3相互作用及界面研究相关技术

相互作用相互作用/生物传感相关技术生物传感相关技术 The biomacromolecules in cellProteinDNARNAOthers 分子相互作用Nucleic AcidsDNARNABiochemistryCarbohydratesSugarsPolysaccharidesLipidsFats and OilsMembranesProteinsAmino AcidsPeptide BondsNucleotidesPentose SugarsHetero-cyclic basesinformationtranslationstructure,storage,protein modificationlinked byconsist ofenergy storageStructuralFunctionalPhosphateconsist ofcompartmentalizationenergywork分子相互作用The interaction of biomolecules is the fundamental basis of any cellular functionProteinothersDNARNAInteractionBy their friends,you shall know them!分子相互作用核酸与蛋白质的相互作用 分子相互作用举例分子识别：分子识别：主体对客体选择性结合并产生某种特定功能的过程。锁钥匙分子相互作用举例蛋白质与配体的相互作用 分子相互作用举例双链DNA之间的相互作用 signalSignaling:protein proteinprotein lipidprotein signaling moleculeImmune system:protein proteinprotein carbohydrateReplication:DNA DNADNA protein Interactions氢键 离子键 静电作用 范德华力疏水作用 配位键分子相互作用的力免疫共沉淀免疫共沉淀荧光共振转移技术荧光共振转移技术噬菌体展示技术噬菌体展示技术酵母双杂交技术酵母双杂交技术基因外抑制子基因外抑制子合成致死筛选合成致死筛选分子生物学方法分子生物学方法亲和印迹亲和印迹Pull down 试验试验遗传学方法遗传学方法分子相互作用研究方法分子相互作用研究方法生物物理学方法生物物理学方法表面等离子共振表面等离子共振化学交联化学交联微量热技术微量热技术分子相互作用的研究方法表面等离子体共振技术（表面等离子体共振技术（Surface plasmon resonance，SPR）是通）是通过过测量固测量固-液界面折射率的变化来对液界面折射率的变化来对分子的相互作用进行分析研究的一种分子的相互作用进行分析研究的一种技术手段。技术手段。SPR技术SPR简史1902年，年，Wood在光学实验中发现在光学实验中发现SPR现象现象1941年，年，Fano解释了解释了SPR现象现象1971年，年，Kretschmann结构为结构为SPR传感器奠定了基础传感器奠定了基础1982年，年，Lundstrm将将SPR用于气体的传感（第一次）用于气体的传感（第一次）1983年，年，liedberg将将SPR用于用于IgG与其抗原的反应测定与其抗原的反应测定1987年，年，Knoll等人开始等人开始SPR成像研究成像研究1990年，年，Biacore AB公司开发出首台商品化公司开发出首台商品化SPR仪器仪器 表面等离子体共振（表面等离子体共振（Surface plasmon resonance，SPR），又称表面等离子体子共振，表面等离激元共振，），又称表面等离子体子共振，表面等离激元共振，是一种物理光学现象，有关仪器和应用技术已经成为物理是一种物理光学现象，有关仪器和应用技术已经成为物理学、化学和生物学研究的重要工具。学、化学和生物学研究的重要工具。在金属中，价电子为整个在金属中，价电子为整个晶体所共有，形成所谓费米电子晶体所共有，形成所谓费米电子气。价电子可在晶体中移动，而气。价电子可在晶体中移动，而金属离子则被束缚于晶格位置上，金属离子则被束缚于晶格位置上，但总的电子密度和离子密度是相但总的电子密度和离子密度是相同的，从整体来说金属是电中性同的，从整体来说金属是电中性的。人们把这种情况形象地称为的。人们把这种情况形象地称为“金属离子浸没于电子的海洋金属离子浸没于电子的海洋中中”。这种情况和气体放电中的。这种情况和气体放电中的等离子体相似，因此可以把金属等离子体相似，因此可以把金属看作是一种电荷密度很高的低温看作是一种电荷密度很高的低温（室温）等离子体，而气体放电（室温）等离子体，而气体放电中的等离子体是一种高温等离子中的等离子体是一种高温等离子体，电荷密度比金属中的低。体，电荷密度比金属中的低。金属板中电子气的位移（上）金属离子（上）金属离子（+）位于）位于“电子海洋电子海洋”中（灰中（灰色背景），（下）电子集体向右移动色背景），（下）电子集体向右移动基本原理等离子体等离子体全反射：全反射：光由光密（即光在此介质中的折射率大的）媒质射到光疏光由光密（即光在此介质中的折射率大的）媒质射到光疏（即光在此介质中折射率小的）媒质的界面时，全部被反（即光在此介质中折射率小的）媒质的界面时，全部被反射回原媒质内的现象。射回原媒质内的现象。基本原理基本原理Total internal Reflection金金石英基体石英基体 100%强度强度100%强度强度100%强度强度6%强度强度Sample表面等离子波表面等离子波表面等离子共振波表面等离子共振波抗体抗体 抗原抗原 相互作用相互作用+Kasskdiss 抗体抗体 抗原抗原 复合物复合物 Ab:Ag基本原理 金金石英基体石英基体 100%强度强度6%intensity100%强度强度100%强度强度6%强度强度基本原理X-轴轴:角度角度Y-轴轴相对反射相对反射率率(%)基本原理 SPR共振角共振角表面附近折射率的变化表面附近折射率的变化 镀金膜能量状态的变化镀金膜能量状态的变化SPR共振角度变化共振角度变化,在此角度上镀金膜吸收光能在此角度上镀金膜吸收光能产生共振产生共振仪器检测仪器检测SPR角度变化角度变化,进而告诉我们表面发生的变化进而告诉我们表面发生的变化:=120m 0.001的折射率变化的折射率变化,或者或者 1 ng/mm2 的表面吸附的表面吸附(仪器激光照射点的面积为仪器激光照射点的面积为2.5mm2)基本原理40424446480.00.20.40.60.81.0 Relative ReflectanceIncident Angle(Degree)ni:Refractive Index in Each Medium (i:1=Prism,2=Metal,3=Sample):Incident Angle of LightIncidentLightDetectorn1n2n3Kretschmann ConfigurationResonance Angle Shift0.00.51.01.5Sensorgram Angle Shift(Degree)TimeRefractive Index Change ofSensing Layer on ChipResonance Angle ChangeMolecular InteractionResonance Condition)(sin23222123221nnnnnsp基本原理基本原理4.解离段解离段 5.再生段再生段6.重回基线重回基线 1.基线基线 2.结合段结合段 3.平衡段平衡段134562SPR仪测量池测量池镀金膜镀金膜二极管检测器二极管检测器折射镜折射镜 激光激光偏振滤镜偏振滤镜扫描镜扫描镜透镜透镜旋转手柄旋转手柄紧固螺栓紧固螺栓光学系统光学系统SPR仪混合泵混合泵 蠕动泵蠕动泵测量池测量池SPR仪SPR测量池测量池SPR仪SPR仪BK-7 玻璃玻璃,n=1.52 1 mm 厚度厚度浸没油浸没油,折射率折射率n=1.518半圆柱棱镜半圆柱棱镜44单色激光单色激光,670 nm (波长波长)Au,镀金膜镀金膜,50 nm 厚度厚度镀金片镀金片钛涂层钛涂层,1.5 nm 厚度厚度.将金粘结到玻璃片上的载体层将金粘结到玻璃片上的载体层.SPR仪溶溶 液液Activation:EDC:N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide NHS:N-hydroxysuccinimideAu巯基十一酸巯基十一酸SHOHOSHOHOSHOHOSHOHOSPR的应用抗体抗体封闭封闭:氨基乙酸氨基乙酸(也叫甘氨酸也叫甘氨酸)或乙醇胺或乙醇胺Au巯基十一酸巯基十一酸SHOHOSHOHOSHOHOSHOHOSPR的应用抗体抗体Au巯基十一酸巯基十一酸SHOHOSHOHOSHOHOSHOHO抗原抗原SPR的应用Biotin-thiolEthylene glycol-thiolBiotinStreptavidinssDNA-biotinTarget DNAOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOH OHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOHOH OHOHhybridizationOHSPR的应用Biomolecular interactions in disease and medicineSPR的应用ObesityDiabetesAutoimmuneDiseaseInfectious diseaseHIVVirusesFungi,protozoa,parasitesBacteriaCancerParkinsonsDepressionMetabolicNeuroscienceAlzheimersRheumatoid arthritisMalariaTBInfluenzaYellow feverDengueAntibiotic resistanceCardio-vascularRespiratorySPR的应用ObesityDiabetesAutoimmuneDiseaseInfectious diseaseHIVVirusesFungi,protozoa,parasitesBacteriaCancerParkinsonsDepressionMetabolicNeuroscienceAlzheimersRheumatoid arthritisMalariaTBInfluenzaYellow feverDengueAntibiotic resistanceCardio-vascularRespiratoryVirus cell recognitionAntibody antigen interactionInteractionsDrug receptor bindingSPR的应用RBP4 and diabetesRetinol binding protein(RBP4)is a transport protein for retinol(vitamin A),an important signaling moleculeSerum RBP4 levels correlate with insulin resistance and other characteristics of type 2 diabetesRBP4 is thus both a therapeutic target and an early marker for type 2 diabetes SPR的应用SPR-based biosensor for RBP4Thiopropionic acidEDC/NHS+streptavidinBiotin-labeled aptamerSerumCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCOOHCONHCOOHCONHCONHCOOHRBPADPNVSFHSARBPADPNVSFHSARBPRBPHSAtimeangleCOOHSPR的应用CancerCancer is a disease of uncontrolled cell growthIt arises when the balance between cell division and cell death is disruptedUncontrolled cell growth is caused by mutations in the DNA,in genes that regulate cell cycle and apoptosisSuch mutations can be genetic,caused by environmental factors,or arise by chanceSPR的应用Estrogen and cancer Estrogen stimulates cell proliferation in some tissues,via ERsIncreased rate of cell division leads to more mistakesMutant cells are stimulated to divide as well,increasing the chances that mutations accumulateSome tumors are estrogen sensitive:estrogen helps them to growSPR的应用AntiestrogensDrugs can block the action of estrogen and thereby reduce the proliferation of mutant cellsThese drugs bind to ERs without turning on genes via EREsOne of these drugs,tamoxifen,has been used in breast cancer treatment since the 1970sestradiol4-hydroxytamoxifenSPR的应用Estrogen action EREgeneERestrogencoactivatorsRNA polymeraseSPR的应用Estrogen action EREgeneERIncreased cell proliferation and cancerRNASPR的应用Tamoxifen action EREgeneERtamoxifencoactivatorsRNA polymeraseNo increased cell proliferation and no cancerSPR的应用Streptavidin immobilized on goldBiotinylated DNA(ERE or random)capturedEstrogen receptor (ER)binding measured Empty ER Estrogen(E2)-ER Tamoxifen(4OHT)-ERSPR的应用 生物传感器（生物传感器（Biosensor）生物传感器（biosensor）是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、微生物、核酸等生物活性物质）与适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、场效应管、等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。-Real-Time Monitoring-Non-Labeling Technique-Highly Sensitive Detection-Non-Invasive Optical TechniqueBiosensorSignal TransducerElectrochemicalOpticalThermalMechanicalSurface Plasmon Resonance(SPR)FluorescenceChemiluminescence生物传感器电化学生物传感器电化学生物传感器原电池与电解池原电池：能自发地将化学能转化为电能原电池：能自发地将化学能转化为电能电解池：需要消耗外部电源提供的电能，使电池内部发电解池：需要消耗外部电源提供的电能，使电池内部发生化学反应生化学反应基本原理电化学生物传感器基本都运用电解池！电化学生物传感器基本都运用电解池！电化学三电极系统电化学三电极系统 工作电极（工作电极（Working electrode）参比电极（参比电极（Reference electrode）对电极（对电极（Auxiliary electrode）电极：在电化学电池中赖以进行电极反应和传导电流电极：在电化学电池中赖以进行电极反应和传导电流从而构成回路的部分。从而构成回路的部分。基本原理工作电极金电极热解石墨电极玻碳电极基本原理参比电极饱和甘汞电极Ag/AgCl电极对电极铂片电极铂丝电极绝对电极电位无法绝对电极电位无法得到，因此只能以得到，因此只能以一共同参比电极的一共同参比电极的标准电极电势为参标准电极电势为参照进行测量。照进行测量。对电极一般使用惰对电极一般使用惰性贵金属材料，以性贵金属材料，以免在此表面发生化免在此表面发生化学反应，用于与工学反应，用于与工作电极形成回路。作电极形成回路。工作电极，是三电工作电极，是三电极中，最为重要的极中，最为重要的一个，需要关注的一个，需要关注的化学和生物过程均化学和生物过程均在此电极上发生。在此电极上发生。电化学工作站电化学工作站基本原理循环伏安法(Cyclic Voltammetry)基本原理基本原理 以一定的速率对工作电极施加三角波电压，使电极上交替发生还原和氧化反应，并记录电流-电势曲线。电化学信号铁氰化钾铁氰化钾/亚铁氰化钾的循环伏安图亚铁氰化钾的循环伏安图Fe(CN)63-+e=Fe(CN)64-Fe(CN)64-e=Fe(CN)63-电化学信号几个重要的参数几个重要的参数 两个峰电位 氧化峰电位（Epa）还原峰电位（Epc）两个峰电流 氧化峰电流（ipa）还原峰电流（ipc）氧化过程氧化过程还原过程还原过程电位可定性！电位可定性！电流可定量！电流可定量！电化学信号定性研究不同的酚酸类物质定性研究不同的酚酸类物质最成功的生物传感器最成功的生物传感器血糖仪血糖仪定量分析生物传感器基于酶催化的生物传感器基于酶催化的生物传感器基于血红蛋白催化的基于血红蛋白催化的H2O2生物传感器生物传感器定量分析生物传感器化学反应H2O2+2Fe2+2H+2Fe3+2H2O 血红蛋白对血红蛋白对H2O2的催化检测原理的催化检测原理电极反应(1)Fe2+-e-Fe3+产生氧化峰(2)Fe3+e-Fe2+产生还原峰化学反应导致Fe3+增多，Fe2+减少，从而使得电极反应中(2)加强，还原峰增大；(1)减弱，氧化峰减小PS.仪器测量的是电化学反应，即电极得失电子的情况！定量分析生物传感器基于核酸杂交的生物传感器基于核酸杂交的生物传感器通用策略定量分析生物传感器电活性插入剂电活性插入剂亚甲基蓝亚甲基蓝定量分析生物传感器电活性分子探针共价标记电活性分子探针共价标记定量分析生物传感器Label-Free Electrochemical Detection of DNA in Blood Serum via Target-Induced Resolution of an Electrode-Bound DNA Pseudoknot J.AM.CHEM.SOC.,2007,129,11896-11897定量分析生物传感器酶标探针酶标探针定量分析生物传感器纳米材料参与的信号放大纳米材料参与的信号放大定量分析生物传感器基于抗原基于抗原-抗体的免疫传感器抗体的免疫传感器定量分析生物传感器基于适体识别的生物传感器基于适体识别的生物传感器定量分析生物传感器假如有某物质假如有某物质A通过通过SELEX筛选出其核酸适体筛选出其核酸适体B你能自行设计构建你能自行设计构建基于适体识别的基于适体识别的电化学或电化学或SPR生物传感器吗？生物传感器吗？生物传感器的基础是分子相互作用生物传感器的基础是分子相互作用 生物传感器的换能器有多种选择，包括光生物传感器的换能器有多种选择，包括光学、电化学等学、电化学等 每种换能器又可发展出若干种类型的生物每种换能器又可发展出若干种类型的生物传感器，每种类型下面的具体设计策略则传感器，每种类型下面的具体设计策略则更是无穷限的更是无穷限的 一个好的生物传感器需要具备多个一个好的生物传感器需要具备多个“素素质质”：高灵敏度、高特异性，良好的抗干：高灵敏度、高特异性，良好的抗干扰性、稳定性、易用性，低成本，等等扰性、稳定性、易用性，低成本，等等总结