《发酵机制》PPT课件

微生物 产物 A. 遗传特征: 菌种种类、DNA特征 B . 环境条件：微生物生长及反应的环境 发酵机制：微生物利用基质，通过代谢得到人们所需的产物的内在规律 内在规律：代谢途径、代谢调控规律、环境因素的影响,第六章 发酵机制,分解代谢是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力（或称还原当量，一般用H来表示）的作用。,合成代谢与分解代谢正好相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量和H形式的还原力一起合成复杂的大分子的过程。,分解代谢与合成代谢的含义及其间的关系可简单地表示为：,按照产物与微生物生长繁殖的关系分成： 初级代谢产物的代谢机制 次级代谢产物的代谢机制 按照发酵过程（微生物获取能量的形式）分成： 好氧代谢机制（通风发酵） 嫌气代谢机制（厌氧发酵）,葡萄糖代谢的三个阶段 第一、葡萄糖进入细胞内 第二、葡萄糖代谢为三碳糖 四条途径：EMP、PPP（HMP）、ED、PK 第三、有氧条件下三糖彻底氧化（丙酮酸氧化脱羧和三羧酸循环） 无氧条件下继续降解并形成不同代谢产物,葡萄糖经酵解途径生成丙酮酸：,此阶段在细胞胞液(cytoplasm)中进行，一分子葡萄糖(glucose)分解后净生成2分子丙酮酸(pyruvate)，2分子ATP，和2分子（NADH +H+）。糖酵解途径广泛存在于各种细胞中，它的任何一个反应均不需要氧。,1. 活化(activation)己糖磷酸酯的生成：,活化阶段是指葡萄糖经磷酸化和异构反应生成1,6-双磷酸果糖(FBP，FDP)的反应过程。该过程共由三步化学反应组成。,己糖激酶/葡萄糖激酶,磷酸己糖异构酶,磷酸果糖激酶,ATP,ADP,ATP,ADP,*,*,(1),(2),(3), 葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖 G-6-P异构为6-磷酸果糖 F-6-P再磷酸化为 1,6-双磷酸果糖,2.裂解（lysis)磷酸丙糖的生成：,一分子F-1,6-BP裂解为两分子可以互变的磷酸丙糖（triose phosphate)，包括两步反应：,磷酸丙糖异构酶,醛缩酶,(4),(5), F-1,6-BP 裂解为3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮 磷酸二羟丙酮异构为3-磷酸甘油醛,3.放能(releasing energy丙酮酸的生成：,3-磷酸甘油醛经脱氢、磷酸化、脱水及放能等反应生成丙酮酸，包括六步反应。,(6),(7),(8),ATP,ADP,磷酸甘油酸变位酶,3-磷酸甘油醛 脱氢酶,磷酸甘油酸激酶,NAD+Pi,NADH+H+, 3-磷酸甘油醛脱氢并磷酸化生成1,3-二磷酸甘油酸 1,3-二磷酸甘油酸脱磷酸,将其交给ADP生成ATP 3-磷酸甘油酸异构为2-磷酸甘油酸,H2O, 2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） 磷酸烯醇式丙酮酸将高能磷酸基交给ADP生成ATP 烯醇式丙酮酸自发转变为丙酮酸,Summaries 糖酵解代谢途径可将一分子葡萄糖分解为两分子丙酮酸，净生成两分子ATP。 C6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD+2CH3COCOOH+2ATP+2NADH+2H+ 糖酵解代谢途径有三个关键酶，即己糖激酶（葡萄糖激酶）、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。,三个激酶是糖酵解途径的主要调节点。 糖代谢的调节主要是能荷的控制，即受细胞内能量水平的控制。 当体系中ATP含量高时，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性受到抑制，酵解减少。 当需能反应加强，ATP分解，减少，其抑制作用解除，同时ADP、AMP激活己糖激酶和磷酸果糖激酶，而这两个酶催化的产物同时又是丙酮酸激酶的激活剂，结果时糖酵解加快。,糖的无氧酵解（glycolysis)是指葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸后，在无氧条件下继续降解并释放出能量的过程。 NADH2在此过程中将氢交给不同的有机物，形成各种不同的代谢产物（在不同的微生物机体和不同条件下，H2的受体不同，因而丙酮酸的去路也不同）。,第一节 糖嫌气性发酵产物积累机制,葡萄糖 EMP 乙醇乙醛 丙酮酸 乳酸 乙酰CoA 乙酰乙酸CoA 乙酰乙酸 乙酰CoA 丙酮 丁酸 异丙醇 丁醇,二、酒精发酵机制,酵母的酒精发酵（EMP途径，酵母菌的型发酵） C6H12O6+2ADP+2H3PO42C2H5OH+2CO2+2ATP,在好氧条件下，酵母的发酵能力降低，即由于呼吸作用的进行使酒精产量大为降低。其机理是因为酵解过程的控制受末端产物ATP的反馈控制，即有氧时，由于酵解产生的NADH和丙酮酸进入线粒体而产生大量ATP ，ATP控制酵解途径关键酶磷酸果糖激酶的活性，最后抑制葡萄糖进入细胞内，导致葡萄糖利用降低。同时在好氧条件下，丙酮酸激酶活性也由于磷酸果糖激酶活性降低而降低，从而降低糖的酵解速度。 即巴斯德效应,巴斯德效应（Pasteur Effect）,请掌握此概念,酒精发酵中副产物的形成 杂醇油(高级醇）的生成 杂醇油是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称。主要由正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇（2-甲基-1-丁醇）组成。这些高级醇是构成酒类风味的重要组成物质之一，量虽少，但影响很大，当其过量时会影响产品质量，需予以控制。其生成机制如下：,A氨基酸的氧化脱氨作用,B由葡萄糖直接生成 酵母通过糖代谢生成的中间产物-酮酸，再经脱羧、加氢形成少一个碳原子的高级醇。 杂醇油的形成还受酵母菌种、培养基组成和发酵条件的影响。,细菌的酒精发酵(假单胞菌，ED途径） C6H12O6+ADP+H3PO42C2H5OH+2CO2+ATP,利用Z.mobilis等细菌生产酒精，是近年来正在开发的工业，它比传统的酵母酒精发酵有许多优点： （1）代谢速率高 （2）产物转化率高 （3）菌体生成少 （4）代谢副产物少 （5）发酵温度较高 （6）不必定期供氧等。 细菌酒精发酵也有其缺点，主要是其生长PH为5，较易染菌（而酵母菌为pH3），其次碳源利用面较窄，仅限于葡萄糖、果糖和蔗糖，另外细菌耐乙醇力较酵母菌为低（前者约为7.0，后者则为810）。,三、乳酸(Lactic acid)发酵机制,化学名称: -羟基丙酸。 1同型乳酸发酵 C6H12O6+2ADP+2Pi+2NADH+2H+ 2CH3CHOHCOOH+2ATP+2NAD+ 主要微生物：乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌，嗜酸乳杆菌。 这种发酵对糖的理论转化率为100%。,型（对糖的理论转化率为50%）,C6H12O6 CH3CHOHCOOH+C2H5OH+CO2,2异型乳酸发酵 主要微生物:肠膜明串珠菌、短乳杆菌、真菌的根霉和双歧杆菌。异型乳酸发酵分、两种类型, 型 2C6H12O6 2CH3CHOHCOOH+3CH3COOH 型为双歧途径（Bifidum patheay） ，即由两歧双歧杆菌分解葡萄生成乳酸的途径。双歧杆菌为严格厌氧菌，对营养要求较高。与其他乳酸菌的异型发酵不同。在葡萄糖发酵中，2mol葡萄糖产生3mol乙酸，2mol乳酸和2.5molATP。双歧杆菌无醛缩酶，也无葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，不能通过EMP途径，但含有活性磷酸解酮酶类，在这个途径中无加氢和还原反应，葡萄糖转变为乙酸和磷酸甘油醛，然后,3-磷酸甘油醛在乳酸脱氢酶的作用下转变为乳酸。,异型乳酸发酵,第二节 柠檬酸发酵机制,一、 概况 柠檬酸是一种重要的有机酸，化学名称为3-羟基3-羧基戊二酸，其结构式为：,柠檬酸发酵的总反应式： 2C6H12O6+3CO2 2C6H8O7+4H2O 理论转化率106.7%, 实际转化率8090%,产酸12 14%,发酵时间60 80 hr. 1.发酵菌种: 黑曲霉(Asp.niger)和解脂假丝酵母(Candida lipolytica) 2.发酵原料:糖蜜、薯干粉（木薯粉）、葡萄糖母液、玉米（小麦）淀粉（TD-01）、玉米粉（Co827）,柠檬酸的生产： 1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。,必须解决的两个问题：,柠檬酸的代谢途径及其反馈调节情况？ 什么机制可以造成柠檬酸积累？,1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉中存在EMP途径的所有酶； 1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80走EMP途径； 19541955年，Ramakrishman和Martin研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环； 1958年，MeDomough等发现黑曲霉还存在HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于孢子形成阶段；,二、柠檬酸生物 合成途径,线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低的原因。当pH逐渐降低，达到pH2.0时，顺乌头酸酶、异柠檬酸酶失活,存在两个CO2固定系统（需Mg2、K）： 1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强） 2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸 丙酮酸羧化酶基本上不受代谢调节的控制，这个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力 TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。,糖酵解代谢的调节 正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。,2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这对柠檬酸的积累有重要作用。 锰缺乏时，细胞内NH4 浓度高，Aa浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过NH4升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。,氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。,柠檬酸的积累机制归纳：,Mn,抑制蛋白合成,NH4,解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径的畅通,有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链, 由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。,2+,缺乏,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 使柠檬酸有一定积累，pH值逐渐降低，顺乌头酸酶及异柠檬酸脱氢酶活力降低甚至失活，更有利于柠檬酸的积累。,一、概述 1氨基酸的生产概况 生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的迪高沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在全球很多国家建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 川化味之素 中国目前的情况：谷氨酸、赖氨酸、其他氨基酸。 河南莲花味精、山东菱花味精、江苏菊花味精、广东奥桑味精、沈阳红梅味精,第三节 氨基酸(Amino acid)发酵生产,河南省莲花味精股份有限公司,广东肇庆星湖生物科技股份有限公司,2氨基酸的生产方法 （1）抽提法（蛋白质水解法）: 将动物蛋白质原料用酸水解，经离子交换法处理，将所需氨基酸分离提取。 （2）化学合成法：采用化工原料合成生产氨基酸的方法。 （3）发酵法：利用微生物发酵生产L-氨基酸的方法。 （4）酶法：利用从菌体中提取的酶将有机物转变成所需要的L-氨基酸的方法。 （5）添加前体法：利用微生物发酵氨基酸的前体物质生产氨基酸的方法。,3氨基酸的用途 饲料用氨基酸 食品用氨基酸 生物降解材料 化妆品领域 医用氨基酸 二、谷氨酸发酵机制 谷氨酸化学名称为-氨基戊二酸，结构式为：,（一）、谷氨酸生物合成途径及调节机制,（二）、细胞膜的通透性与谷氨酸的积累 谷氨酸从菌体内向外排出的控制因子主要有生物素、油酸、表面活性剂等。 生物素作为一种生长因子，是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成。当生物素不足时，则不利于不饱和脂肪酸的合成，从而造成细胞膜成分磷脂的不足，使细胞膜结构组成不完全，因而增加了细胞膜的通透性，有利于谷氨酸渗出膜外。因此利用生物素缺陷型，限量供给生物素（亚适量）时，细胞膜对谷氨酸有良好的通透性。 生物素丰富时，添加表面活性剂、高级脂肪酸可抑制不饱和脂肪酸的合成，造成细胞膜透性的增加。另外添加青霉素也可使细胞膜在失去细胞壁保护后发生损伤而造成通透。,小结：从菌的生理特征上，谷氨酸产生菌应具备的条件： 生物素缺陷型，细胞膜对谷氨酸的通透性好 CO2固定酶活性强，丙酮酸脱羧酶活性不能太强 -酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺损 谷氨酸脱氢酶活力高（此活性不被低浓度产物谷氨酸所抑制） NADPH+H+进入呼吸链能力弱 异柠檬酸裂解酶活性不能太强，异柠檬酸脱氢酶活性强,谷氨酸发酵研究新进展,继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子计算机控制发酵条件。,天冬氨酸族氨基酸生物合成途径,1：天冬氨酸激酶； 2：高丝氨酸脱氢酶 3：二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶； 4：高丝氨酸激酶； 5：-琥珀酰-高丝氨酸转琥珀酰酶； 6：半胱氨酸脱硫化氢酶； 7：苏氨酸脱氢酶； 8：天冬氨酸半醛脱氢酶； 9：二氢吡啶-2，6-二羧酸还原酶,赖氨酸发酵机制,赖氨酸发酵菌种的选育,如再选育丙氨酸缺陷型，抗天冬氨酸结构类似物突变株，谷氨酸敏感等突变株，增加前体物的生物合成，选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物突变株，解除代谢互锁（DDP合成酶的合成受亮氨酸的阻遏，DDP还原酶受半光氨酸和丙氨酸的抑制），赖氨酸的产量还会增加。,苏氨酸发酵菌种的选育,氨基酸发酵代谢控制所采取措施,1、控制发酵的环境条件 2、控制细胞渗透性 3、控制旁路代谢 4、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 5、促进ATP的积累，以利于氨基酸的生物合 成 （氨基酸的生物合成需要能量，ATP的积累可促进氨基酸的生物合成 ）,谷氨酸产生菌因环境条件 改变引起的发酵转换,谷氨酸发酵（专性需氧菌）必须严格控制菌体生长的环境条件，否则就几乎不积累谷氨酸,第四节 菌种改造的策略及措施,高产菌种的代谢特点： 1表示胞内代谢网络中通向目的产物的途径畅通 2该途径与环境的“接口”宽畅 策略：进、通、节、堵、出 进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收。,通：解除对途径中某些酶的反馈调节，或者诱导或激活这些酶，从而使来自各个分支的碳架物质能畅通地流向目的产物。,节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。,堵：消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。 出：促进目的产物向胞外空间分泌。,