肝炎病毒教学

病原生物学教研室病原生物学教研室 肝炎病毒（肝炎病毒（hepatitis viruseshepatitis viruses，HVHV）是指以侵害肝）是指以侵害肝脏为主引起病毒性肝炎的一组病原体。脏为主引起病毒性肝炎的一组病原体。目前公认的肝炎病毒至少有目前公认的肝炎病毒至少有5 5种，即种，即甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒（HAVHAV）、乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）、丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV）、丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（HDVHDV）和和戊型肝炎病毒（戊型肝炎病毒（HEVHEV）。近年还发现一些与人类肝炎相关的病毒，如近年还发现一些与人类肝炎相关的病毒，如GBGB病毒病毒-C/C/庚型肝炎病毒（庚型肝炎病毒（GBV-C/HGVGBV-C/HGV）和输血传播性病毒（）和输血传播性病毒（TTVTTV）病毒，但由于致病性不清，均未被最后确定和命名。病毒，但由于致病性不清，均未被最后确定和命名。此外，还有一些病毒如黄热病毒、此外，还有一些病毒如黄热病毒、CMV、EBV、风疹病毒等虽也可引起肝炎，但不列入肝炎病毒范围之风疹病毒等虽也可引起肝炎，但不列入肝炎病毒范围之内。内。各型病毒性肝炎的比较各型病毒性肝炎的比较肝炎类型肝炎类型甲型肝炎甲型肝炎乙型肝炎乙型肝炎丙型肝炎丙型肝炎丁型肝炎丁型肝炎戊型肝炎戊型肝炎病毒病毒HAVHAVHBVHBVHCVHCVHDVHDVHEVHEV生 物生 物性状性状科科小小RNARNA病毒病毒嗜肝嗜肝DNADNA病毒病毒黄病毒黄病毒未分类未分类嵌杯病毒嵌杯病毒大小大小(nm)(nm)274242606035353030形状形状2020面体面体球状球状球状球状球状球状2020面体面体核酸类型核酸类型RNARNADNADNARNARNARNARNARNARNA包膜包膜-+(HBsAg)+(HBsAg)+(HBsAg)+(HBsAg)-基因组基因组ssRNAssRNAdsDNAdsDNAssRNAssRNAssRNAssRNAssRNAssRNA传 播传 播途径途径粪粪-口口输血、注射输血、注射性行为、垂直性行为、垂直输血、注射输血、注射性行为性行为垂直垂直输血、注射输血、注射性行为、垂直性行为、垂直粪粪-口口临 床临 床表现表现潜伏期潜伏期2 26 6周周1 16 6周周2 21010周周1 16 6周周2 28 8周周急性急性+慢性慢性-+-重症重症少少少少少少经常经常妊娠期间妊娠期间携带者携带者-+-诱发肝癌诱发肝癌-+-预防预防免 疫 球 蛋免 疫 球 蛋白白丙球蛋白丙球蛋白HBIGHBIG丙球蛋白丙球蛋白-疫苗疫苗灭 活 或 减灭 活 或 减毒疫苗毒疫苗基因重组疫基因重组疫苗苗(HBsAg)(HBsAg)无无HBsAgHBsAg无无第第1 1节节 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒 甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）首先是首先是Feinstone于于1973年应用免疫电镜技术在急性期肝炎患年应用免疫电镜技术在急性期肝炎患者粪便中发现的。者粪便中发现的。1982年国际病毒命名委员会将其分年国际病毒命名委员会将其分类为小类为小RNA病毒科肠道病毒属病毒科肠道病毒属72型。近年又被单列为型。近年又被单列为肠道病毒科的嗜肝肠道病毒科的嗜肝RNA病毒属（病毒属（heparnavirus）。）。HAV引起的引起的甲型肝炎甲型肝炎是急性肝炎，主要经过粪是急性肝炎，主要经过粪口途径传播，可造成暴发或散发流行，潜伏期短，发口途径传播，可造成暴发或散发流行，潜伏期短，发病较急，一般不转为慢性，亦无慢性携带者，预后良病较急，一般不转为慢性，亦无慢性携带者，预后良好。好。形态与结构形态与结构 生物学性状生物学性状球形颗粒，无包膜球形颗粒，无包膜:基因组基因组:线状线状+ssRNA，稳定，稳定 性高。性高。衣壳衣壳:20面体立体对称，由面体立体对称，由 VP1VP4等等4种多肽种多肽组组 成，其中成，其中VP1是主要是主要的的 衣壳蛋白，其抗原决衣壳蛋白，其抗原决 定簇的定簇的NT抗体，能中抗体，能中 和所有的和所有的HAV株。株。至今，世界各地至今，世界各地HAV只发只发现一个血清型。现一个血清型。易感动物和细胞培养易感动物和细胞培养 黑猩猩、两种南美洲猴黑猩猩、两种南美洲猴(白髭猴和红腹狨白髭猴和红腹狨)以及国产猕猴属以及国产猕猴属中红面猴中红面猴(Macaca speciosa)对对HAV易感，接种病毒后均可易感，接种病毒后均可出现临床、生化和组织学上急性肝炎的改变，粪便内可检出病出现临床、生化和组织学上急性肝炎的改变，粪便内可检出病毒。毒。HAV可用非洲绿猴肾细胞、人胚肾细胞、传代猴肾细胞可用非洲绿猴肾细胞、人胚肾细胞、传代猴肾细胞(Vero、BSC-1、FRhK-4、FRhK-6)、人胚肺、人胚肺2倍体成纤维倍体成纤维细胞和人肝癌细胞株细胞和人肝癌细胞株(PLCPRF5)等。但不引起等。但不引起CPE。因。因此需用免疫荧光法或放射免疫法检出培养的此需用免疫荧光法或放射免疫法检出培养的HAV。生物学性状生物学性状抵抗力抵抗力 HAV对乙醚、酸、热对乙醚、酸、热(601h)稳定，在稳定，在20贮存数年仍保持感染性。贮存数年仍保持感染性。HAV经高压经高压(12120min)、煮沸、煮沸(5min)、干热干热(1801h)、UV(1.1瓦瓦1min)、甲醛、甲醛(1 4 000、373d)以及氯以及氯(10ppm15ppm、30min)等处理均可使之灭活。等处理均可使之灭活。鉴于鉴于HAV有相当大的抵抗力，因此对肝炎患者及有相当大的抵抗力，因此对肝炎患者及其排泄物处理应特别小心。其排泄物处理应特别小心。生物学性状生物学性状传染源与传播途径传染源与传播途径传染源传染源：多为患者和隐性感染者。患者潜伏期后期及：多为患者和隐性感染者。患者潜伏期后期及 急性期的血液和粪便均有传染性。急性期的血液和粪便均有传染性。传播途径传播途径：主要通过粪：主要通过粪-口途径传播。未有患急性甲口途径传播。未有患急性甲 型肝炎的孕妇传染给胎儿的病例。型肝炎的孕妇传染给胎儿的病例。致病性与免疫性致病性与免疫性致病机制致病机制HAV主要侵犯儿童和青年，且多为隐性感染主要侵犯儿童和青年，且多为隐性感染:HAV 口口 小肠淋巴结内增殖小肠淋巴结内增殖 血（病毒血症）血（病毒血症）肝细胞内增殖肝细胞内增殖 致病（出现临床症状）。致病（出现临床症状）。机体的免疫应答也参与了肝脏的损伤，即抗机体的免疫应答也参与了肝脏的损伤，即抗HAV在肝脏与在肝脏与HAV结合形成免疫复合物，或结合形成免疫复合物，或Tc(CTL)对感对感染病毒肝细胞的攻击所致。染病毒肝细胞的攻击所致。致病性与免疫性致病性与免疫性潜伏期潜伏期 排毒高峰排毒高峰急性期急性期 排毒量排毒量 Ab免疫性免疫性 感染后可产生持久免疫力。感染后可产生持久免疫力。早期：早期：IgM；同时，从粪便中检出；同时，从粪便中检出sIgA抗体。抗体。恢复期：恢复期：IgG，并可持续多年；，并可持续多年；特异细胞免疫应答。特异细胞免疫应答。致病性与免疫性致病性与免疫性实验室诊断不依靠分离病毒，而采用下述方法：实验室诊断不依靠分离病毒，而采用下述方法：(一一)病毒检测病毒检测：潜伏期末期和急性期早期，取粪：潜伏期末期和急性期早期，取粪便用免疫电镜检测便用免疫电镜检测HAV颗粒；用放射免疫颗粒；用放射免疫(RIA)或酶或酶免疫免疫(EIA)法检测法检测HAV 的抗原。的抗原。(二二)血清学检查血清学检查：检测抗：检测抗HAV常用常用RIA和和EIA法。法。检测抗检测抗HAV IgM有助于早期诊断；测抗有助于早期诊断；测抗HAV IgG有助有助于流行病学调查；测粪便中抗于流行病学调查；测粪便中抗HAV IgA也有助于诊断。也有助于诊断。(三三)病毒核酸检测病毒核酸检测：应用：应用 cDNA-RNA分子杂交分子杂交技术及技术及PCR技术检测技术检测HAV的的RNA，方法特异、敏感。，方法特异、敏感。用斑点杂交法可检出用斑点杂交法可检出109mg核酸。核酸。微生物学检查法微生物学检查法HAV感染后以隐性感染和无黄疽型病例占多数，因感染后以隐性感染和无黄疽型病例占多数，因此传染源较难控制。此传染源较难控制。预防预防：一般性预防：搞好卫生。：一般性预防：搞好卫生。特异性预防：我国试用减毒甲型肝炎活疫苗特异性预防：我国试用减毒甲型肝炎活疫苗(H2 株和株和L1株株)；国外已生产灭活疫苗，；国外已生产灭活疫苗，HAV基因工程疫苗正在研制中。注基因工程疫苗正在研制中。注 射丙种球蛋白可应急预防。射丙种球蛋白可应急预防。治疗治疗：甲型肝炎为自限性疾病，经治疗可痊愈，不转慢：甲型肝炎为自限性疾病，经治疗可痊愈，不转慢 性亦不留后遗症。性亦不留后遗症。用药宜简。用药宜简。防治原则防治原则第第2 2节节 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）属嗜肝属嗜肝DNA病毒科（病毒科（hepadnaviridae）。）。HBV的发现源于表面抗原的研究。的发现源于表面抗原的研究。1963年年Blumberg首先在澳首先在澳大利亚土著人血清中发现一种新抗原，称为澳大利亚抗原大利亚土著人血清中发现一种新抗原，称为澳大利亚抗原（Australia antigen）；直至）；直至1968年确定这种抗原与血清型肝炎密年确定这种抗原与血清型肝炎密切相关，称为肝炎相关抗原（切相关，称为肝炎相关抗原（hepatitis associated antigen，HAA）；）；1970年年D.S.Dane在肝炎患者血清中发现具有传染性的颗粒，即在肝炎患者血清中发现具有传染性的颗粒，即Dane颗粒（颗粒（Danes particle）。从而）。从而HBV被确认。被确认。HBVHBV是是乙型肝炎乙型肝炎病原体，主要经输血、注射、性行为病原体，主要经输血、注射、性行为和母婴传播。起病徐缓，部分患者可转为慢性，少数还可和母婴传播。起病徐缓，部分患者可转为慢性，少数还可导致肝硬化和肝癌。导致肝硬化和肝癌。形态与结构形态与结构 完整的完整的HBV颗粒亦称颗粒亦称Dane颗粒，直径为颗粒，直径为42nm，具有双层核壳结构：具有双层核壳结构：核心颗粒核心颗粒：直径为：直径为28nm。颗粒内部：颗粒内部：DNA和和DNA多聚酶多聚酶。颗粒表面（内衣壳）：含有颗粒表面（内衣壳）：含有HBcAg 和和HBeAg。外壳（包膜）外壳（包膜）：厚：厚7nm。脂质双层：含有脂质双层：含有HBsAg、PHSAr 和和PreSAg 蛋白质蛋白质生物学性状小球形颗粒，小球形颗粒，直径直径22nm；管形颗粒，直管形颗粒，直径径22nm，长度在，长度在50700nm之间；之间；大球形颗粒，大球形颗粒，即即Dane颗粒，直径颗粒，直径42nm。生物学性状形态与结构形态与结构HBVHBV基因结构及复制基因结构及复制HBV基因结构基因结构 HBV DNA是由长链是由长链L(负链负链)和短链和短链S(正链正链)组成的不完全双链环状组成的不完全双链环状DNA(cccDNA)，短链的长，短链的长度相当于长链的度相当于长链的50%85%。HBV DNA长链载有病毒蛋白质的全部密码，长链载有病毒蛋白质的全部密码，有有4个开放读码框架个开放读码框架(ORF)，分别称为，分别称为S、C、P和和X区区。生物学性状HBV基因结构基因结构S区基因区基因：包括：包括S基因、基因、PreS1与与PreS2基因，分别基因，分别编编 码码HBsAg、PreS1和和PreS2 Ag。C区基因区基因：编码：编码HBcAg，还有一个，还有一个PreC区可能在病毒区可能在病毒核核 心和外壳的附着及结合中起作用。心和外壳的附着及结合中起作用。P区基因区基因：最长，编码：最长，编码HBV DNA多聚酶、逆转录酶以多聚酶、逆转录酶以及及 RNaseH。X区基因区基因：编码：编码X 蛋白，可反式激活一些细胞的癌基因蛋白，可反式激活一些细胞的癌基因 及病毒的基因等，可能与肝癌的发生有关。及病毒的基因等，可能与肝癌的发生有关。生物学性状HBV的复制的复制生物学性状抗原组成抗原组成 生物学性状外壳：外壳：HBsAg：是机体受是机体受HBV感染的主要标志之一。感染的主要标志之一。具有抗原性，能刺激机体产生保护性抗体，即抗具有抗原性，能刺激机体产生保护性抗体，即抗HBs。根据根据HBsAg抗原性差异，抗原性差异，HBV可分为可分为adr、adw、ayr、ayw 等等4种血清型。血清型分布有明显的地区差异，并与种血清型。血清型分布有明显的地区差异，并与 种族有关。如欧美主要是种族有关。如欧美主要是adr型，为型，为A基因型；我国以基因型；我国以 adr、ayw为多见。为多见。PreS1和和PreS2：存在吸附肝细胞受体的表位；存在吸附肝细胞受体的表位；其抗原性比其抗原性比HBsAg 更强，抗更强，抗PreS1和抗和抗PreS2通过阻通过阻 断断HBV与肝细胞的结合而起抗病毒作用。与肝细胞的结合而起抗病毒作用。生物学性状衣壳衣壳HBcAg：HBcAg主要定位于感染细胞核内，不易从患者血清中检出。主要定位于感染细胞核内，不易从患者血清中检出。但但HBcAg也可在肝细胞膜表面表达，宿主也可在肝细胞膜表面表达，宿主CTL作用的主要作用的主要 靶抗原。靶抗原。HBcAg抗原很强，能刺激机体产生抗抗原很强，能刺激机体产生抗HBc，但无中和作用。，但无中和作用。检出高效价抗检出高效价抗HBc，特别是抗，特别是抗HBc IgM则表示则表示HBV在肝内在肝内 处于复制状态。处于复制状态。HBeAg：HBeAg可作为可作为HBV复制及血清具有传染性的标志。复制及血清具有传染性的标志。急性乙型肝炎进入恢复期时急性乙型肝炎进入恢复期时HBeAg消失，抗消失，抗HBe阳性；但阳性；但 抗抗HBe亦见于携带者及慢性乙型肝炎血清中。亦见于携带者及慢性乙型肝炎血清中。抗原组成抗原组成易感动物和细胞培养易感动物和细胞培养只有只有黑猩猩黑猩猩对对HBV易感，接种后可发生与人类相易感，接种后可发生与人类相似的急慢性感染。似的急慢性感染。体外细胞培养尚未成功。体外细胞培养尚未成功。近年来应用基因克隆技近年来应用基因克隆技术，可使术，可使HBV基因转移给小鼠或转染细胞株。将病毒基因转移给小鼠或转染细胞株。将病毒DNA导入肝癌细胞后，病毒可复制并在细胞中表达导入肝癌细胞后，病毒可复制并在细胞中表达HBsAg、HBcAg和和HBeAg。有此细胞株可持续地产。有此细胞株可持续地产生生Dane颗粒。这些细胞培养可用于抗颗粒。这些细胞培养可用于抗HBV药物的筛药物的筛选、疫苗制备及选、疫苗制备及HBV致病机制研究等。致病机制研究等。生物学性状抵抗力抵抗力 HBV 对理化因素的抵抗力相当强：对理化因素的抵抗力相当强：对低温、干燥、紫外线、醚、氯仿、酚等均有对低温、干燥、紫外线、醚、氯仿、酚等均有抵抗性。抵抗性。高压灭菌高压灭菌(12115min)、0.5%过氧乙酸、过氧乙酸、5%次氯酸钠、次氯酸钠、3%漂白粉液、漂白粉液、0.2%新洁尔灭等均新洁尔灭等均可使可使HBV失活。失活。但应指出，但应指出，HBV的感染性与的感染性与HBsAg的抗原活性的抗原活性并非一致。如并非一致。如10010min或或pH2.4处理处理6h均可均可使使HBV失去感染性，但仍保持失去感染性，但仍保持HBsAg的抗原活性。的抗原活性。生物学性状传染源和传播途径传染源和传播途径 传染源传染源 急性、慢性乙肝患者及急性、慢性乙肝患者及HBsAg无症状携带者均为无症状携带者均为传染源，特别是无症状的传染源，特别是无症状的HBsAg携带者携带者做为传染源做为传染源危害性更大。危害性更大。致病性和免疫性致病性和免疫性 乙型肝炎主要是经血液或注射途径传播即乙型肝炎主要是经血液或注射途径传播即非胃肠道的感染非胃肠道的感染(parenteral infection)：1.血液、血制品传播：血液、血制品传播：有少数有少数HBsAg阴性、而阴性、而HBV DNA阳阳 性性的血液仍可引起感染。的血液仍可引起感染。2.医源性传播：医源性传播：通过注射、手术、采血、拔牙、内窥镜检查、预通过注射、手术、采血、拔牙、内窥镜检查、预防接种、针刺、纹身、各种医疗器具、甚至工作人员的手，均可防接种、针刺、纹身、各种医疗器具、甚至工作人员的手，均可传播乙型肝炎。传播乙型肝炎。3.母婴传播母婴传播主要是在围产期，分娩时新生儿经产道接触或吸吞入主要是在围产期，分娩时新生儿经产道接触或吸吞入含含HBV的母血、羊水、或分泌物所致，少数可由于宫内感染的母血、羊水、或分泌物所致，少数可由于宫内感染(10%)，也可通过母乳、体液或密切接触而传播。，也可通过母乳、体液或密切接触而传播。4.接触传播接触传播：日常生活中如共用牙刷、洗澡刷子、剃须刀等可引：日常生活中如共用牙刷、洗澡刷子、剃须刀等可引起起HBV感染。通过唾液传播的可能性也应受到重视。性交，尤其感染。通过唾液传播的可能性也应受到重视。性交，尤其男性同性恋亦可传播男性同性恋亦可传播HBV。因此，在西方国家将乙肝列为性传播。因此，在西方国家将乙肝列为性传播疾病疾病(STD)之一。尿液、鼻液、汗液和粪之一。尿液、鼻液、汗液和粪-口传播的可能性很小。口传播的可能性很小。致病性和免疫性致病性和免疫性传播途径传播途径致病机制致病机制 乙型肝炎的临床表现呈多样性，可表现为乙型肝炎的临床表现呈多样性，可表现为无症状无症状病毒携带者、急性肝炎、慢性肝炎及重症肝炎病毒携带者、急性肝炎、慢性肝炎及重症肝炎等。等。HBVHBV的致病机制，除了的致病机制，除了HBVHBV对肝细胞直接损害外，对肝细胞直接损害外，主要是通过宿主的免疫应答引起肝细胞的病理改变的主要是通过宿主的免疫应答引起肝细胞的病理改变的临床表现。临床表现。致病性和免疫性致病性和免疫性1 1细胞介导的免疫病理损伤细胞介导的免疫病理损伤 2 2体液免疫所致的免疫损伤体液免疫所致的免疫损伤 3 3自身免疫所致的损伤自身免疫所致的损伤 致病性和免疫性致病性和免疫性免疫性免疫性 体液免疫体液免疫：抗抗HBs：中和体液中：中和体液中HBV，使其失去感染性。，使其失去感染性。抗抗PreS2：封闭病毒与肝细胞表面的：封闭病毒与肝细胞表面的PHSA受体，受体，阻止阻止 病毒吸附于肝细胞。病毒吸附于肝细胞。抗抗Hbe：可通过与肝细胞表面：可通过与肝细胞表面HBeAg结合后，通结合后，通过补体过补体 介导而参与破坏病毒感染的肝细胞。介导而参与破坏病毒感染的肝细胞。细胞免疫细胞免疫：主要依靠：主要依靠CTL。CTL对对HBV感染的肝细胞感染的肝细胞(靶靶细细 胞胞)有直接杀伤作用。据认为，针对有直接杀伤作用。据认为，针对HBcAg的的CTL在清在清 除除HBV感染的靶细胞中有较重要的作用。感染的靶细胞中有较重要的作用。致病性和免疫性致病性和免疫性NT抗体抗体HBV与原发性肝癌与原发性肝癌 HBV感染与原发性肝癌的发生有密切关系，其依据是：感染与原发性肝癌的发生有密切关系，其依据是：经流行病学调查表明，乙型肝炎患者及经流行病学调查表明，乙型肝炎患者及HBsAg携带携带者的原发性肝癌发生率明显高于未感染人群（危险性高者的原发性肝癌发生率明显高于未感染人群（危险性高217倍）；倍）；用与用与HBV分子生物学相似的土拨鼠肝炎病毒分子生物学相似的土拨鼠肝炎病毒(WHV)可诱发土拨鼠原发性肝癌。而未感染鼠则无一只发生肝癌；可诱发土拨鼠原发性肝癌。而未感染鼠则无一只发生肝癌；用用HBVDNA探针与肝癌组织进行探针与肝癌组织进行Southern 印迹核印迹核酸杂交时，获得阳性结果，说明肝癌细胞染色体上整合有酸杂交时，获得阳性结果，说明肝癌细胞染色体上整合有HBVDNA。致病性和免疫性致病性和免疫性 最最常用的是采用常用的是采用血清学方法血清学方法检测患者血清中检测患者血清中HBVHBV抗原、抗体，并根据这些标志进行分析判断。抗原、抗体，并根据这些标志进行分析判断。近年来，临床上也常采用近年来，临床上也常采用PCRPCR技术技术对乙型肝炎进对乙型肝炎进行辅助诊断。行辅助诊断。微生物学检查法微生物学检查法检测检测HBV抗原、抗体抗原、抗体 常用的方法有常用的方法有RIA、ELISA法，间接血凝、反向间接血法，间接血凝、反向间接血凝，对流免疫电泳、双向琼脂扩散法等，其中凝，对流免疫电泳、双向琼脂扩散法等，其中最敏感最敏感的方法是的方法是RIA、ELISA。检测的项目主要是检测的项目主要是HBsAg和抗和抗HBs、HBeAg和抗和抗HBe、以及抗以及抗HBcIgM和抗和抗HBcIgG，必要时也可检测，必要时也可检测PHSA、PreS1和和PreS2的抗原和抗体。上述各项检查组成一套乙型的抗原和抗体。上述各项检查组成一套乙型肝炎病毒抗原抗体检测系统肝炎病毒抗原抗体检测系统(HBV血清标志血清标志)。微生物学检查法微生物学检查法1.HBsAg：感染性（：感染性（+）；传染性（）；传染性（+）；）；抗抗HBs：NT抗体，免疫力（抗体，免疫力（+）；）；2.HBcAg：DNA复制标志，血清中（复制标志，血清中（-），肝细胞核内），肝细胞核内（+）；）；抗抗HBc：无中和作用，包括：无中和作用，包括 抗抗HBc IgM：急性乙肝：急性乙肝 抗抗HBc IgG：恢复期：恢复期3.HBeAg：感染性（：感染性（+）；传染性（）；传染性（+）；恢复期（）；恢复期（-）；）；抗抗Hbe：无中和作用，恢复期（：无中和作用，恢复期（+），携带者，慢性（），携带者，慢性（+）；）；4.PreS1、PreS2和和PHSA受体：新感染（受体：新感染（+）；）；抗抗PreS1、抗、抗PreS2：NT抗体，恢复期（抗体，恢复期（+）；）；微生物学检查法微生物学检查法微生物学检查法微生物学检查法HBV感染血清标志及其临床意义感染血清标志及其临床意义HBsAgHBeAg抗抗HBc 抗抗HBe抗抗HBs结结 果果 解解 释释IgMIgG-+感染过感染过HBV或接种过乙肝疫苗或接种过乙肝疫苗,有免疫力有免疫力+-/+-肝功正常为无症状携带者肝功正常为无症状携带者;肝功肝功异常为正患乙肝异常为正患乙肝;+-+-（小三阳）正患乙肝（小三阳）正患乙肝,肝炎趋向肝炎趋向好转，有传染性好转，有传染性+/-+-正患肝炎正患肝炎,或趋于恢复，有传染或趋于恢复，有传染性性+/-（大三阳）正患乙肝（大三阳）正患乙肝,病毒复制病毒复制,传染性强传染性强-+/-+乙型肝炎恢复期乙型肝炎恢复期血清HBV DNA检测 核酸分子杂交及核酸分子杂交及PCR技术检测技术检测HBV DNA可用于可用于乙型肝炎的诊断及流行病学调查。乙型肝炎的诊断及流行病学调查。常用斑点杂交法将特异的常用斑点杂交法将特异的HBV DNA探针与患者探针与患者血清进行杂交检测血清中血清进行杂交检测血清中HBV DNA，方法敏感、特，方法敏感、特异，能测出异，能测出0.1-1pg核酸。核酸。用用PCR技术检测患者血清中技术检测患者血清中HBV DNA,在临床上在临床上也已用于辅助诊断，特别是定量也已用于辅助诊断，特别是定量PCR能测出能测出DNA拷拷贝数量，可做为药物疗效的考核指标。贝数量，可做为药物疗效的考核指标。微生物学检查法微生物学检查法采取切断传播途径为主的综合性措施采取切断传播途径为主的综合性措施：对乙肝患者及携带者的血液、分泌物和用具等要严格对乙肝患者及携带者的血液、分泌物和用具等要严格消毒灭菌；消毒灭菌；严格筛选献血员，防止血液传播；严格筛选献血员，防止血液传播；提倡使用一次性注射器及输液器；提倡使用一次性注射器及输液器；凡手术操作，使用接触过血液的医疗器械等也必须严凡手术操作，使用接触过血液的医疗器械等也必须严格消毒，要防止病人与医务人员间的相互传播；格消毒，要防止病人与医务人员间的相互传播；对高危人群要进行特异性预防。对高危人群要进行特异性预防。防治原则防治原则主动免疫主动免疫 接种乙型肝炎疫苗是最有效的预防措施。接种乙型肝炎疫苗是最有效的预防措施。乙型肝炎疫苗是纯化的乙型肝炎疫苗是纯化的HBsAg，不含，不含HBV DNA，具有良好，具有良好免疫原性，而无感染性。免疫原性，而无感染性。应用的疫苗有两种，即应用的疫苗有两种，即HBsAg血源疫苗和血源疫苗和HBV基因重组疫基因重组疫苗。另有苗。另有HBsAg多肽疫苗或多肽疫苗或HBV DNA疫苗均在研究之中。疫苗均在研究之中。被动免疫被动免疫 乙肝免疫球蛋白（乙肝免疫球蛋白（HBIg）是由含有高效价抗）是由含有高效价抗HBs人血清提人血清提纯而成，可用于紧急预防。主要用于以下情况：纯而成，可用于紧急预防。主要用于以下情况：医务人员或皮肤损伤被乙型肝炎患者血液污染伤口者；医务人员或皮肤损伤被乙型肝炎患者血液污染伤口者；母亲为母亲为HBsAg、HBeAg阳性的新生儿；阳性的新生儿；发现误用发现误用HBsAg阳性的血液或血制品者；阳性的血液或血制品者；HBsAg、HBeAg阳性者的性伴侣。阳性者的性伴侣。防治原则防治原则 目前治疗乙型肝炎尚无特效药物和方法。除目前治疗乙型肝炎尚无特效药物和方法。除了干扰素有一定效果外，据报道某些核苷类似物了干扰素有一定效果外，据报道某些核苷类似物如无环鸟苷，多聚酶抑制剂及某些逆转录酶抑制如无环鸟苷，多聚酶抑制剂及某些逆转录酶抑制剂（如拉米夫定）对剂（如拉米夫定）对HBV有效，如与免疫调节药有效，如与免疫调节药物并用治疗乙型肝炎效果会更好。物并用治疗乙型肝炎效果会更好。防治原则防治原则第第3 3节节 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）引引起丙型肝炎。起丙型肝炎。HCV主要经血或血制品传播，目前占输血后主要经血或血制品传播，目前占输血后肝炎的肝炎的80%90%。在我国丙型肝炎流行率为。在我国丙型肝炎流行率为2.1%。其临床和流行病学特点类似乙型肝炎，但。其临床和流行病学特点类似乙型肝炎，但症状较轻，演变为慢性者多见，部分患者可发展为症状较轻，演变为慢性者多见，部分患者可发展为肝硬化或肝癌。肝硬化或肝癌。HCV HCV属于黄病毒科（属于黄病毒科（flaviviridaeflaviviridae）丙型肝炎病）丙型肝炎病毒属。其生物学性状及基因结构与黄病毒相似。毒属。其生物学性状及基因结构与黄病毒相似。HCVHCV呈球形，其直径约为呈球形，其直径约为30nm30nm60nm60nm，外有脂，外有脂蛋白包膜。蛋白包膜。生物学性状生物学性状 核酸为核酸为+ssRNA。5端端UTR核酸序列保守性强，病毒株间差异小，可用于诊断。核酸序列保守性强，病毒株间差异小，可用于诊断。包膜蛋白区和非结构蛋白包膜蛋白区和非结构蛋白1区基因易变异，包膜蛋白抗原性区基因易变异，包膜蛋白抗原性变异，不被抗体识别，病毒持续存在，易发展成慢性；变异，不被抗体识别，病毒持续存在，易发展成慢性；目前对目前对HCV尚不能通过血清分型，而根据基因序列同源性尚不能通过血清分型，而根据基因序列同源性及亲缘关系分析可将世界各地分离到的毒株分为及亲缘关系分析可将世界各地分离到的毒株分为型型6个基因个基因型，每个型又可分为亚型型，每个型又可分为亚型(a、b、c表示表示)。欧美流行株多为。欧美流行株多为型，型，而亚洲和我国流行的多为而亚洲和我国流行的多为型。型。生物学性状生物学性状 至今至今HCV的细胞培养尚未成功。的细胞培养尚未成功。黑猩猩是黑猩猩是HCV唯一易感动物。唯一易感动物。HCV对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感，紫外线对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感，紫外线照射、照射、1005min、20%次氯酸、福尔马林次氯酸、福尔马林(1 1000)均可使均可使HCV失活。失活。生物学性状生物学性状 HCV主要通过输血或血制品、注射、性交和母婴主要通过输血或血制品、注射、性交和母婴传播。传播。潜伏期为潜伏期为226w，平均，平均7.4w，但由输血或，但由输血或血制品引起的丙型肝炎潜伏期较短，大多数在输血后血制品引起的丙型肝炎潜伏期较短，大多数在输血后512w发病。大多数患者不出现症状或症状较轻，发病。大多数患者不出现症状或症状较轻，多为无黄疽型，多为无黄疽型，90%以上的患者演变为慢性肝炎，进以上的患者演变为慢性肝炎，进而发展为肝硬变，甚至原发性肝癌。而发展为肝硬变，甚至原发性肝癌。关于关于HCV感染的慢性化机制，目前认为感染的慢性化机制，目前认为HCV并不直接引起肝细胞损害，而主要是通过免疫病理损并不直接引起肝细胞损害，而主要是通过免疫病理损伤和细胞凋亡导致肝细胞破坏。伤和细胞凋亡导致肝细胞破坏。致病性和免疫性致病性和免疫性 HCV感染后：感染后：抗抗 HCV IgM：出现较早，持续时间短；：出现较早，持续时间短；抗抗HCV IgG：出现较迟。：出现较迟。这些抗体在抗这些抗体在抗HCV感染中有何实际意义，感染中有何实际意义，是否具有保护作用，目前尚不十分清楚。是否具有保护作用，目前尚不十分清楚。致病性和免疫性致病性和免疫性1.抗抗HCV抗体的检测抗体的检测 通过通过ELISA、放射免疫法检测抗、放射免疫法检测抗HCV IgG或或IgM。若抗。若抗HCV IgM阳性时可对阳性时可对HCV感染进行早期感染进行早期诊断。诊断。2.HCV RNA检测检测 多采用多采用RT-PCR扩增患者血清后，检测扩增患者血清后，检测HVC RNA。该法敏感性和特异性好，可以提高。该法敏感性和特异性好，可以提高HCV RNA检出率，供诊断时做参考检出率，供诊断时做参考。微生物学检查法微生物学检查法 预防主要通过检测抗预防主要通过检测抗HCV或或HCV RNA筛选献血筛选献血员来降低输血后丙型肝炎的发病率。员来降低输血后丙型肝炎的发病率。其他预防措施同其他预防措施同HBV。免疫球蛋白有无预防作用尚无定论。免疫球蛋白有无预防作用尚无定论。目前还无特异性防治对策，一般治疗原则与乙目前还无特异性防治对策，一般治疗原则与乙型肝炎相同。型肝炎相同。防治原则防治原则第第4 4节节 丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒 丁型肝炎病毒（丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV），曾称曾称肝炎病毒（肝炎病毒（hepatitis virus），是丁型），是丁型肝炎的病原体。肝炎的病原体。通过黑猩猩实验感染证明它是一种缺陷病毒，通过黑猩猩实验感染证明它是一种缺陷病毒，必须在必须在HBV或其它嗜肝或其它嗜肝DNA病毒辅助下才能复病毒辅助下才能复制，因此其致病必须同时有制，因此其致病必须同时有HBV感染，病情较感染，病情较单纯感染单纯感染HBV的患者严重。的患者严重。HDV为直径为直径35nm37nm的球形颗粒，核心的球形颗粒，核心含有环状含有环状-ssRNA和和HDAg(抗原抗原)。HDV表面为表面为HBV包膜，主要含有包膜，主要含有HBsAg。HDV不能独立复制，须在不能独立复制，须在HBV或其他嗜肝或其他嗜肝DNA病毒辅助下才能增殖。病毒辅助下才能增殖。HDV RNA可编码可编码 HDAg，刺激机体产生抗，刺激机体产生抗HD。HDV仅有一血清型，敏感动物是黑猩猩、土仅有一血清型，敏感动物是黑猩猩、土拨鼠和北京鸭等。拨鼠和北京鸭等。生物学性状 传播方式：与传播方式：与HBV基本相同，主要经输血或注射基本相同，主要经输血或注射传播。与传播。与HBV相比，相比，HDV母婴垂直传播少见，而性传播母婴垂直传播少见，而性传播相对重要。相对重要。由于由于HDV是缺陷病毒，而且其衣壳为是缺陷病毒，而且其衣壳为HBsAg，从而决定了从而决定了HDV只能感染只能感染HBsAg阳性者，其感染有两种阳性者，其感染有两种形式：形式：共同感染共同感染(coinfection)：与：与HBV同时感染；同时感染；重叠感染重叠感染(superinfection)：在慢性乙型肝炎或：在慢性乙型肝炎或HBsAg携带者的基础上再感染携带者的基础上再感染HDV。HDV致病作用主要是病毒对肝细胞的直接损伤，致病作用主要是病毒对肝细胞的直接损伤，而机体免疫应答对丁型肝炎发病无明显影响。而机体免疫应答对丁型肝炎发病无明显影响。致病性和免疫性致病性和免疫性 HDV感染后产生抗感染后产生抗HDV IgM，抗，抗HDV IgG。丁型肝炎发展为慢性时，抗丁型肝炎发展为慢性时，抗HDV IgM和和IgG常呈持续常呈持续高效价，可做为慢性丁型肝炎诊断指标。高效价，可做为慢性丁型肝炎诊断指标。抗抗HDV不能清除病毒，其作用还有待研究。不能清除病毒，其作用还有待研究。致病性和免疫性致病性和免疫性1.血清学方法血清学方法：用用ELISA或或RIA检测血清中检测血清中HDVAg或抗或抗HDV。HDVAg虽可于急性虽可于急性HDV感染早期检出，但阳性率低；感染早期检出，但阳性率低；慢性病人则测不出，但肝活检慢性病人则测不出，但肝活检HDVAg可呈阳性。抗可呈阳性。抗HDV IgM于第于第45w检出率高，有诊断意义。检出率高，有诊断意义。2.核酸分子杂交法核酸分子杂交法：检测血清中检测血清中HDV RNA。其浓度与。其浓度与HDVAg平平行。抗行。抗HDV出现后，出现后，HDV RNA转阴。转阴。HDV RNA的的存在标志存在标志HDV复制以及血清有传染性。复制以及血清有传染性。微生物学检查法微生物学检查法目前尚无特效药物，据报道用重组目前尚无特效药物，据报道用重组IFN或或 IFN治疗丁型肝炎，可抑制病毒复制，且可改善临床症状。治疗丁型肝炎，可抑制病毒复制，且可改善临床症状。预防原则与乙型肝炎相同，主要为严格筛选献预防原则与乙型肝炎相同，主要为严格筛选献血员和血制品，防止注射或其它操作的医源性传染，血员和血制品，防止注射或其它操作的医源性传染，开展卫生宣传教育，避免性传播。开展卫生宣传教育，避免性传播。防治原则防治原则第五节第五节 戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒 1989年在美国夏威夷召开的国际肝癌会上，将年在美国夏威夷召开的国际肝癌会上，将肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒正式命名为肠道传播的非甲非乙型肝炎病毒正式命名为戊型肝戊型肝炎病毒（炎病毒（hepatitis E virus,HEV），是戊型肝炎，是戊型肝炎（hepatitis E，HE）的病原体。）的病原体。戊型肝炎主要经粪口途径传播常引起大流行，戊型肝炎主要经粪口途径传播常引起大流行，其临床和流行病学特点类似甲型肝炎。其临床和流行病学特点类似甲型肝炎。HEV呈球形，无包膜，表面呈现锯齿状，类似杯呈球形，无包膜，表面呈现锯齿状，类似杯状病毒。到目前为止，世界各地分离到的病毒只有一状病毒。到目前为止，世界各地分离到的病毒只有一个血清型。个血清型。HEV直径直径2738nm，20面体立体对面体立体对称，核酸为线形称，核酸为线形+ssRNA，易感染动物是猕猴，也可感染非洲绿猴、恒易感染动物是猕猴，也可感染非洲绿猴、恒河猴、猫猴和黑猩猩等灵长类动物，口服或静注含有河猴、猫猴和黑猩猩等灵长类动物，口服或静注含有HEV病原材料均可使之感染。病原材料均可使之感染。生物学性状生物学性状主要通过粪主要通过粪-口途径传播，饮水被病毒污染可造口途径传播，饮水被病毒污染可造成水源性暴发流行，也可通过密切接触、食物污染成水源性暴发流行，也可通过密切接触、食物污染等方式传播。等方式传播。患者多见于患者多见于2040岁成年人，潜伏期为岁成年人，潜伏期为29w，多数患者于病后，多数患者于病后6w即好转或痊愈。少数即好转或痊愈。少数患者可表现为重症肝炎，甚至可导致死亡。孕妇感患者可表现为重症肝炎，甚至可导致死亡。孕妇感染时，发病率高，病情严重，常发生流产或死产。染时，发病率高，病情严重，常发生流产或死产。HEV致病机制尚不明了，可能是病毒本身作用及机致病机制尚不明了，可能是病毒本身作用及机体免疫应答造成肝细胞损伤。体免疫应答造成肝细胞损伤。病后有一定免疫力。病后有一定免疫力。致病性和免疫性1.免疫电镜免疫电镜：可取病人粪便标本进行常规免疫电镜检查可取病人粪便标本进行常规免疫电镜检查HEV颗粒。颗粒。2.血清学方法血清学方法 ELISA或或Western印迹试验检测抗印迹试验检测抗HEV，包括抗，包括抗HEV IgM和抗和抗HEV IgG。3.HEV核酸检测核酸检测：多采用多采用PCR法。可取患者粪便标本或血清标本检测法。可取患者粪便标本或血清标本检测HEV RNA。微生物学检查法微生物学检查法 原则上与甲型肝炎相同。主要措施是保护水源，原则上与甲型肝炎相同。主要措施是保护水源，防止被粪便污染，保证安全用水。在流行地区广泛防止被粪便污染，保证安全用水。在流行地区广泛宣传不喝生水，改善环境卫生和个人卫生，降低新宣传不喝生水，改善环境卫生和个人卫生，降低新患发病率。患发病率。免疫球蛋白预防无效。免疫球蛋白预防无效。本病治疗原则是早期发现，早期治疗。合并本病治疗原则是早期发现，早期治疗。合并重症肝炎时按抢救暴发性肝功能衰竭的原则处理。重症肝炎时按抢救暴发性肝功能衰竭的原则处理。防治原则防治原则第六节第六节 新近发现的肝炎相关病毒新近发现的肝炎相关病毒 目前，除公认的甲、乙、丙、丁和戊型肝炎外，目前，除公认的甲、乙、丙、丁和戊型肝炎外，尚存在可经肠道外传播而引起的急、慢性肝炎，统称尚存在可经肠道外传播而引起的急、慢性肝炎，统称为非甲戊型肝炎。其中研究较多的是为非甲戊型肝炎。其中研究较多的是庚型肝炎病毒庚型肝炎病毒（HGV）和输血传染性病毒（）和输血传染性病毒（TTV）。它们对肝脏和肝外的致病性至今尚不能确定，特它们对肝脏和肝外的致病性至今尚不能确定，特别是别是TTV的感染未发现对人体有致病性。从其分离的的感染未发现对人体有致病性。从其分离的来源考虑，将来源考虑，将GBV-C/HGV和和TTV统称为新近发现的统称为新近发现的肝炎相关病毒（肝炎相关病毒（Hepatitis-related viruses）。一、庚型肝炎病毒（一、庚型肝炎病毒（HGVHGV）19951995年，美国科学家先后从输血后非甲戊型肝年，美国科学家先后从输血后非甲戊型肝炎病人血清中获得的两株肝炎相关病毒核苷酸序列，分炎病人血清中获得的两株肝炎相关病毒核苷酸序列，分别命名为别命名为GBGB病毒病毒-C-C和庚型肝炎病毒（和庚型肝炎病毒（Hepatitis G Hepatitis G virus,HGVvirus,HGV）。后来发现二者是同一种病毒的不同分）。后来发现二者是同一种病毒的不同分离株。由于至今尚未正式命名，故有离株。由于至今尚未正式命名，故有HGVHGV、GBV-CGBV-C及及GBV-C/HGVGBV-C/HGV之称。之称。传染源：主要是庚型肝炎病毒感染者或病毒携带者。灵长类动传染源：主要是庚型肝炎病毒感染者或病毒携带者。灵长类动物虽可感染该病毒，但其自然感染情况及其作为传染源的意义尚物虽可感染该病毒，但其自然感染情况及其作为传染源的意义尚不清楚。不清楚。传播途径：经血或肠道外传播。受血者、静脉内毒瘾者、接传播途径：经血或肠道外传播。受血者、静脉内毒瘾者、接触血液的医务人员等感染率高。此外，也可经母婴传播性传播。触血液的医务人员等感染率高。此外，也可经母婴传播性传播。HGVHGV多为持续感染。由于传播途径相同，多为持续感染。由于传播途径相同，HGVHGV常与常与HBVHBV、HCVHCV等重叠感染，但该病毒并不加重乙型和丙型肝炎的临床症状和肝等重叠感染，但该病毒并不加重乙型和丙型肝炎的临床症状和肝脏酶学的变化，有研究表明合并脏酶学的变化，有研究表明合并HGVHGV感染的感染的HCVHCV感染者中，有些病感染者中，有些病人的人的HCVHCV感染消失，感染消失，ALTALT恢复正常，而恢复正常，而HGVHGV感染持续存在。因此，对感染持续存在。因此，对HGVHGV的致病性尚需进一步研究。的致病性尚需进一步研究。HGV对干扰素敏感，故对对干扰素敏感，故对HGV的治疗，特别对的治疗，特别对HCV和和HGV合并感染的病例可使用干扰素合并感染的病例可使用干扰素(IFN)治疗。临床证明用病毒治疗。临床证明用病毒唑治疗庚型肝炎效果不佳。唑治疗庚型肝炎效果不佳。二、输血传染性病毒（二、输血传染性病毒（TTVTTV）1997年日本学者年日本学者Nishizawa等应用代表性差异分析等应用代表性差异分析法（法（representational difference analysis,RDA）技术从）技术从一名输血后非甲庚型肝炎病人（一名输血后非甲庚型肝炎病人（T.T.）中克隆到一）中克隆到一个个DNA片段，而且发现该片段，而且发现该DNA类似于病毒的基因组。类似于病毒的基因组。并按病人姓氏缩写命名为并按病人姓氏缩写命名为TT病毒（病毒（TT virus,TTV），），恰与恰与经血传播病毒经血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)巧合。巧合。TTV TTV主要通过输血或血制品传播，但也可通过粪主要通过输血或血制品传播，但也可通过粪-口途径、唾口途径、唾液飞沫、精液和乳汁等多途径传播。在一些动物血清中亦发现液飞沫、精液和乳汁等多途径传播。在一些动物血清中亦发现了了TTV DNATTV DNA的存在，但其是否具有传染源的意义尚不清楚。的存在，但其是否具有传染源的意义尚不清楚。TTVTTV在人群中感染率高，据报道欧美等发达国家正常献血员在人群中感染率高，据报道欧美等发达国家正常献血员血清中血清中TTV DNATTV DNA检出率约检出率约33%33%76%76%，在非甲庚型肝病慢性肝炎，在非甲庚型肝病慢性肝炎检出率为检出率为4646。TTVTTV常与常与HCVHCV重叠感染。重叠感染。TTVTTV感染一般表现为无症状携带者，感染一般表现为无症状携带者，至今尚未发现至今尚未发现TTVTTV有引起肝炎或其他疾病的能力。因此，有引起肝炎或其他疾病的能力。因此，TTVTTV是是否有嗜肝性和致病性尚不明确，正在研究之中。否有嗜肝性和致病性尚不明确，正在研究之中。一、目的要求一、目的要求1 1了解肝炎病毒的核酸类型与基因结构了解肝炎病毒的核酸类型与基因结构2 2熟悉熟悉HAVHAV，HBVHBV的形态结构，抵抗力，致病性与免疫的形态结构，抵抗力，致病性与免疫性；性；HCVHCV，HDVHDV和和HEVHEV的致病性；熟悉五型肝炎病毒的防的致病性；熟悉五型肝炎病毒的防治原则治原则3 3掌握掌握HBVHBV的抗原的抗原抗体系统及其在临床诊断中的意抗体系统及其在临床诊断中的意义，掌握五型肝炎病毒的传播途径义，掌握五型肝炎病毒的传播途径二、教学内容二、教学内容 教学大纲教学大纲Vn5g1KmhINIK-WpYws%ctXJ2hx&VnO9X0!KANsYfRI5lB&RbtNebUjYN1406yu7SEQz3HqDp0OK396aAq*v54H$bIw!8r#ToRf(c5!U0OgWhmWDkY-Af$nmK8AHf88+DDW8i1eG-b&3oGG8-(XtzZkFC&*jUOeAYsr0z2Za80-k7LbVWrR5IE7yE%W4vRSj60UhbnCGioK*1MUGvD8pyOfh+LxInVh#F)C7voH0pu1&*Yu0Nl4d!pWyCfOh0goGTL4RBdAloubIMAps#-%$aHg)H(U$59YB9PyKs)DqH(ftnTBr9E1ZICXMl&RzL0mr+(3vPy)oZO5hb%j432NnHP!lcPkR%EzA8GJudaz1jAA5+vuNv#eV3SRULmpc+0u+ai8ClmA-(JgBy!DhOC)d3ISj(&DKu5JF1QBn1jkj0vjldt4qBPfhFya9K$p0l1CFXyOIz8eN2xj4amaviY5qkHpXAY7C%xWYSOsFw&Byxd*-WgxQhnQaJ4X$4qJtB4w2F%fOTiJ2TM&e%3ZR+EM&67SPxgi#KAuZf%U6TLXunF5ACiroWi1hoJYPi)XFyEslqtjC%5LAiDGms86UB2-u)sFQuT3oiChGMuECjRqlPDxjYxEW!84me9F9daRKfScgLIAi$pq8kFqbg&bT40omdyEc)(vQM2$oxrXrxHgfnbxdLlDGtNB5hTBhQUlRfvnkmbveZpwuLu30-!2ziseEUT9#WnN+BI(41mlhQHKZnGmYvSyDXIibH(sW)dFXck5+i%b!+SB(F+v+lqrB%um14a1Mld$(k6xsPkkW)fUOeNm$4BP$RtLaZwJz83a0GQq*4RoN(ME3IlPbSKnuTn2*#gZDLiC&5GU&-I+dkVK4dkHWD-P6R-b)o1JWp+YitjsO9f*zbf626JyMGYRVifyTQ9o-J)*UF6$Ef!ZOaOuEyBh*3zDBunph+!uQnzzWir(GHC6fM)0rMAUE9hyhPnRThFFt9!kUp+iEVPgyXBGPN$W7o-YFs)yBMEy9S-RQYN7tV-3P#n6uxD0 xR)(cMGEy+mSYRYQh6oa!lWDhIyXG0Nxzw9mMgW9ubSng$YD%ESoJ(B73RinV+pDAJdNL3qrbG)jXJO(2Ee4bS8gEEw6XrZhQF+pg&fz$W(M3h)01OfD!rIQuN%Ix%PNOE!%7qGEXi+4XydPC*8eW1Z7sEF%qOI3cj6EzTEC!N*dfJMDyW9UCd&6+XVpxVam5g!FzZ#SWF#w9OAUXV(wDuf9KCGHrNn6Tbth+#6#r!DGhN9W%Lh$VcheiIA8Lpt1sSmjXeHhn4LnkPZ!t&%bwFoC&nBd2OurW%#BcnSjKNmFWf0r!Nit&$k*5!#4(m(Yk6w#SvR5fqTZp+FJXP&0T+1z9nRqz43Uo#qEukwoU9sL*Z$qVJXWwW(4hU#gPmhXX%mP*ZNGtBw3#jERByykNC!lBVguxKKj10S2F!eY)2$3nr&uESOmb(OWi7nn#qUpEk&Dx&-zQA1NR(bpI+-tueLjJSc8zNwNSSxL&veZz03*Q4sx6)yi&Mv$%gox3ipg#mqWk4js1adJ2i+mAK%&CXO0Qc)(Q3p9bZz%YABVNR1Nf(%#WS$DHQ8(S#ZjT%VWqniQD2hRV%jpn8VeDsW7)Ns0MMY+Wt1b66m4!(NINnhdnq53L0ZRH7jCaFuoh&vCLZXb2x+INLdj+YuHbKm0sNkYZIQzb31oEG&QN$X46%TRaf8uf$gwR9ui0HqGt%HW9Kl1cC!ceOY#z24pRCNtG8vqUlXIYT1e6zjyWyMI-%ywKXW5a3+e#etPn4gxFoE0zUO1C1l9nL()zolaNN)mznG5F!U4C)nFzj8h!ewW(QSXQiea-2BID%M-Hozalc)DjwZe(5W7DT*UziaJvbq!BR2oEpB)fvfW1bLIx5!mO00iCF#Onwq8+3gfbKuFhMsX#ABFXAlyg3Upf*+lac&f3Rp(6fj(vpOKDMAfhLQOQu#6MphLWCgFochym1GNhnSdQHz44iPPF7oTYskdYQWMCOnyDV(z*uC$sifYL)s)6buIs2TjA+%!nG4W1iJ1&iEng-#maZ8cHfxx4Ctc9shIpg5YU6$)1%qfDk3u4#d52zM%-gYjue1&oEt!)A8-FzBlVf1eh2)lEpRgqBPIj&it&CSg*D!PDkrf&oOkt)P*on$KoKJjP8h#MMUgjCX)QEdWLFN(c9J+4fMKo)PM0GdHJ3MjJEZkVO6cagJEgXGPt!o0rNdKZIP(7)o0S8X552bLOW&Wl9psOy&eU3WZCE*#!fpsh$F)IJPIW-Iqzcs8gcQO+hlEC8kk