微生物检验操作规程

微生物检验操作规程 - 微生物检验操作规程 1. 目的 建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作标准化。 2. 范围 适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。 3. 职责 3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程； 3.2 QC主管负责监视检查本规程的有效施行。 4. 操作规程 4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤 4.1.1 一般的玻璃器皿例如培养皿、试管、三角瓶等，可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤到达标准。 4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。 4.1.3 新购的玻璃器皿先用2盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。 4.2 器皿的包扎 4.2.1 试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。 4.2.2 三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶抽滤瓶口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。 4.2.3 吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。 4.2.4 平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。 4.3消毒和灭菌： 4.3.1 化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。 1用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。 2一般用12%的甲醛液浸泡软管和用具。 3一般成品漂白粉的有效成分是2532% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，对金属有腐蚀作用放置1015min后冲洗即可。 4氯灭菌剂的才能以有效氯表示，将氯水配制成50100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和外表杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。 4.3.2 物理灭菌： 4.3.2.1 干热灭菌：适用于枯燥的玻璃器皿吸管、平皿等、金属器具镊子等、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160干热空气灭菌2h。 1器具用牛皮纸或灭菌袋包装扎，放入金属容器内。 2器具在枯燥箱加热前放入，每个器具之间留有足够的空隙，使热 空气能畅通。 3关闭箱门接通电，翻开通气孔，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度到达100时关闭。 4加热至160，保持2小时。 5切断电，冷却至60 时，翻开箱门，取出灭菌器具，并翻开箱顶通气口。 注：灭菌时必须注意温度不能超过180，以免使棉花、报纸烘焦；灭菌时不得翻开箱门；枯燥箱未冷却时，不要取出里面器具，防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸 璃器具爆炸。 4.3.2.2 湿热灭菌：适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见压力蒸汽灭菌器操作规程。 1装入培养基的瓶用胶塞盖上，再用牛皮纸包扎。 2瓶中的培养液不要超过1L，否那么灭菌不彻底。 3容器的上部应留有足够的空间一般不超过装量的2/3，以便产生气泡。 4器具用牛皮纸包裹。 5器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。 6各类器具装入灭菌器时，互相间要留有空隙以使蒸汽自由流动。 4.4 无菌操作的准备工作及考前须知 4.4.1 微生物室应定期按微生物实验室管理规程清洁。 4.4.2 微生物室使用前，应先翻开紫外灯灭菌2030min。 4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针，每次使用前后应灭菌消毒。 4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液内浸纱布数块，备用。 4.4.5 进入微生物，换专用鞋，穿好干净服，离室时脱去干净服和专用鞋，干净服和专用鞋只准在微生物室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。 4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。 4.4.7 无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。 4.4.8 操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。 4.4.9 检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，翻开紫外灯灭菌2030min。 4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存 配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。 4.5.1 水：电导率在25时不超过25s/cm，除非另有规定要求。 4.5.2 称重和溶解： 保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定，已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min，使其与室温一致再使用，因为气体的溶解度可因温度上升而降低，特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡，这一点必须注意。 4.5.3 pH 的测定和调整： 用pH计测pH，必要时在灭菌前进展调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25时，pH应在标准pH0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L约1mol/L的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L约1mol/L的盐酸溶液调整培养基的pH。 4.5.4 分装：将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。 4.5.6 培养基的使用： 经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后防止过度加热。融化后应短暂置于室温中如2 min以防止玻璃瓶破碎。 融化后的培养基放入4750的恒温水浴锅中冷却保温，且应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。 4.5.7平板的制备和储存 倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm直径90 mm的平皿，通常要参加18 mL20 mL琼脂培养基。将平皿盖好皿盖后放到程度平面使琼脂冷却凝固。假如平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40，那么需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和或53冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和或有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进展标记。 将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了防止冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基外表进展枯燥处理。 对于采用外表接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂外表进展枯燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中温度设为2550；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基外表的水滴消失为止。注意不要过度枯燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。 4.6 检验方法 做样前，将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、微生物室紫外线灭菌30min，然后关紫外线灭菌灯，开启净风循环30min后开场做样。 详见附录各检测方法 附录1 菌落总数测定 附录2 霉菌和酵母计数 附录3 大肠菌群计数 附录4 大肠埃希氏菌计数 附录5 沙门氏菌检验 附录6 金黄色葡萄球菌检验 附录1 菌落总数的测定方法 1. 样品的稀释 1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水中均质1 min2 min制成1:10 的样品匀液。 1.2液体样品：以无菌吸管汲取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 1.3 用1mL微量移液器汲取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中注意吸头尖端不要触及稀释液面，换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 1.4 按4.6.1.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1 mL无菌吸头。 1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液液体样品可包括原液，在进展10倍递增稀释时，汲取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别汲取1 mL空白稀释液参加两个无菌平皿内作空白对照。 1.6 及时将15mL20mL冷却至46的平板计数琼脂培养基可放置461恒温水浴箱中保温倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 2. 培养 2.1 待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。 2.2假如样品中可能含有在琼脂培养基外表弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂外表覆盖一薄层琼脂培养基约4 mL，凝固后翻转平板，按4.6.1.2.1条件进展培养。 2.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位CFU表示。 2.3.1选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录详细菌落数，大于300CFU可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 2.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，那么不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；假设片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。 2.3.3 当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，那么将每条单链作为一个菌落计数。 3 结果与报告 3.1菌落总数的计算方法 3.1.1 假设只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每gmL样品中菌落总数结果。 3.1.2 假设有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按下式计算： 第 10 页 共 10 页