木瓜蛋白酶活力测定方法

木瓜蛋白酶活力测定方法分别精细量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40C水浴中保温0分钟，各精细参加供试品溶液2ml，摇匀，置40C水浴中，开场记时，准确反响1小时，立即精细参加三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40C水浴中放置040分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精细量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40C水浴中保温小时，精细参加三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精细参加供试品溶液2ml，置40C水浴中放置3040分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法中国药典2000年版二部附录IVA，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价单位/mg=A/As*Cs*12/2*稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g,加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.00.1并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml临用新配。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g,加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g,振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.50.1,用水稀释全00ml,混匀临用新配三氯醋酸溶液：取三氯醋酸17.99g,加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。酶活力测定对照品溶液的制备：精细称取已105C枯燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备：取本品适量约相当于木瓜酶活力120万单位，精细称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200300单位的溶液，摇匀。、目的淀粉是葡萄糖以a1,4糖苷键及a-1,6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的根本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进展代谢的初级反响。据，也是生物体利用淀粉进展代谢的初级反响。小麦成熟期如遇阴雨天气,有的品种会发生淀粉酶的活性测严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。因此,定，具有理论和应用研究的意义。通过本实验，学习酶活测定的一般方法，稳固并熟练分光光度计的使用。、原理淀粉酶主要包括a淀粉酶、B-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是a淀粉酶和3-淀粉酶。a淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链局部a1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、a-极限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使a-淀粉酶活化和稳定，它比拟耐热但不耐酸，pH3.6以下可使其钝化。3淀粉酶从非复原端作用于a-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的a1,6键时停顿。单独作用时产物为麦芽糖和3极限糊精。3-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl等辅助因子，最适pH偏酸，与a淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70C保5Bin可使其钝化。通常提取液中a淀粉酶和3淀粉酶同时存在。可以先测定a+B淀粉酶总活力，然后在70C加热15min，钝化3淀粉酶，测出a淀粉酶活力，用总活力减去a淀粉酶活力，就可求出3-淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的复原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反响来测定。复原糖作用于黄色的3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与复原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的复原糖麦芽糖量表示酶活大小。三、仪器、试剂和材料1. 仪器1电子顶载天平2研钵3容量瓶100mL2个4具塞刻度试管25Ml15支5试管8支6吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支7离心机8离心管9恒温水浴锅10分光光度计2. 试剂11%淀粉溶液20.4mol/L氢氧化钠3pH5.6柠檬酸缓冲液称取柠檬酸20.01g,溶解后定容至1000mL,为A液。称取柠檬酸钠29.41g,溶解后定容至1000mL，为B液。取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为pH5.6之缓冲液。43,5-二硝基水杨酸准确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L氢氧化钠中，参加50mL蒸馏水，再参加30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100MI，盖紧瓶塞，防止CO2进入。5麦芽糖标准液1mg/ml丨称取O.IOOg麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。3. 材料萌发3天的小麦芽。四、操作步骤1. 酶液提取称取2g萌发3天的小麦种子芽长1cm左右，置研钵中加少量石英砂和2m1左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1,每隔数分钟振荡1次，提取20min。3000r/min离心lOmin，转出上清液备用。2. a淀粉酶活力测定1取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。2于每管中各加酶液Iml，在70C士0.5C恒温水浴中准确加热15min,钝化3-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。3在对照管中参加4m10.4mol/L氢氧化钠。4在4支试管中各参加1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液。5将4支试管置另一个40C士0.5C恒温水浴中保温15min,再向各管分别参加40C下预热的1%淀粉溶液2m1,摇匀，立即放入40C恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速参加4ml0.4mol/L氢氧化钠,终止酶活动,准备测糖。3. 淀粉酶总活力测定取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1,为稀释酶液。另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后参加稀释之酶液Iml。在对照管中参加4m10.4mol氢氧化钠。4支试管中各加1mlpH5.6之柠檬酸缓冲液。以下步骤重复a淀粉酶测定第5步的操作，同样准备测糖。4. 麦芽糖的测定1标准曲线的制作取25ml刻度试管7支,编号。分别参加麦芽糖标准液lmg/ml0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0m,l然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达2.0ml，再各加3,5一二硝基水杨酸试剂2.0m1,置沸水浴中加热5min。取出冷却，用蒸馏水稀释至25m1。混匀后用分光光度计在520nm波长下进展比色，记录吸光度。以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量mg为横坐标，绘制标准曲线。2样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml具塞刻度试管中,各参加2m13,5-二硝基水杨酸试剂。以下操作同标准曲线制作。根据样品比色吸光度,从标准曲线查出麦芽糖含量,最后进展结果计算。AA0xVT五、结果处理式中A为a淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖mg;Ao为a旋粉酶的对照管中麦芽糖量mg；B为a十B淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖mg；Bo为a十B淀粉酶的对照管中麦芽糖mg；VT为样品稀释总体积ml；VU为比色时所用样品液体积ml；W为样品重g。六、考前须知1酶反响时间应准确计算。2试剂参加按规定顺序进展。七、思考题1.淀粉酶活性测定原理是什么？2酶反响中为什么加pH5.6的柠檬酸缓冲液？为什么在40C进展保温？3.测定酶活力,应注意什么问题？