悬浮细胞培养

悬浮细胞培养(颜秋生、张雪琴)悬浮细胞培养是指已建立的愈伤组织或离体的植物细胞，转移到液 体培养基中进行无菌振荡培养。用这种培养方法所得的细胞，较为均匀 一致，它不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统，而 且细胞增殖速度快，适于进行大规模培养，在植物产品工业化生产上有 巨大的应用潜力。1 仪器设备 超净工作台、高压灭菌器、旋转摇床、台式离心机、荧光显微镜、刻度离心管(15ml)、三角瓶(300ml)、吸移管等。2 操作方法2.1 悬浮细胞的培养2.1.1 愈伤组织的诱导：经过表面清毒的植物外植体，置于含有适当激 素的固体培养基上，即可建立起组织培养物。通常使用的激素包括生长 素和细胞分裂素。在这种培养基上，外植体愈伤组织化，这个过程一般 是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。把愈伤组织由外植体 上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，这个过程称做继代。通过反 复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而 且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的 细胞悬浮培养物是非常必要的。2.1.2 分批悬浮培养一般技术：把已建立的外观松散、生长快、浅黄色 的愈伤组织转移到含有液体培养基的三角瓶中，然后置于旋转摇床上不 断振荡，由此得到的培养物叫做“悬浮细胞培养物”。在培养过程中， 除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。 培养所用的容器一般是 100-250ml 三角瓶，每瓶中装有 20-50ml 培养基。 摇床的转速是可控的，对于大多数植物组织来说，以转速 30-150 转/分 为宜，冲程范围应在 2-3cm 左右。转速过高或冲程过大会造成细胞的破 裂。当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。 为了使培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中(大约稀释 5 倍)。培 养用的液体培养基，对某一特定种而言，凡适合愈伤组织生长的培养基， 只要除去其中的琼脂，均可作为悬浮细胞培养基。在对悬浮培养细胞进 行继代时可使用吸移管，继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细 胞团沉降下去，然后再由中层吸取悬浮液。悬浮培养初期，每隔 3 天继 代换液1次。继代10-15 次后，可每隔7天继代换液1次。依这个办法 操作，就可逐步建立起理想的悬浮细胞培养物或悬浮细胞系。悬浮细胞 系建立过程，通常可分为前期(悬浮培养开始至悬浮培养2 周)、中期 (悬浮培养15-90 天)和后期(悬浮培养3-4个月以后)。不同培养时期的 悬浮细胞其形态特征具有很大的差别。前期细胞由不规则细长的细胞组 成，细胞质稀、液泡大，呈透明状；中期细胞由不规则细胞和椭圆形细 胞组成，随着时间的增加椭圆形细胞的比例逐渐增加，且细胞质亦由稀 变浓；后期细胞均由圆形或椭圆形细胞组成，细胞质浓厚，具有丰富的 颗粒状内含物，细胞团通常由10-30 个不等的细胞组成。2.2 悬浮细胞的测定2.2.1 细胞生长的计量(1) 细胞鲜重 把悬浮细胞倒在已知重量的湿尼龙丝网上，用水洗去 培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，再称重，细胞鲜重以 每亳升悬浮培养物的重量来表示。(2) 细胞干重 用已知重量的干尼龙丝网依上法收集细胞，置60C烘 箱中干燥 12-24 小时，再称重，细胞干重以每毫升悬浮培养物的重量来 表示。(3) 细胞密实体积(PCV)取10ml细胞悬浮液，放入15ml刻度离心 管中，在2000Xg下离心5分钟，在离心管上可得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积是以每毫升细胞悬浮液中细胞体积的毫升数表示之。2.2.2 细胞活力的测定(1)相差显微术法 在显微镜下，根据细胞质环流和正常细胞核的存 在与否，即可鉴别出细胞的死活。利用相差显微镜可以得到更明显的图 象，但在亮视野显微镜下常常也不难进行这样的观察。(2) 二乙酸荧光素(FDA )法 应用这种方法可以对活细胞百分数进行 快速的目测，首先用丙酮制备0.5%的FDA贮备液，置0C下保存。当要 测定细胞活力时，将贮备液加到细胞悬浮液中，加入的数量以使最终浓 度为 0.01%为准。混匀，在室温下作用 5 分钟，然后在带有适当的激发 滤片和吸收滤片的荧光显微镜进行观察。FDA本身无荧光、无极性， 可自由透过细胞质膜进入内部，进入后由于受到活细胞内脂酶的分解， 而产生有荧光的极性物质荧光素，它不能自由出入质膜。在荧光显微镜 下可观察到产生荧光的细胞，表明是有活力的细胞；相反，不产生荧光 的细胞，表明是无活力的死细胞。细胞活力以发绿色荧光的活细胞数占 总观察细胞数的百分数表示。(3) 伊文思兰染色法 这种方法可用做 FDA 的互补法。当伊文思兰 的稀薄溶液(0.025%)对细胞进行短时间的处理，只有活力已受损伤的细 胞能够摄取这种染料，而完整的活细胞不能摄取这种染料。因此，凡不 染色的细胞皆为活细胞。但是染色时间不能太长，否则活细胞也会逐渐 积累染料而染成颜色。细胞活力以未染色的活细胞数占总观察细胞数的 百分数表示。*悬浮细胞培养：原载现代植物生理学实验指南,中国科学院上海植物生理研究所等编，科学出版社， 1999 年 12 月， P.3738.