茚三酮法测氨基酸

茚三酮显色法测定氨基酸的含量一原理： 凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共 热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一 步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH3 和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成 的 还 原 型 茚 三 酮 与 另 一 个 茚 三 酮 分 子 和 NH3 缩 合 生 成 有 色 物 质 。OHoc(.(X I+ (MLI?l：I j/+ XEJ; + CO?xou;11 一-JnOHCenoHN=CHo二仪器：721型分光光度计台天平减压蒸馏器干燥 容量瓶 移液枪烧杯试管 架试管水浴锅。三药品：(1)标准氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液(2) pH5.4,2mol/L醋酸缓冲液:量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L 乙酸混合而成。用pH检查校正。(3) 茚三酮显色液：称取170mg茚三酮和30mg还原茚三酮，用20mL乙二醇 甲醚溶解(4) 60%乙醇。(5) 样品液：每毫升含0.550“g氨基酸。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5g茚三酮溶于1525mL热蒸馏 水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日 析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。还原型茚三酮按下法制备：称取 0.5g 茚三酮，用 12.5mL 沸蒸馏水溶解，得黄色溶 液。将0.5g维生素C用25mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三 酮溶液中，不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min,然后在冰箱内冷却到4C,过滤、沉淀 用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。乙二醇甲醚若放置太久,需用下法除去过氧化物:在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫 酸亚铁，振荡12h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121125C的馏分，为 无色透明的乙二醇甲醚。四、操作步骤1标准曲线的制作分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0mL于试管中，用水补足 至1mL。各加入1mL pH5.4, 2mol/L醋酸缓冲液；再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀 后,盖住试管口，在100C水浴中加热15m in,用自来水冷却。放置5min 后,加入3mL60% 乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD57onm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄 色，应测定OD440nm）。以OD57onm为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。1234560.3mmol/L 标准氨基 酸溶液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.202mol/L 醋酸缓冲液111111茚三酮显 色液111111OD570混匀，盖住试管口后在100水浴加热15min,然后用自来水冷却。放置5min后，加入3ml60%的乙醇稀释，充分摇匀。2.氨基酸样品的测定取样品液1mL,加入pH5.4,2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL,混匀后于100C 沸水浴中加热15min,自来水冷却。放置5min后，加3mL 60%乙醇稀释，摇匀后测定 OD570nm （生成的颜色在60min内稳定）。将样品测定的OD570nm与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。 石结果计算对应标准曲线賢得值1 OC-j