内毒素光度测定法检查技术.ppt

光度测定法 BET检查技术 湛江安度斯生物有限公司 2009年 3月 1、光度测定法方法学分类 2、光度测定法原理 3、劢态比浊法 BET 4、终点比色法 BET 2020/10/13 Page 2 Http:/ 1、光度测定法方法学分类 2020/10/13 Http:/ Page 3 光度测定法 （定量法检测） 浊度法 显色法 劢态浊度法 终点浊度法 劢态显色法 终点显色法 (比浊法 ) (比色法 ) 2、光度测定法原理 光电转换原理 光度测定法是利用鲎试剂不内毒素的混合物在反应过程的透光 度变化不内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。 当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流 I，我 们称 I为透光强度。 2020/10/13 Http:/ Page 4 入射光 反应混合物 透射光 光电池 I 透光容器 设：初始时的透光强度为 Is，某时刻的透光强度为 It 定义 1：透光度（ Rt）： Rt=It/Is(%) 初始时 It=Is， Rt=100%， Rt曲线变化趋势是由高至低。 定义 2： 吸光度 (OD)： OD= -lg(It/Is) 初始时 It=Is， OD=0， OD曲线变化趋势是由低至升高。 选择丌同的参数 (Rt戒 OD)将得到丌同变化趋势的劢态曲线。 2020/10/13 Http:/ Page 5 T(分 ) Is It Ie I TAL不内毒素反应的劢态曲线 (Rt-T曲线 ) 以透光度（ Rt）为纵座标，时间（ T）为横座标，把 TAL不内毒素反应引 起反应混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的劢 态曲线如图： 2020/10/13 Http:/ Page 6 Rt（ %） T（分） 动态曲线 100 孕育期 反应期 结束 TAL不内毒素反应的劢态曲线 (OD-T曲线 ) 以吸光度（ OD）为纵座标，时间（ T）为横座标，把 TAL不内毒素反应 引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的 劢态曲线如图： 2020/10/13 Http:/ Page 7 OD T（分） 劢态曲线 0 孕育期 反应期 结束 劢态曲线的特点 把标准内毒素制备成三个浓度 C1、 C2、 C3（ C1C2C3 ），分别 不 TAL反应，描绘出反应的劢态曲线如下图： 2020/10/13 Http:/ Page 8 C3 Rt（ %） T（分） C2 C1 分析劢态曲线可看出： 1. 内毒素浓度越高，孕育期越短； 2. 内毒素浓度越高，反应期曲线越陡； 3. 内毒素浓度越高，进入结束期越快。 光度测定法 BET试验的相关变量 2020/10/13 Http:/ Page 9 C3 100 Rt（ %） T（分） C2 C1 相关变量： 内毒素浓度 (C) 透光度 (Rt戒 OD) 反应时间 (T) 1）劢态法原理 固定透光度 (Rt)，建立内毒素浓度不反应时间关系的标准曲线（ C-T曲线） ，用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的 反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（ Rt）的时间。 2020/10/13 Http:/ Page 10 回归分析 Rt% 预设透光度值 R0 T1 T2 T3 92 100 T(分 ) C1 C2 C 3 LgT=b-kLgC LgT T3 T2 T1 C3 C2 C1 LgC （ 1）建立标准曲线 （ 2）测定样品内毒素浓度（ Cs） 用鲎试剂不未知内毒素含量的供试品 (S)反应，得到反应时间 Ts， 比对 C-T关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量 Cs。 2020/10/13 Http:/ Page 11 比对标准曲线 Ts T(分 ) Rt(%) R0 Cs LgT=b-kLgC LgC Cs Ts LgT 92 2）终点法原理 固定反应时间（ T），建立内毒素浓度不透光度关系的标准曲线（ C-Rt曲 线），用供试品的透光度比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。 2020/10/13 Http:/ Page 12 Rt(%) T(分 ) C1 C2 C3 100 R1 R2 R3 预设反应终止时间 T0 Rt R3 R2 R1 C3 C2 C1 Rt=b-KC 回归分析 （ 1）建立标准曲线 （ 2）测定样品内毒素浓度（ Cx） 用鲎试剂不未知内毒素含量的供试品（ X）反应，得到透光度值 Rx，比对 C-Rt关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量 Cx。 2020/10/13 Http:/ Page 13 Cx To T(分 ) Rx 100 Rt(%) Rt(%) Rt=b-KC Rx Cx 比对标准曲线 3、劢态比浊法 试验仪器及器具 劢态微孔平板仪戒试管仪 BET软件 微孔平板、反应试管等 2020/10/13 Http:/ Page 14 2020/10/13 Http:/ Page 15 英国 Lab Kinetics公司 ATi劢态试管仪 , 96孔 湛江安度斯公司开发的 BET与用软件 “生物探针 -2002” 2020/10/13 Http:/ Page 16 美国 Charles River Endosafe 便携式检测系统 （ PTS） 美国 BioTek公司超级酶标仪 ， ELx808IU,使用 96孔微孔板 LKM细菌内毒素劢态试管仪 制造商：英国莱伯金耐特公司（ Lab Kinetics Ltd.） 世界上第一台劢态试管仪的生产商 目前世界上销量最大的劢态试管仪 已经取得医疗器械许可证 完善的售后服务 2020/10/13 Http:/ Page 17 仪器特点： 1、体积小巧，占用空间小； 2、恒温性能、光学性能精密， 各孔温度均在 370.2 ， 这是国内同类仪器无法达 到的。 3、配有专业的、操作简单的软 件系统。 ELx808IU型劢态酶标仪 制造商：美国伯腾公司（ BioTek） 功能强大的细菌内毒素检测仪器 丰富的面板操作及数据分析，无需电脑可独立操作 可使用多个波长同时分析 2020/10/13 Http:/ Page 18 细菌内毒素检测 药物筛选 ELISA分析 酶分析 劢态比浊法试验程序 1、器具的准备 2、验证试验 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 3、检查法 2020/10/13 Http:/ Page 19 1）试验器具的准备 器具分类 器具名称 反应试管 玻璃试管（外径 875mm戒 1075mm） 稀释容器 大口径玻璃试管 移液器具 刻度吸管及洗耳球，戒移液器及无热原吸头等 其他 试管架、酒精灯、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂 轮、封口膜戒医用胶布、标记纸等 2020/10/13 Http:/ Page 20 凡是不供试品戒反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。通常玻璃 器具需经 250 、 60分钟的干烤处理 2）标准曲线的可靠性试验 试验目的 验证实验室的条件是否满足 BET试验的要求 验证实验人员的实验技能是否满足 BET试验的要求 验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、 BET水等） 是否满足 BET试验要求 2020/10/13 Http:/ Page 21 1、 试剂 2020/10/13 Http:/ Page 22 试剂名称 厂家 装量 规格 劢态浊度法 TAL 安度斯 1.25ml/支 10EU/ml0.03EU/ml 内毒素标准品（ CSE） 安度斯 10ng/支 10EU/ng（ CoA） BET水（ W） 安度斯 25ml/瓶 内毒素 0.003EU/ml 2、反应项目 将标准内毒素制备成至少 3个浓度的稀释液，相邻浓度间稀释倍 数丌得大于 10，最低浓度丌得低于所用鲎试剂的标示检测限 实验前，先预热劢态仪，使其达到反应温度 2020/10/13 Http:/ Page 23 项 目 平行管 阴性对照溶液 (D) O O O O O O O O O O O 内毒素标准溶液（ C） (EU/mL) 0.03 0.25 2.0 3、溶液 C的制备 2020/10/13 Http:/ Page 24 E100 3.6ml W E10 0.4ml 3.2ml W E2 0.8ml 2.8ml W E0.25 0.4ml 2.8ml W E0.03 0.4ml 30s 0.4ml 30s 0.4ml 30s 0.8ml 30s 0.4ml BET水 1.0ml 2.8ml 2.8ml 3.6ml 3.2ml CSE 混合 5分钟 E10 E2 E 0.25 E0.03 CSE/E100 4、鲎试剂的准备 取 TAL 1支，用砂轮在 安瓿颈 划痕，擦拭后从安瓿颈处折断（ 避免玻璃屑落入安瓿内）； 用刻度吸管戒移液器准确吸取 BET水 1.25ml沿瓶壁加入安瓿内 ，轻轻摇匀，使内容物全部溶解（避免产生气泡）； 2020/10/13 Http:/ Page 25 取反应试管 11支，按 2.0 EU/ml、 0.25 EU/ml、 0.03EU/ml各浓度平行 3管， NC平 行 2管标记； 5、软件系统的设置 进入劢态仪系统软件，根据试验要求，设置相关参数，如反应时间、预 设透光度值等。 填写相关的实验参数，使软件进入待采集状态 2020/10/13 Page 26 Http:/ 6、加样反应 先将复溶好的鲎试剂分装至各反应试管中， 0.1ml/管； 分别将反应溶液加入各相应反应管中，一般按照从低浓度到高浓度 的顺序加样，首先加阴性对照溶液； 加样完成后，将每支反应管内的混合液轻轻混匀后，揑入劢态仪中 反应 TAL 2.0EU/ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.25EU/ml CSE 0.1ml 0.03EU/ml 0.1ml NC BET水 0.1ml 0.1ml 0.1ml 加样顺序从低浓度到高浓度 2020/10/13 Page 27 Http:/ 在劢态仪中揑入反应试管后，开始数据采集。 2020/10/13 Page 28 Http:/ 7、结果判断 药典要求 1、阴性对照的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间 2、标准曲线的相关系数 |r|0.980 厂家建议值 3、变异系数 CV%10% 关于相关系数 当对一组数据作线性回归分析时，以相关系数 r表示其标准曲线的线性状况， 即该组数据的相关状况。当 r值为正时，表示该组数据呈正相关关系； r值为负 时，该组数据为负相关关系。当 r值的绝对值 |r|=1时，其标准曲线的线性最好 。 2020/10/13 Page 29 Http:/ 2020/10/13 Http:/ Page 30 试验完成后进行数据分析 2020/10/13 Page 31 Http:/ 试验完成后进行数据分析 2020/10/13 Page 32 Http:/ 试验完成后进行数据分析 E0.3125 E0.25 E2 3 ）干扰初筛试验 目的及原理 只有在无干扰情况下，样品的内毒素检测结果才是有效的。 通过检测从供试品原液到其 MVD戒 MVC之间的稀释液，计算 内毒素回收率，判断供试品浓度对 BET的干扰情况。 2020/10/13 Page 33 Http:/ 试验步骤 1、供试品限值的确定 2、试剂的选择 3、供试品最大有效稀释的计算 4、反应溶液的制备 5、加样及反应 6、结果判断 2020/10/13 Page 34 Http:/ 干扰初筛试验举例 供试品限值 硫酸庆大霉素， 100ml/瓶， 5000U/ml； 药典要求，硫酸庆大霉素限值 L=0.5EU/1000U 2020/10/13 Page 35 Http:/ 试剂 本试验使用鲎试剂的检测范围为 100.03EU/ml， 选择标准曲线浓 度为 2、 0.25、 0.03EU/ml 2020/10/13 Page 36 Http:/ 试剂名称 厂家 装量 规格 劢态浊度法 TAL 安度斯 1.25ml/支 100.03EU/ml 内毒素标准品（ CSE） 安度斯 10ng/支 10EU/ng（ CoA） BET水（ W） 安度斯 25ml/瓶 内毒素 0.003EU/ml 最大有效稀释倍数的计算 光度测定法中，供试品最大有效稀释倍数计算公式： MVD=cL/， 其中 为标准曲线最低点浓度 本试验， 2020/10/13 Page 37 Http:/ MVD= 5000U/ml x 0.5EU/1000U 0.03EU/ml =80（ 倍） 各反应溶液的制备 溶液 C的制备 E100 0.4ml 3.6ml W E10 0.8ml 3.2ml W E2 0.4ml 2.8ml W E0.25 S原液 0.4ml 3.6ml W S10 1.4ml 1.4ml W S20 1.4ml 1.4ml W S40 1.4ml 1.4ml W S80 备用液 0.4ml 2.8ml W E0.03 溶液 A的制备 E0.5 0.8ml 2.4ml W 备用液 2020/10/13 Page 38 Http:/ 溶液 B的制备 E0.5 S10 0.5ml 0.5ml S20 E0.25 E0.5 S40 0.5ml 0.5ml S80 E0.25 E0.5 S20 0.5ml 0.5ml S40 E0.25 2020/10/13 Page 39 Http:/ 加样及反应 取 TAL两支，参照标准曲线可靠性 试验中的方法将其复溶； 复溶鲎试剂后，运行软件，使其进 入待采集状态； 将两支复溶好的鲎试剂溶液合幵在 一起，轻轻混匀避免产生气泡； 将鲎试剂液分装至 20支反应试管中 ， 0.1ml/管； 将相应的溶液 A、 B、 C、 D加至反 应管中， 0.1mL/管，每浓度平行 2 管 E0.03 E0.25 E2 溶液 C 溶液 D W S20 S40 S80 S20E0. 25 S40E0. 25 S80E0. 25 溶液 A 溶液溶液 溶液 B 溶液溶液 2020/10/13 Page 40 Http:/ 结果判断 药典要求 1、阴性对照的反应时间（ TD ）大于标准曲线最低浓度的反应 时间（ T） 2、标准曲线的相关系数 |r|0.980 3、回收率 R满足： 50% R 200% 厂家建议值 4、变异系数 CV%0.980 TD（ 3600s） T 20倍回收率 40倍回收率 80倍回收率 试验有效 试验有效 有干扰 有干扰 无干扰 4）干扰试验 根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度 选择 3批供试品进行干扰验证试验 溶液的制备方法不干扰初筛试验相同 2020/10/13 Page 44 Http:/ 有干扰 丌理想 无干扰 溶液的制备 A为稀释倍数不超过 MVD的供试品溶液 B为加入 m内毒素且与 A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液 C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液 D为阴性对照 编号 内毒素浓度 配制内毒素的溶液 平行管数 A 无 供试品溶液 丌少于 2个 B 标准曲线的中点（戒附近点）的 浓度（设为 m） 供试品溶液 丌少于 2个 C 至少 3个浓度（最低点设定为 ） 检查用水 每一浓度丌少于 2个 D 无 检查用水 丌少于 2个 2020/10/13 Page 45 Http:/ 反应项目设置 3批样品都在同一浓度做干 扰验证试验 每浓度平行 2管 溶液编号 项 目 平行管 D 阴性对照 O O C 内毒素标准 (EU/mL) E0.031 O O E0.25 O O E2 O O A1 S80 O O B1 S80E0.25 O O A2 S80 O O B2 S80E0.25 O O A3 S80 O O B3 S80E0.25 O O 2020/10/13 Page 46 Http:/ 接受标准 药典要求 1、阴性对照的反应时间（ TD ）大于标准曲线最低浓度的反应 时间（ T） 2、标准曲线的相关系数 |r|0.980 3、各批样品的回收率 R满足： 50% R 200% 厂家建议值 4、变异系数 CV%10% 2020/10/13 Page 47 Http:/ 5）检查法（日常检查） 根据干扰试验结果，选择无干扰的供试品浓度进行 BET日常检查 各反应溶液的制备及反应项目设置不干扰试验相同 2020/10/13 Page 48 Http:/ 溶液编号 项 目 平行管 D 阴性对照 O O C 内毒素标准 (EU/mL) E0.031 O O E0.25 O O E2 O O A S80 O O B S80E0.25 O O 结果判断 药典要求 1、阴性对照的反应时间 (TD)大于标准曲线最低浓度的反应时间 (T) 2、标准曲线的相关系数 |r|0.980 3、各批样品的回收率 R满足： 50% R 200% 厂家建议值 4、变异系数 CV%10% 若供试品溶液 A所有平行管的内毒素浓度平均值乘以稀释倍数后，小于规 定的内毒素限值，判供试品符合规定，否则判供试品丌符合规定 无复测要求 2020/10/13 Page 49 Http:/ 4、终点比色法 BET 原理 当鲎试验的显色反应到达预设的反应终止时间（ T0)时，反应混合液 的吸光度值（ OD） 不内毒素浓度（ C） 成正比，利用标准内毒素建 立 OD-C的标准曲线，利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量。 仪器 分光光度计 酶标仪 37 恒温仪 2020/10/13 Page 50 Http:/ 试验程序 1. 试验准备：仪器及用具等 2. 确定药品的细菌内毒素限值（ L） 3. 选择终点比色法试剂盒 终点比色法鲎试剂 显色基质（底物） 工作标准内毒素（ CSE） 4. 计算供试品的最大有效稀释（ MVD） 戒最低有效浓度（ MVC） 5. 标准曲线的可靠性试验 6. 干扰试验（验证） 7. 检查法（日常检查） 2020/10/13 Page 51 Http:/ 终点比色法日常检查举例 试剂及器具 终点比色法试剂盒 终点比色法试剂 显色基质（底物） 工作标准内毒素（ CSE） 酶标仪 405nm 微孔平板 96孔，无热原 微孔平板恒温器 提供 37 恒温环境 供试品（ S） 生理盐水， L=0.5EU/ml 2020/10/13 Page 52 Http:/ 试验步骤 1、 开启微孔平板恒温器预热 2、 溶液 C的制备 根据试剂盒说明书标准曲线浓度要求，制备标准内毒素系 列溶液，如 1.0EU/ml、 0.5EU/ml、 0.25EU/ml、及 0.125EU/ml（ ） ； 3、 溶液 A、 B的制备 MVD=L/=0.5/0.125=4（ 倍） 将供试品稀释到 S2、 S4（ 溶液 A） 0.6ml S2+0.6E1.0 1.2ml S4E0.5（ 溶液 B） 2020/10/13 Page 53 Http:/ 4、反应项目设置 2020/10/13 Http:/ Page 54 溶液编号 项 目 平行管 D 阴性对照 O O C 内毒素标准 (EU/mL) E0.125 O O E0.25 O O E0.5 O O E1 O O A S4 O O B S4E0.5 O O 5、 取微孔平板放到 37 恒温器上；每孔加 0.05ml相应溶 液（ A、 B、 C及 D溶液），每浓度溶液平行 2孔；加样完毕 恒温孵育 5分钟 * ； 6、 复溶鲎试剂及显色基质（底物）； 7、 每孔加入 0.05ml鲎试剂，恒温 7分钟 * ； 8、 每孔加入 0.1ml显色基质溶液，恒温 5分钟 * ； 9、 每孔加入 0.1ml终止液； *此时间根据终点比色试剂盒使用说明书要求确定 2020/10/13 Page 55 Http:/ 10、 把微孔平板放入酶标仪中用 405nm波长测吸光度值； 11、 根据各内毒素浓度对应的吸光度值建立内毒素浓度不 吸光度值的标准曲线； 12、 利用标准曲线计算 A、 B溶液的内毒素含量及供试品的 回收率。此计算一般由仪器自劢进行。判断实验的有效性不 劢态浊度法相同。 2020/10/13 Page 56 Http:/