谷氨酸发酵工艺流程

目录一、谷氨酸简介.2二、谷氨酸发酵的工艺流程32.1谷氨酸生产菌种42.2生产原料42.3培养基制备42.3.1碳源.42.3.2氮源.52.3.3生物素.52.4培养基.52.5菌种的保藏62.6灭菌的方法.82.7菌种如何选育.82.8种子的扩大培养.82.9谷氨酸的发酵.83.0谷氨酸的分离.9三、谷氨酸发酵的工艺控制93.1环境控制93.1.1pH .93.1.2温度.93.1.3通风量.93.1.4泡沫.9 3.1.5染菌的防治和染菌后的处理方法.93.2.细胞膜渗透性控制.103.3提取工艺的进展.103.4鉴别.123.5发酵终点的判断.12四、小结12五、参考文献.12 谷氨酸发酵工艺 秦岭内蒙古工业大学 化工学院 08级 生物工程2班 摘要：众所周知，日常所用调味料味精就是L一谷氨酸单钠盐(monosodiuo gluamate，MsG)。自1909年日本发明并工业化生产味情以来，几经变迁，已发展成为以谷氨酸发酵为主体的世界性氨基酸发酵工业。1956年从日本开始，以后先后由面二筋豆粕和废糖蜜浓缩物水解的方向，转向以糖质为原料的细菌发酵法。生产味精谷氨酸之类氨基酸的发酵，区别于传统的酿酒和抗菌素发游，是一种改变微生物代谢的代谢控制发酵。本文则就谷氨酸发酵生产过程、谷氨酸发酵机制和研究动向等方面，说明谷氨酸发酵的发展。1关键词：谷氨酸；发酵；工艺；研究；发展一、谷氨酸简介谷氨酸一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，化学名称为-氨基戊二酸。为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。分子式C5H9NO4、分子量147.13076。 谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。谷氨酸可生产许多重要下游产品如L谷氨酸钠、L苏氨酸、聚谷氨酸等。氨基酸作为人体生长的重要营养物质，不仅具有特殊的生理作用，而且在食品工业中具有独特的功能。谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。谷氨酸为世界上氨基酸产量最大的品种，作为营养药物可用于皮肤和毛发。用于生发剂，能被头皮吸收，预防脱发并使头发新生，对毛乳头、毛母细胞有营养功能，并能扩张血管，增强血液循环，有生发防脱发功效。用于皮肤，对治疗皱纹有疗效。脑组织只能氧化谷氨酸，而不能氧化其它氨基酸，故谷酰胺可作为脑组织的能量物质，改进维持大脑机能。谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑震荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效。在工业上，聚谷氨酸可降解塑料，是环境友好材料。2谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵。谷氨酸的大量积累不是由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及发酵条件的适合。 谷氨酸产生菌主要是棒状类细菌，这类细菌中含质粒较少，而且大多数是隐蔽性质粒，难以直接作为克隆载体，而且此类菌的遗传背景、质粒稳定尚不清楚，在此类细菌这种构建合适的载体困难较多。需要对它们进行改建将棒状类细菌质粒与已知的质粒进行重组，构建成杂合质粒。受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株，特别是选用谷氨酸缺陷型变异株为受体，便于从转化后的杂交克隆中筛选产谷氨酸的个体，用谷氨酸产量高的野生菌或变异菌作为受体效果更好。供体菌株选择短杆菌及棒杆菌属的野生菌或变异株，只要具有产谷氨酸能力都可选用, 但选择谷氨酸产量高的菌株作为供体效果最好。这样就可以较容易地在棒状类细菌中开展各项分子生物学研究。有了合适的载体及其转化系统后，就可通过DNA体外重组技术进行谷氨酸产生菌的改造。这对以后谷氨酸发酵的低成本、大规模、高质量有较大的发展空间。3二、谷氨酸发酵的工艺流程菌种的选育，培养基配制，斜面培养，一级种子培养，二级种子培养，发酵（发酵过程参数控制通风量、pH、温度、泡沫），发酵液。（谷氨酸产生途径见图表1、流程见图表2）图表1谷氨酸的代谢通路、关键酶、调控机制 图表 2谷氨酸发酵工艺流程2.1谷氨酸生产菌种棒状杆菌属 谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)：生物素缺陷型、温度敏感型；北京棒杆菌、钝齿棒杆菌；短杆菌属：黄色短杆菌、天津短杆菌。在已报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，它们都有一些共同特点：革兰氏阳性，菌体为球形、短杆至棒状，不形成芽孢，没有鞭毛，不能运动，需要生物素作为生长因子，在通气条件下才能产生谷氨酸。2.2生产原料玉米、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉最为常用，大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌-淀粉酶进行液化，8530min，加糖化酶60糖化24h，过滤后可供配置培养基。甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。糖蜜原料因含丰富的生物素，不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源。预处理方法为，活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以再发酵液中加入表面活性剂或添加青霉素。2.3.培养基制备谷氨酸发酵培养基组成包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等。2.3.1碳源目前使用的谷氨酸生产菌均不能利用淀粉，只能利用葡萄糖、果糖等，有些菌种还能利用醋酸、正烷烃等做碳源。 在一定的范围内，谷氨酸产量随葡萄糖浓度的增加而增加，但若葡萄糖浓度过高，由于渗透压过大，则对菌体的生长很不利，谷氨酸对糖的转化率降低。 国内谷氨酸发酵糖浓度为 125-150g/L，但一般采用流加糖工艺。2.3.2氮源常见无机氮源：尿素，液氨，碳酸氢铵。常见有机碳源：玉米浆，豆浓，糖蜜。当氮源的浓度过低时会使菌体细胞营养过度贫乏形成“生理饥饿”，影响菌体增殖和代谢，导致产酸率低。随着玉米浆的浓度增高，菌体大量增殖使谷氨酸非积累型细胞增多，同时又因生物素过量使代谢合成磷脂增多，导致细胞膜增厚不利于谷氨酸的分泌造成谷氨酸产量下降。 碳氮比一般控制在100:1530。2.3.3生物素含硫水溶性维生素，是B族维生素的一种，又叫做维生素H或辅酶R。广布于动物及植物组织，已从肝提取物和蛋黄中分离，是多种羧化酶辅基的成分。生物素的作用主要影响谷氨酸生产菌细胞膜的通透性，同时也影响菌体的代谢途径。生物素对发酵的影响是全面的，在发酵过程中要严格控制其浓度。（具体可看控制膜渗透性） 2.4培养基 2.4.1.1保藏斜面培养基：牛肉膏l，蛋白胨l，氯化钠0.5，琼脂2，pH7.0。 2.4.1.2活化斜面培养基：葡萄糖0.1，牛肉膏l，蛋白胨l，氯化钠0.5，琼脂2，pH7.0。 2.4.1.3一级种子培养基：葡萄糖2.5，玉米浆3.1；，尿素0.55，磷酸氢二钾012，硫酸镁0.06，pH7.0。 2.4.1.4摇瓶初筛发酵培养基：葡萄糖12，玉米浆0.8，磷酸二氢钾0.2，硫酸镁O.04，pH7.0。2.4.1.5摇瓶复筛发酵培养基：葡萄糖18，玉米浆0.5，甘蔗糖蜜0.15，磷酸二氢钾0.2，硫酸镁0.04pH7.0。2.4.2培养方法2.4.2.1斜面菌种：3233培养，22h。2.4.2.2一级种子：3233培养，往复式摇床，冲程76mm，转速100rmin，9h。2.4.2.3摇瓶发酵：往复式摇床，冲程80mm。装量：20ml500ml三角瓶。接种量：5。转速：前期100rmin，第一次加尿后125rJmin。温度：前期3233，后期34350C。转速：前期100rmin，后期125dmin。pH：40尿素控制。2.4.2.4分析方法及分析仪器谷氨酸：YSI一2700生物传感器。2.4.3.1谷氨酸菌种的分离挑一环生产斜面到装有生理盐水，、小玻璃珠三角瓶中，振荡摇匀，稀释，10。510。6涂平板_挑选30个单菌落移接到生产斜面上(每个菌落接2支斜面)培养48h_其中30支斜面存人超低温冰箱保存，另外相同顺序编号的30支斜面则进行摇瓶产酸试验。2.4.3.2初筛每株两瓶分三批进行初筛。发酵周期24h。放瓶后，测定谷氨酸含量。从中选出产酸较高的6株。2.4.3.3复筛经初筛选出6株，继续进行摇瓶复筛试验。发酵周期46h，以生产菌作为对照，共进行了3次对比实验。并选出产酸最高的两株。2.5菌种的保藏 现在微生物广泛应用于工农业生产、医药卫生及国防事业，但微生物的世代时期一般是很短的，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此常常造成工业生产菌种的退化，并有可能使优良菌种丢失。所以。 2.5.1如何保持菌种优良性状的稳定是研究菌种保藏的重要课题。 2.5.1.1菌种保藏的重要意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行生产。所以菌种保藏是入行微生物研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不死亡。 同时还要尽可能设法把菌种的优良性状保持下来而不致向坏的方面转化。研究菌种保藏就是要采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。 2.5.1.2菌种保藏的原理和方法 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点。 2.5.2人工创造条件。 使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。 菌种的保藏方法很多一般有一面几种： 2.5.2.1斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一种短期、过度的保藏方法。 用新鲜斜面接种后在最适条件下培养得到菌体或孢子生长丰满后，放在4度冰箱保存。一般存期为三到六个月。 2.5.2.2沙土管保藏法 适合于产孢子或芽孢的微生物。先将沙与土洗净烘干过筛后。 将沙与土按（12）：1混合均匀。 分装于小试管中，装料高度大约为1cm左右。 121度间歇灭菌3次，灭菌实验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛，土用80100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土中或将斜面豹子刮下直接与沙土混合置干燥器中用真空泵抽干,放在冰箱内保存.一般保存期为1年左右. 2.5.2.3菌丝速冻法 对于不产孢子或芽孢的微生物，一般不用沙土管保藏。为了方便，可以采用甘油菌丝速冻法。由于该法的保藏温度为-20，为了避免微生物受损伤致死。 需要甘油作为保护剂。先配置浓度为50%的甘油溶液。 121灭菌；再制备浓度为108 810 个/mL的菌悬液；最后将菌悬液和甘油溶液以等体积混合均匀后，置于-20保藏。 2.5.2.4石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上倒渗入渗出一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。 2.5.2.5真空意气消沉冻干燥保存法 真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下（-18），快速的将细胞冻结，并且保持细胞完整。 然后在真空中使水分生华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保藏很长时间，一般五年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格。 但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用，所以国内外都普遍适用。 2.5.2.6液氮超低温保藏法 此法是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是不产孢子的菌丝体用其他保存方法不当可用此法保存效果较好保存期最长。用液氮能长期保存菌种，这是因为液氮的温度可达-196，远遥低于其新陈代谢温度（-130），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。液氮超低温保藏法简便易行，关键是要有液氮灌、冰箱设备。该法要点是：将要保藏的菌种置于10%甘油中，密封与安剖内，先将菌液降至0，再以每分钟降低1的速度，一直将至-35，然后将安剖放入液氮罐中保存。 2.5.2.7保藏法 适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原体和病毒。2.6灭菌的方法2.6.1化学法 化学药品灭菌法 2.6.2物理法 干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 2.7菌种如何选育 根据微生物遗传变异的特点，人们在生产实践中已总结了一套行之有效的方法。主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体的融合、基因工程等。2.8种子扩大培养 斜面培养，谷氨酸生产菌适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子，32培养18-24h。一级种子在摇瓶机上振荡培养，培养基1000ml装200-250ml振荡，32，培养12h。二级种子用种子罐培养，料液量为发酵罐投料体积的1%，用水解糖代替葡萄糖于32进行通气搅拌7-10h。二级种子培养过程中，pH的变化有一定规律，从pH6.8上升到pH8左右，然后逐步下降。二级种子培养结束时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字排列，活菌数为108-109/ml，活力旺盛处于对数生长期。各条件均逐步接近发酵条件（培养基成分见培养基配制）。2.9谷氨酸发酵在发酵罐中进行。适应期，尿素分解氨使pH上升。糖不利用。2-4h。接种量和发酵条件控制使改期缩短。对数生长期，糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形，不产酸，12h。采取流加尿素办法及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH在7.5-8.0，维持温度30-32。菌体生长停止期，谷氨酸合成，糖和尿素分解产生-酮戊二酸和氨用于合成谷氨酸。及时流加尿素以提供足够的氨并使pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37。 发酵后期，菌体衰老糖耗慢，残糖低。营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 不同的谷氨酸生产菌其发酵时间有所差异。低糖（10%12%）发酵，其发酵时间为3638h，中糖（14%）发酵，其发酵时间为45h。发酵后期菌体衰老，糖耗慢，残糖低。当营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。一般发酵周期为30h。43.0谷氨酸分离 从发酵液中提取谷氨酸的方法，一般有等电点法、离子交换法、金属盐沉淀法、盐酸盐法和电渗析法。三、谷氨酸发酵的工艺控制 谷氨酸生产菌是营养缺陷型，对生长繁殖、代谢产物的影响非常明显。3.1环境控制3.1.1pH谷氨酸生产菌的最适pH一般是中型或微碱性pH7.08.0条件下累计谷氨酸，发酵前期的pH值以7.5左右为宜，中后期以7.2左右对提高谷氨酸产量有利。3.1.2温度谷氨酸发酵前期应采取菌体生长最适温度为3032。对数生长期维持温度30-32。谷氨酸合成的最适温度为3437。催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在32-36C左右，在发酵中、后期需要维持最适的产酸温度，以利谷氨酸合成。3.1.3通风量谷氨酸生产菌是兼性好氧菌，有氧、无氧的条件下都能生长，只是代谢产物不同。谷氨酸发酵过程中，通风必须适度，过大菌体生长慢，过小产物由谷氨酸变为乳酸。应在长菌期间低风量，产酸期间高风量，发酵成熟期低风量。其中，谷氨酸发酵罐现均采用气一液分散较理想的圆盘涡轮式多层叶轮搅拌器。3.1.4泡沫谷氨酸发酵时好气性发酵，因通风和搅拌和菌体代谢产生的CO2，使培养液产生泡沫是正常的，但泡沫过多不仅使氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸代谢，也会影响正常代谢以及染菌。因此，要控制好泡沫是关键。消泡方法有机械消泡（靶式、离心式、刮板式、蝶式消泡器）和化学消泡（天然油脂、聚酯类、醇类、硅酮等化学消泡剂）两种方法。3.1.5染菌的防治和染菌后的处理方法谷氨酸生产菌对杂菌及噬菌体的抵抗力差。一旦染菌，就会造成减产或无产现象的发生，预示着谷氨酸发酵生产的失败，这使厂家造成不同程度的损失。所以预防及挽救很重要的。常见杂菌有芽孢杆菌、阴性杆菌、葡萄球菌和霉菌。针对芽孢杆菌，打料时，检查板式换热器和维持管压力是否高出正常水平。如果堵塞，容易造成灭菌不透。板式换热器要及时清洗或拆换。维持罐要打开检查管路是否有泄漏或短路。阀门和法兰是否损坏。针对阴性杆菌，对照放罐体积，看是否异常。如果高于正常体积，可能是排灌泄漏，对接触冷却水的管路和阀门等处进行检查。针对葡萄球菌，流加糖罐和空气过滤器要进行无菌检查，如果染菌要统一杀菌处理。针对霉菌，加大对环境消毒力度，对环境死角进行清理。5 噬菌体不耐高温，一般升温至8O噬菌体就会死亡。在发酵2h-10h污染噬菌体，判断正确后，把发酵液加热至45C10min把谷氨酸菌杀灭。6在发酵10h14h污染噬菌体，仍是把发酵加热至4510min，压出发酵罐，进行分罐处理，一般可分成两罐来处理。发酵18h后出现OD下跌，此时残糖在3左右，出现耗糖缓慢或停止。镜检没有发现菌体碎片，可能是溶源菌或发酵前期出现高温现象，造成菌体自溶。处理方法补入4u-5u单位纯生物素，压入相对同期的发酵液10的量，继续发酵。发酵结果比同期发酵结果略差。73.2细胞膜渗透性控制3.2.1控制磷脂的合成细胞膜磷脂含量低，有利于提高细胞膜通透性。 油酸缺陷型：油酸缺陷型突变株阻断了油酸的合成，丧失了脂肪酸生物合成的能力。甘油缺陷型 ：甘油缺陷型菌株的遗传阻碍是丧失-磷酸甘油脱氢酶，自身不能合成-磷酸甘油和磷脂。温度敏感突变株：其突变位置发生在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导释出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。3.2.2控制细胞壁的合成细胞壁合成不完全，细胞膜容易造成机械损伤和经不起内部渗透压的压力，造成膜的破坏，加大通透性。对数生长期早期，添加青霉素或头孢霉素C。青霉素抑制细胞壁的后期合成。3.3提取工艺的进展 谷氨酸提取的基本方法有：等电点结晶法，特殊沉淀法，离子交换法，溶剂萃取法，液膜萃取法。 味精公司的提取技术是先用高速离心法从发酵液中分离出菌体，再浓缩3倍后加硫酸调pH使谷氨酸结晶，提取收率约90。 目前国内从发酵液中提取L-谷氨酸普遍采用的步骤是先用等电点法结晶大量L-谷氨酸，母液采用732阳离子交换树脂浓缩其中的L-谷氨酸，洗脱得到的谷氨酸溶液，再回到等电罐进行结晶回收提取收率约90-95。 这种工艺存在着下列的缺陷：在结晶和离子交换过程中要使用大量的硫酸调节发酵液和母液的pH，造成环境污染；在低温下交换，高温下洗脱，使树脂反复的溶胀收缩，使用寿命缩短；等电点废液中存在大量NH4+离子，用氢型树脂进行交换时，NH4+离子可与L-谷氨酸离子进行竞争，使L-谷氨酸的收率降低。 谷氨酸钠现行生产工艺：可以看出现在味精生产均采用先从谷氨酸铵发酵液分离谷氨酸半成品，用NaOH或Na2CO3进行中和转化为谷氨酸一钠，经脱色、浓缩、精制而成味精的基本工艺。因此在提取工艺中，需要完成：谷氨酸铵谷氨酸谷氨酸一钠的产品转化过程。而此转化过程需要消耗大量的酸碱，产生大量环境污染，提高生产成本。 生产工艺直接等电点方法（少数锌盐法）等电离交方法浓缩连续等电点法（少数厂家采用）。等电点法还能分成常温、中低温、一次低温（盐酸、硫酸），带菌体浓液一次等电点法。 分离方式：间歇三足式离心机连续锥兰式分离机、沉降式分离机、带式滤过机。水解等电法：谷氨酸发酵液经适当浓缩后，加入盐酸进行加压水解，此时菌体蛋白质被水解，而发酵液中残糖等有机杂质遭破坏可过滤出去，滤液在经脱色和浓缩后，用碱液中和至谷氨酸的等电点，在低温下放置，让谷氨酸结晶析出。此法的有点在于菌体蛋白质中谷氨酸得到了利用，并且发酵液中的谷氨酰胺和焦谷氨酸都变成了谷氨酸，所以谷氨酸提取收率比较高，但是工艺复杂。流程如下：发酵液-浓缩-用盐酸水解-过滤-滤液脱色-浓缩-用碱液中和浓缩液，控制PH值-低温放置，析出晶体。低温等电点法：当溶液的PH值等于谷氨酸等电点时，谷氨酸的溶解度最小。例如，30，溶解度为1.06，5，溶解度小于0.41，因此可以采用低温等电点法，将谷氨酸从发酵液中提取结晶。流程如下：发酵液边冷却边用盐酸调节pH值-pH值4.04.5发酵液-加晶种-25育晶2h-边冷却便调节pH值-pH3.03.2发酵液-搅拌16h-4静置4h-谷氨酸晶体。低温连续等电点法：目前我国味精生产厂多数采用一次低温等电点法，对于谷氨酸含量6.5%8.0%的发酵液其提取收率为75%80%。优点是析出晶体颗粒粗易分离，大小均匀，光泽度好适用于不正常发酵液谷氨酸的提取。具体操作如下：发酵液在等电点罐中采用低温等电点法结晶，待析晶完全后以晶体及母液作为种子，维持一定的温度和pH值，然后一边连续添加新发酵液一边放料，进出料量保持一致，放出的物料在育晶罐中让晶体长大，育晶结束以后进行分离得到谷氨酸晶体。3.4鉴别通过革兰氏染色法可鉴别3.5发酵终点的判断确定放罐的指标有：产物的产量、过滤速度、氨基氮的含量、菌丝形态、pH值、发酵液的外观和粘度等。发酵终点的掌握，就要综合考虑这些参数来确定。四、小结谷氨酸发酵是一个复杂的过程，当前对其发酵过程的控制还需要不断深入，如高产菌种的选育、微生物代谢过程的本质、产物积累、发酵过程动力学模型的建立及应用等还需进一步探讨。影响谷氨酸发酵的因素很多，随着生物技术、计算机自控技术的提升，相信谷氨酸发酵控制技术也会得到不断提升。针对氨基酸行业发酵生产现状，应采用代谢工程等方法，优化生产菌种和发酵工艺，使得菌种发酵的综合技术不断提高，对谷氨酸产业提高国际竞争力具有十分重要的现实意义。五、参考文献：1 王选良.谷氨酸发酵J.中国酿造.1986(05):12-202 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