壤中分离纯化微生物关于实验：从土壤中分离纯化微生物灭菌稀释1.dilute sample1 ml9 ml1 10-1 10-210-3 10-4 10-5 10-62.plate out 0.1 ml 涂板划线纯化学学生生宿宿舍舍口口腔腔气气流流霉霉 菌菌霉霉 菌菌放线菌放线菌?本章小结本章小结 微生物的营养素 微生物的营养类型 微生物的营养方式 微生物培养基的设计和配制本章思考题本章思考题 比较营养物质进入细胞的几种方式的基本特点 简述配制培养基的基本原则 归纳培养基的类型