蛋白分泌表达枯草芽孢杆菌来表达

枯草芽抱杆菌，学名Bacillus subtilis,是一种被广泛应用于工业生产的革兰氏阳性细菌。与大肠杆菌不同，枯草芽抱杆菌没有外层膜，分泌的蛋白能直接释放到培养基中，是一种理想的原核蛋白 分泌表达菌株。那么作为一种潜能巨大的原核表达系统，它究竟强在哪些方面呢？且让AtaGe nix为 您 一 一 道 来。枯草芽抱杆菌的安全性是食品级的，收录于FDA的GRAS菌中，欧洲食品安全局认为枯草芽抱 杆菌可用于食品发酵。很多常用食品工艺中都能见到它的身影。与大肠杆菌相比，枯草芽抱杆菌的细 胞壁组成简单，只含肽聚糖和磷壁酸，在分泌的蛋白质产品中不会混杂有类似革兰氏阴性菌细胞壁成 分中的热源性脂多糖（内毒素）等物质。该表达系统用于药用蛋白的表达纯化时还可省掉去除内毒素 这一步。同为原核生物界的明星，虽然大肠杆菌和枯草芽抱杆菌都只需短时间就可表达和积累大量目标蛋 白。但大肠杆菌在后续发酵工艺中需要对收集的菌体进行破胞处理，而枯草芽抱杆菌得益于其本身所 拥有的一套高效分泌信号肽及分子伴侣系统，只要简单处理发酵上清就能得到较纯的蛋白，并且表达 的蛋白在多数情况下具有天然构象和生物活性。蛋白质组学研究表明，枯草芽抱杆菌中至少有四种蛋白质分泌途径，其中Sec分泌途径是主要 分泌途径。另外枯草芽抱杆菌拥有良好的发酵生产技术，目前大部分商业化的蛋白水解酶和淀粉酶都 是由其发酵得到的。AtaGenix拥有的5 L、20 L、150 L及其他型号的发酵罐（上图就是真相）， 可满足各种大规模发酵的需求。虽然枯草芽抱杆菌表达外源蛋白潜力无限，旦也有其短板，如自身胞外蛋白酶对表达产物的降解、 遗传操作相对困难、外源蛋白有时得不到有效的表达等等。但AtaGe nix却能成功避免以上问题使外 源目标蛋白在枯草芽抱杆菌表达系统中有效表达，这主要得益于以下三个方面的优势：丰富的表达宿主由于枯草芽抱杆菌没有明显的密码子偏爱性，表达外源蛋白时无需对DNA序列进行优化。在不 同宿主中表达时蛋白表达情况可能有差异。在AtaGenix拥有的多种枯草芽抱杆菌表达宿主中丄012 wild type宿主菌是最常用到的，可作为胞内和胞外表达的通用菌；168 Marburg遗传背景清楚，是 研究枯草芽抱杆菌的标准菌株；AS1作为胞内表达的备用菌株，常用于表达外源蛋白。而胞外蛋白酶 缺陷菌株WB800N能有效解决由于枯草芽抱杆菌丰富的蛋白酶导致的蛋白表达产物降解问题。 给力的表达载体大部分的枯草芽抱杆菌不含内源性质粒，并且一般不能识别大肠杆菌中的启动子。最初的枯草芽 抱杆菌载体源于金黄色葡萄球菌，其结构不稳定并易丢失。现在普遍使用的质粒载体是由枯草芽抱杆 菌隐性质粒与大肠杆菌质粒构成的穿梭载体，可在大肠杆菌中完成基因片段的连接克隆等遗传操作， 然后转入枯草芽抱杆菌进行外源基因的表达。AtaGenix使用的pHT系列载体拥有枯草芽抱杆菌的。 A-依赖性的强启动子，配以groE启动子和lac操纵子，能够通过IPTG诱导来启动外源基因的表达。 通过添加枯草芽抱杆菌中编码a-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域，构成了能够将目标蛋白有 效分泌至胞外的表达载体，如PHT43。 有效的转化手段枯草芽抱杆菌早期比较通用的转化方法是Spizizen转化法（接合转化），但在枯草芽抱杆菌的 生长周期中能自发形成感受态的菌株极少，并且感受态保存时间短暂。电转化法操作简单并且转化率 相对较高，AtaGenix通过优化电转条件（上图为AtaGenix实验室的电转仪实拍），将其用于枯草 芽抱杆菌的转化，可以有效缩短转化时间并使转化阳性率达到90%以上。与大肠杆菌相比，枯草芽抱杆菌表达系统还不是很完善，相信随着对其研究的不断深入，它在今 后的发展中一定会大放光彩。毕竟，相对于真核表达系统，枯草芽抱杆菌表达系统周期短、成本低、 表达量较高这些优势还是很吸引人的。当然，AtaGenix也期待更多新的表达系统可以服务科研，造 福人类。